Interleukin-23A är associerad med tumörtillväxt hos Helicobacter-pylori relaterade humant gastric cancer

interleukin-23A är associerad med tumörtillväxt hos Helicobacter-pylori
-relaterade human magcancer Bild Sammanfattning
Bakgrund
Interleukin ( IL) -23 är en av de nyligen identifierade inflammatoriska cytokiner, och inflammation är också känt att vara relaterade till utvecklingen av magcancer (GC). Rollen för IL-23 i magcancer är dock till stor del okända. I föreliggande studie undersökte vi uttrycket och möjliga rollen för IL-23A i humant GC.
Metoder
expression av IL-23A och IL-17A i humana GC vävnader bestämdes genom immunohistokemi, och förhållandet mellan IL-23A uttryck och kliniska egenskaperna hos GC undersöktes. Serumkoncentrationen av IL-23A och IL-17A testades också med ELISA. Källan och roll IL-23A i GC studerades in vitro Musik av flödescytometri, MTS (Owens reagens) analys och Western blot.
Resultat
IL-23A, IL-23-receptor (IL-23R) och IL-17A var alla överuttryckt i humana GC vävnader, och nivån av IL-23A var väl korrelerad med IL-17A i GC vävnader såväl som i patientens serum. Makrofager och GC-celler var den huvudsakliga källan till IL-23A utsöndring vid stimulering av H. pylori
lysat. Dessutom fann vi att IL-23A främjade proliferation av GC cellinjer via IL-17A /IL-17-receptorantagonist (IL-17RA) /nukleär faktor-KB (NF-kB) signalering.
Slutsatser
Den höga expression av IL-23A är associerad med GC. IL-23A kan främjas GC celltillväxt genom att inducera utsöndring av IL-17A i tumörmikromiljö. Våra resultat tyder på att serumkoncentrationen av IL-23A är en bra biomarkör av dålig klinisk prognos vid GC-patienter.
Nyckelord
Interleukin-23A Interleukin-17A Nuclear faktor-KB Magcancer Bakgrund
IL-23A är en subenhet av den heterodimera cytokinen, IL-23 genom ihopkoppling med den andra subenheten, p40 (IL-12). Det är känt att IL-23A uttrycks och utsöndras av makrofager och dendritiska celler. IL-23 kan aktivera signalomvandlare och aktivator av transkription 4 (STAT4) genom IL-23R fördelade på membranet av flera typer av immunceller, inklusive T-celler, naturliga mördar (NK) celler, monocyter och dendritiska celler. Och IL-23 deltar immunsvar att identifiera främmande ämnen och försvara kroppen mot infektioner och sjukdomar [1], [2].
IL-23A är inblandad i det inflammatoriska svaret genom att främja matrismetalloproteas 9, vilket ökar angiogenes och minska CD8 + T-celler infiltration [3], [4]. Genom att arbeta tillsammans med IL-6 och transformerande tillväxtfaktor-β1, kan IL-23 främjar differentiering av CD4 + naiva T-celler till Th17-celler, vilket är en av de väl accepterade hjälpar-cellunderuppsättningar T [5] - [ ,,,0],7]. Th17 celler utsöndrar proinflammatoriska cytokin IL-17A som kan inducera Th17 svar genom att stimulera produktionen av andra proinflammatoriska molekyler såsom IL-1β, IL-6, tumörnekrosfaktor-α (TNF-α) och kemokiner, vilket leder till inflammation. Det har rapporterats att IL-17 nära var förknippad med GC [8], [9]. En genomet hela föreningen studie har visat att -197G > En polymorfism vid position -197 i IL-17-promotorregionen signifikant ökad GC risk i den allmänna befolkningen [10], [11], medan ökat uttryck av IL-17 återfanns hos patienter med GC. IL-17 är också involverad i utvecklingen av GC genom att främja angiogenes i tumören mikro [12]. Vidare kan ihållande inflammation inducerad delvis av IL-17 bidrar till gastrisk mukosal patologi, och därigenom öka risken för GC [9], [11], [13].
Jämfört med den för IL-17A, de studier rörande rollen av IL-23A i human GC är i stort sett saknas. I den aktuella studien undersökte vi uttrycket av IL-23A i GC och dess kliniska betydelse och möjlig mekanism var inblandade.
