PLOS ONE: Överuttryck av Eukaryotic Översättning Initiation Factor 5A2 (EIF5A2) korrelerar med cell aggressivitet och dålig överlevnad i Gastric Cancer

Abstrakt

Eukaryotic translationsinitiering faktor 5A2 (EIF5A2) spelar en viktig roll i tumörprogression och prognos utvärdering. Emellertid finns tillgänglig om dess potentiella roll i magcancer lite information. Denna studie syftade till att undersöka funktionen hos EIF5A2 i tumörprogression och dess potentiella mekanismer. EIF5A2 expression uppmättes i humana gastriska cancercellinjer, den immortaliserade gastrointestinala epitelcellinje (GES-1) och humana gastriska cancervävnader och nedslagen av RNA-interferens eller uppregleras av EIF5A2 plasmidtransfektion. Cellproliferation, migration och invasion bedömdes In vitro
. De efterföljande målen för EIF5A2 undersöktes genom western blotting. EIF5A2 och dess potentiellt mål metastas-associerat protein 1 (MTA1) uttryck undersöktes i 160 par av human magcancer och angränsande icke-tumörprover med hjälp av immunohistokemi (IHC) infärgning och dess korrelation med kliniskt patologiska egenskaper och överlevnad undersöktes. Knockdown av EIF5A2
eller MTA1
orsakade en uppenbar hämning av HGC27 celltillväxt, migration och invasion. Efter knockdown av EIF5A2
i HGC27 celler, E-cadherin nivåer uppreglerade och vimentin, cyklin D1, cyklin D3, C-MYC och MTA1 nivåer nedregleras. Uppreglering av EIF5A2 i MKN45 celler resulterade i det omvända. IHC Resultaten visade en positiv korrelation mellan EIF5A2 och MTA1 uttryck i magcancer ( P Hotel < 0,001). Både EIF5A2 och MTA1 uttryck var korrelerade med pT stadium ( P
= 0,018 och P
= 0,042), pN steg ( P
= 0,037 och P
= 0,020) och lymphovascular invasion ( P
= 0,016 och P
= 0,044). EIF5A2 eller MTA1 uttryck var signifikant associerad med dålig överlevnad och sjukdomsfri överlevnad (alla P Hotel < 0,05). Multivariat analyser identifierade EIF5A2 som en oberoende prediktor för både total överlevnad ( P
= 0,012) och sjukdomsfri överlevnad ( P
= 0,008) i gastric cancerpatienter. Våra resultat tyder på att EIF5A2 uppreglering spelar en viktig onkogen roll i magcancer. EIF5A2 kan representera en ny prediktor för dålig överlevnad och är ett potentiellt terapeutiskt mål för magcancer

Citation:. Meng Q-B, Kang W-M, Yu J-C, Liu Y-Q, Ma Z-Q, Zhou L, et al. (2015) Överuttryck av eukaryota Översättning Initiation Factor 5A2 (EIF5A2) korrelerar med cell aggressivitet och dålig överlevnad i magcancer. PLoS ONE 10 (3): e0119229. doi: 10.1371 /journal.pone.0119229

Academic Redaktör: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, KINA

Mottagna: 22 januari 2014. Accepteras: 29 januari 2015, Publicerad: 20 mars 2015

Copyright: © 2015 Meng et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering: Detta arbete stöddes med bidrag från Pekings kommunala Natural Science Foundation (nr 7.132.209), Hubei-provinsen hälsa och familjeplanering vetenskaplig forskningsprojekt (nr WJ2015MB137) och viktiga vetenskapliga och tekniska projekt i Peking (nr D141100000414004). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Magcancer (GC) är en mycket metastatisk sjukdom och en av de mest dödliga av de gastrointestinala maligniteter. [1] Trots framsteg inom kirurgiska och cytotoxiska terapier för GC, de aktuella behandlingar som finns tillgängliga för patienter med avancerad GC är mycket begränsad. [2, 3] att utveckla nya behandlingsstrategier, är det viktigt att klarlägga de molekylära mekanismer som främjar invasiva och metastatiska egenskaper hos GC-celler.