Resultat
IL-23A, IL-23R och IL-17A är överdrivna i human GC
för att undersöka uttrycket av IL-23A och relaterade molekyler i människans GC, var 141 paraffininbäddade vävnader studeras för expression och distribution av IL-23A, IL-23R och IL-17A med hjälp av immunohistokemi. Först observerade vi att IL-23A, IL-23R och IL-17A allt väsentligt var överuttryckt i human GC jämfört med normala kontroller. Även om det var odetekterbart i normala gastriska körtlar och svagt positiv i infiltrerande inflammatoriska celler, var IL-23A detekterades vid en hög nivå i infiltrerande inflammatoriska celler och cancerceller i cancervävnader (Figur 1A). IL-23R uteslutande uttrycks i infiltrerande inflammatoriska celler i både cancer och normala vävnader, men uttrycksnivån och förhållandet var mycket högre i cancervävnader (Figur 1B). IL-17A var belägen huvudsakligen i infiltrerade inflammatoriska celler i GC (Figur 1C). Vi undersökte nästa förhållandet mellan uttrycket av IL-23A och olika kliniska egenskaper, och fann att nivån av IL-23A var associerat med H. pylori
infektion och tumörbörda (tabell 1). Figur 1 Expression och distribution av IL-23A, IL-23R och IL-17A i humant GC och normal gastrisk vävnad. (A) Expression och distribution av IL-23A analyserades genom immunohistokemi i både humant GC och normal gastrisk vävnad. Genomsnittlig integrerad optisk densitet erhölls genom att analysera fem synfält för varje bild utvärderas av Image-Pro Plus version 5.0. (B) Expression, distribution och genomsnittlig integrerad optisk densitet av IL-23R. (C) Expression, distribution och genomsnittlig integrerad optisk densitet av IL-17A. ** P Hotel < 0.01.
Tabell 1 Kliniska egenskaper hos 141 GC patienter
Patient demografi
IL-23 positiv
IL-23 negativa
Pvaluea
vid Age, y (intervall) Review 59 (32-85) katalog ND
ND
Sex
0.730
Man
89
45
44
Kvinna
52
28
24
Huvud läge
0,613
U
74
36
38
ml
67
29
38
Storlek, cm (intervall) katalog 0.028b Hotel > 5
97
74
23 Hotel < 5
44
25 19
djup invasion
0,519
T1 /T2
88
24
14
T3 /T4
53
29
24
Lauren klassificering
0,372
Intestinal
94
45
49
Diffusa
47
27
20
Lymfkörtel metastas
0,401
Positiv
69
37
32
Negativ
72
33
39
H.pylori
infektion
< 0.0001c
Positiv
84
74
10
Negativ
57
28
29
Stage
0,215
I
32
16
16
II
45
23
22
III
43
20
23
IV
21
10
11
ND = ej bestämd
aχ2 testet
bP Hotel <.. 0,05
cP Hotel <. 0,01.
IL-23A är korrelerad med IL-17A utsöndring i human GC Nybyggt studier har visat att utsöndringen av IL-23A var en av de viktigaste faktorerna i normal Th17 celldifferentiering. Vi ifrågasatte huruvida IL-23A också var förknippad med Th17 cell i GC. Faktum är förhöjd IL-23A expression sammanföll med ökad expression av IL-17A (Figur 2A). För att utforska ytterligare förhållandet mellan dem, kvantifieras vi uttrycket av båda cytokiner inom IHC färgning av GC patienter och visade att IL-23A uttryck var signifikant korrelerad med IL-17A uttryck genom en linjär korrelationstest (r 2 = 0,7148, P Hotel < 0,001) (Figur 2B). Figur 2 IL-23A är korrelerad med IL-17A utsöndring i human GC. (A) Korrelationen mellan IL-23A och IL-17A i cancervävnader av GC patienter undersöktes genom immunhistokemi. (B) Korrelationen mellan IL-23A och IL-17A inom IHC färgning av GC patienter nås genom linjär korrelationstest.
Serum IL-23A koncentration är en indikator på dålig prognos i GC patienter
Både IL-23A och IL-17A kan utsöndras i blodet därför hypotes vi att nivån av IL-23A och IL-17A i serum hos GC patienter eller friska kontroller kan bestämmas genom ELISA såsom biomarkörer. Vi först upptäcktes nivån på båda cytokiner som 213 ± 75 pg /ml för IL-23A och 286 ± 101 pg /ml för IL-17A i 50 friska individer (Figur 3A och B). Serumnivån av båda cytokiner ökade kraftigt i GC patienter som 517 ± 247 pg /ml för IL-23A och 422 ± 284 pg /ml för IL-17A (figur 3A och B). Och den linjära korrelationen mellan serumkoncentrationen mellan IL-23A och IL-17A sågs också i GC patienter (r 2 = 0,5841, P Hotel < 0,001) (Figur 3C). Tröskeln för friska kontroller erhölls på det 95% konfidensintervall (Cl), som var 285 pg /ml för IL-23A. Enligt tröskeln ades GC patienterna uppdelade i IL-23A hög och IL-23A låga delmängder. Att jämföra deras kliniska prognosen mellan de två undergrupper av GC patienter gavs serum IL-23A uttryck undersöktes med hjälp av Kaplan-Meier-metoden. Vi fann att IL-23A nivå (> 285 pg /ml) var signifikant associerad med kortare total överlevnad (OS) [P
= 0,027, hazard ratio (HR) 2,246, 95% CI: 1,212-4,160] (Figur 3D). Figur 3 Serum IL-23A koncentration som en indikator på dålig prognos i GC patienter. (A) Serumkoncentrationen av IL-23A i GC patienter och friska kontroller. (B) Serumkoncentrationen av IL-17A i GC patienter och friska kontroller. (C) Korrelationen mellan IL-23A och IL-17A i serum hos GC patienter nås genom linjär korrelationstest. (D) Kaplan-Meier kurvor för OS i GC patienter med olika uttryck av IL-23A.