Eukaryotic translationsinitiering faktor 5A2 (EIF5A2) ligger på human kromosom 3q26.2, och är medlem i EIF5A
genfamiljen. [4] uttryck~~POS=HEADCOMP av EIF5A2
mRNA i vissa humana cancerceller, i motsats till överuttryck begränsade till humant testikel och delar av hjärnan, föreslår EIF5A2
är en potentiell onkogen. [4] Tidigare studier har visat att EIF5A2 överuttrycktes i många humana cancerformer, såsom pankreas duktal adenokarcinom, äggstockscancer, hepatocellulär cancer, lungcancer, kolorektal cancer och melanom och var korrelerad till dålig överlevnad av cancerpatienter och /eller cancercell aggressivitet. [5-11] Nyliga studier har visat att EIF5A2 har cancerogena förmågor genom dess aktivering av EIF5A2-MTA1 /C-MYC-axeln. [8] emellertid lite information finns tillgänglig om EIF5A2 proteinuttryck, sin prognostisk betydelse och potential onkogen roll i människans GC.

Därför undersökte vi först ett uttryck för EIF5A2
i humana GC cellinjer och dess potentiella roll i celltillväxt, migration och invasion. Därefter identifierade vi möjliga nedströms målproteiner för att belysa effekterna av EIF5A2 utarmning eller uppreglering på de cellulära funktionerna hos GC-celler. Slutligen analyserade vi korrelationen mellan EIF5A2 och MTA1 uttryck i mänsklig GC och dess relevans för kliniskt patologiska faktorer och överlevnad i GC patienter.

Material och metoder

Etik Statement

studien godkändes av den etiska kommittén i PUMCH, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, Beijing, Kina, och skriftligt informerat samtycke erhölls från varje patient.

Patienter och prover

GC vävnad och matchade angränsande icke-tumörvävnadsprover erhölls från 160 konsekutiva patienter som genomgick kirurgisk resektion för primär GC på Peking Union Medical College Hospital (PUMCH) mellan januari 2002 och december 2006. Inga patienter fick neoadjuvant kemoterapi eller strålbehandling. De överlevnadsdata erhölls baserat på både patientjournaler och telefonuppföljning. Median uppföljningstid var 53 månader (intervall, 1-113 månader). Ytterligare två par av färska GC vävnader och noncancerous magslemhinnan vävnader erhölls från patienter som genomgick kirurgisk resektion för dåligt differentierad adenokarcinom i magen vid PUMCH 2014.

Vi definierade lymphovascular invasion som närvaron av tumörcell emboli inom utrymmen omgiven av en tydligt visualiseras endotelbeklädnaden i periferin av tumörsnitt. [12, 13] Patienterna iscensatt enligt den 7: e upplagan av AJCC TNM klassificeringen för karcinom i magen. [14] Lauren histotype uppdelades i intestinal och diffuse- blandad typ kategorier. [15]

Cellodling

Fem typer av GC cellinjer mänskliga erhölls från Cell Center of Shanghai institut för Biological Sciences (AGS och MGC803, Shanghai, Kina) och Cell Center för Institutet för grundläggande medicinska vetenskaper (MKN45, SGC7901 och HGC27, Beijing, Kina). Den odödliggjorda gastrointestinala epitelceller linje GES-1 erhölls från Peking ComWin Biotech Co, Ltd (Beijing, Kina). Alla celler odlades i RPMI 1640-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) vid 37 ° C i en fuktad luftatmosfär innehållande 5% CO _{2. Celler i logaritmisk tillväxtfas användes för ytterligare experiment.}

Knockdown EIF5A2 eller MTA1 av små störande RNA (siRNA) katalog

siRNA specifikt mot EIF5A2 och MTA1 [16] och deras icke-inriktning kontroll siRNA (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) syntetiserades kemiskt för denna studie. De EIF5A2 siRNA-sekvenser var enligt följande:
: 5'-GGAUCUUAAACUGCCAGAATT-3 ', 5'-UUCUGGCAGUUUAAGAUCCTT-3';: 5'-GGUUCACCUUGUUGGAAUUTT-3 ', 5'-AAUUCCAACAAGGUGAACCTT-3; och: 5'-GCUUCCAGCACUUACCCUATT-3 ', 5'-UAGGGUAAGUGCUGGAAGCTT-3; den icke-målsökande kontroll (NC1) siRNA: 5'-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3 '; 5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3 '). De MTA1 siRNA sekvenserna (Target 2 siRNA, T2-siRNA) var: 5'-GCUGAGAGCAAGUUAAAGCdTdT-3 ', 5'-GCUUUAACUUGCUCUCAGCdTdT-3') och FAM-märkt siRNA (AM4620) användes som en icke-inriktning kontroll siRNA (NC2 ).

Tjugofyra timmar efter utstrykning i sex-brunnars plattor, var GC-celler transfekterades med 100 pmol EIF5A2-siRNA, MTA1-siRNA eller kontroll siRNA med användning av Lipofectamine 2000 transfektionsreagens (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA ) i enlighet med tillverkarens instruktioner. Cellerna skördades för Western blotting vid 48 timmar efter transfektion.

Plasmidkonstruktion och övergående transfektion

EIF5A2 expressionsvektor (pIRES2-EGFP-EIF5A2) syntetiserades av Life Technologies. Celler transfekterades med pIRES2-EGFP-EIF5A2 eller kontrollen plasmid med användning av Lipofectamine 2000 (Life Technologies) enligt tillverkarens instruktioner.

realtid kvantitativ RT-PCR

Totalt RNA isolerades med användning av TRIzol Reagent (Life Technologies) enligt tillverkarens protokoll. PCR utfördes med användning av sekvenserna för EIF5A2: framåt: 5'AACTGCCAGAAGGTGAACTAGG-3 '; bakåt: 5'GTTTCCGTTTATTTGCAGGGT-3 "och sekvenserna för MTA1: framåt: 5'-CCGGGCCTGCGAGAGCTGTTACAC-3 '; omvänt: 5'-CACGGCTTCCAGCGGCTTGCGTAC-3 '. PCR utfördes med användning UltraSYBR Blandning (CWbio.Co.Ltd) enligt tillverkarens protokoll. Omvänd transkription utfördes med användning av en PrimeScript RT Master Mix kit (TAKARA Biotechnology Co. Ltd., Dalian, Kina). CDNA-produkterna utsattes för realtids-PCR med användning av en SYBR Premix Ex Taq II kit (TAKARA Biotechnology Co. Ltd.). Realtids-PCR utfördes i en StepOnePlus realtids-PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) med användning av följande program: 95 ° C under 10 minuter, följt av 40 cykler av 95 ° C under 15 sekunder och 60 ° C under 1 minut. GAPDH
mRNA i varje prov kvantifierades som en endogen kontroll.

Western blotting

Proteinkoncentrationen kvantifierades med användning av en BCA-proteinanalyssats (Thermo Scientific Pierce). Natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) användes för att separera cellysat. Proteiner överfördes till PVDF-membran och blockerades med Tris-buffrad saltlösning och 0,1% Tween 20 (TBST) innehållande 5% bovint serumalbumin och inkuberades därefter med följande primära antikroppar vid 4 ° C över natten: kanin-anti-EIF5A2 eller -C- MYC (1: 1000; Epitomics, USA, katalogȪ9-1 eller 1472-1), kanin anti-MTA1, -E-cadherin eller -vimentin (1: 1000, Cell Signaling, USA, katalognummer 5647, 3195 eller 5741 ), eller mus-anti-GAPDH (1: 1000; Santa Cruz, Catalog # sc-25778). Membranen tvättades tre gånger med TBST och inkuberades med pepparrotsperoxidas (HRP) -konjugerad anti-kanin eller anti-mus sekundära antikroppar (1: 3000; Santa Cruz, USA, katalog # sc-2004 eller sc-2005) under 1 h vid rumstemperatur. Proteinbanden visualiserades med användning av ECL-detektionsreagens (Pierce, USA). De relativa proteinexpressionsnivåerna normaliserades till GAPDH.

cellprolifereringsanalys

Spridningen av HGC27 och MKN45 celler undersöktes med användning av en cellräkning Kit-8 (CCK-8) (Dojindo, Japan ) i enlighet med tillverkarens instruktioner. I korthet, 24 h efter transfektion med siRNA eller plasmid, såddes cellerna vid en densitet av 1 x 10 ^{4 celler /brunn i 96-brunnsplattor och odlades under 0, 24, 48 och 72 h. Sedan, vid de olika tidpunkter, var 10}

• PLOS ONE: Effekter av intratumoral expressionsnivåer av fluoropyrimidin-enzymer på behandlingsresultaten av adjuvans S-1 terapi i Gastric Cancer
• PLOS ONE: Aberrant CCR4 Expression är inblandad i tumörinvasion av lymfa nodnegativ Human Gastric Cancer