IL-23A kan utsöndras av makrofager och GC-celler
Immunohistokemisk färgning visade att IL-23A rikligt uttrycktes i flera celltyper, inkluderande T-celler, makrofager och GC-celler (Figur 1A). För att undersöka det exakta ursprunget av IL-23A, nås vi IL-23A uttryck i ett in vitro
stimuleringssystem med hjälp av H. pylori
lysat som cytokin framkallande medel, som bygger på en tidigare observation att H. pylori
var ett robust inducerare för utsöndring av IL-23A. I T-celler, var IL-23A utsöndring ökade något efter stimulering med H. pylori
lysat (Figur 4A). I makrofager, antalet IL-23A-positiva celler ökade från 1,15 ± 0,18% till 13,21 ± 6,21% (Figur 4B). Medan i GC-cellinjer, IL-23A-positiva SGC-7901-celler ökade från 2,64 ± 1,12% till 13,11 ± 3,12%, och IL-23A positiva MKN45-celler ökade från 1,16 ± 0,46% till 17,55 ± 5,42% (figur 4C). Sammantaget makrofager och GC-celler visade H. pylori
lysat-inducerad stimulering av IL-23A utsöndring (Figur 4D). Figur 4 IL-23A utsöndras av makrofager och GC-celler. (A) Expression av IL-23A och cellytmarkör CD3 detekterades genom flödescytometri i T-celler med olika behandling. (B) Uttrycket av IL-23A och cellytan markör CD14 detekterades genom flödescytometri i makrofager med olika behandling. (C) Uttrycket av IL-23A detekterades genom FCS i SGC-7901 och MKN45 celler som behandlats med H. pylori
lysat. (D) Förhållandet mellan IL-23A-positiva celler i T-celler, makrofager och GC-cellinjer.
IL-23A främjar överlevnad GC celler genom IL-17A /IL-17RA /nukleär faktor (NF) -κB signalering
för att undersöka effekten av IL-23A på tumörtillväxt, var en co-kultur-analysen in vitro
utnyttjas. Först, fann vi att IL-23A hade ingen signifikant effekt på celltillväxt när GC linjerna SGC-7901 och MKN45 behandlades med humant rekombinant IL-23A direkt. Vi fann nästa att det inte fanns någon signifikant effekt på tumörcell SGC-7901 eller MKN45 tillväxt samodlades med naiva T-lymfocyter i närvaro av IL-23A. Emellertid var signifikant celltillväxtbefrämjande effekt ses när antingen makrofager eller H. pylori
lysat tillsattes till samodlingssystemet. När båda makrofager och H. pylori
tillsattes, var effekten synergistisk (figur 5A och B). Figur 5 IL-23A främjar överlevnad GC cellinjer genom IL-17A /IL-17RA /NF-kB-signalering. (A) Cellviabiliteten av SGC-7901 med behandlingen undersöktes. (B) Cellviabiliteten av MKN45 med behandlingen undersöktes. (C) Koncentrationen av IL-17A i cellodlingsmediet av SGC-7901 och MKN45 bestämdes genom ELISA. ** P Hotel < 0,01. (D) Uttrycket av IL-17RA och IL-23R i både MKN45 och SGC-7901. (E) Uttrycket av p-IkBa, IkBa och CyclinD1 både MKN45 och SGC-7901.
Vi undersökte möjlig mekanism ligger till grund för sambandet mellan IL-17A och IL-23A. Koncentrationen av IL-17A i odlingsmediet bestämdes, och det fanns ingen signifikant skillnad när GC-celler behandlades med IL-23A enbart eller IL-23A plus T-lymfocyter. Men utsöndringen av IL-17A ökar när antingen H. pylori
lysat eller makrofager sattes (figur 5C). Aktivering av NF-KB-signalering undersöktes också, och uttrycket av både IL-17RA och IL-23R detekterades i både SGC-7901 och MKN45-celler, relativt stark expression av IL-17RA och nästan ingen expression av IL-23R identifierades (figur 5D). Fosforylerad iKBa och cyclinD1, produkter av NF-kB signalering, båda ökade i SGC-7901 och MKN45 celler tillsammans med ökad närvaro av IL-17A (Figur 5E). IL-23A utsöndrades från både makrofager och GC-celler och främjas cancer proliferation genom IL-17A /IL-17RA /NF-kB signalering.
Diskussion
GC är den fjärde vanligaste cancerformen och den näst vanligaste orsaken till cancer -relaterade död över hela världen. Bland flera histologiska typer, är intestinal typ GC vanligen förknippas med H. pylori
infektion, och dess kurs kännetecknas av akut gastrit, kronisk gastrit, atrofi, intestinal metaplasi och slutligen bildandet av GC [10].
de exakta orsakerna till GC är okänd, men ett antal faktorer kan öka risken för sjukdomen, inklusive kön, ras, genetik, geografi, blodgrupp, hög ålder, familjehistoria, och H. pylori
infektion av magen. H. pylori
infekterar slemhinnan i magen och orsakar kronisk inflammation och sår. De detaljerade molekylära vägar som är ansvariga för stimulering av H. pylori
fortfarande inte helt känt [14] - [16].
Flera studier har rapporterat en immun effektormolekyler av H. pylori
, såsom CagA . CagA främjade uttryck av de proinflammatoriska kemokiner IL-8, CXC-kemokin-ligand 2 (även känd som makrofaginflammatoriskt protein) och den antimikrobiella peptiden human β-defensin-2 genom aktivering av NF-kB signalering [17]. Andra studier har visat att CagA translokeras in epitelceller genom att inducera höga nivåer av IL-8 infekterade av vissa H. pylori
stammar, som åtföljs av induktion av ett inflammatoriskt svar [16], [18], [19]. Ras-beroende kinaser, extracellulär signal-reglerat kinas (ERK) 1 och ERK2, är också aktiveras av CagA-utlöst tyrosinfosforylering, vilket leder till aktivering av transkriptionsfaktorer NF-kB, aktivatorprotein-1, och slutligen, IL-8-produktion av värdceller [9].
mekanism kopplad Hp-infektion och Th17 svar inte helt avslöjas. Några av cytokiner såsom IL-1β och IL-21 rapporterades vara förknippade. Lee et al. visade att ihållande Hp-infektion kan inducera Hp-specifika Th17 celler, snarare än andra immunceller som också har beskrivits att utsöndra IL-17A. Dessutom har IL-1β också kvarstående förhöjd, och neutralisering av IL-1β reducerade Hp specifika IL-17A svar, vilket tyder på en funktionell association mellan IL-1β och ihållande Th17 svar [20]. Andra gruppen visade också att IL-21 reglerar Th1 och Th17 effektor svar under kronisk H. pylori-infektion i en STAT1- och STAT3 beroende sätt, därför spelar en viktig roll att kontrollera H. pylori-infektion och gastrit [21].
Vi rapporterade att IL-23A utsöndrades från GC-celler och makrofager. Vi fann att serumnivån av IL-23A var en indikator på dålig prognos i GC patienter och dess uttryck i samband med tumörvolym och H. pylori
infektion. Våra resultat visade också att IL-23A hade ingen direkt effekt på spridningen av cancerceller. Dock tog det påverka tumörmikromiljön genom att öka utsöndringen av IL-17A, vilket är ett kännetecken cytokin enligt Th17 celler. Sammanfattningsvis fann vi att IL-23A kan vara en potentiell index och mål för diagnos och behandling av GC.
Slutsatser
Sammanfattningsvis denna studie visade att den höga expressionen av IL-23A är associerad med GC. IL-23A kan inducera utsöndringen av IL-17A aktiverar IL-17A /IL-17RA /NF-kB signalering i tumörmikromiljö. Serum IL-23A-koncentrationen är en indikator på dålig prognos i GC-patienter och IL-23A kommer att vara en potentiell index och mål för diagnos och behandling av GC.
Material och metoder
Patienter
Den aktuella studien inkluderade 141 patienter med GC som genomgick operation 2008-2013 på Kunshan folksjukhus, Kunshan, Jiangsu och Kunshan Hospital Anslutna till Nanjing University of kinesisk medicin. Dokumenterad informerat samtycke för genuttryck analyser av alla vävnader erhölls från samtliga patienter före operation. Studien godkändes av den lokala etiska kommittén i Kunshan folksjukhus. Histologisk subtyp enligt Laurens klassificering [22] bestämdes efter en översyn av tumörsnitt av två patologer. Uppföljningsdata fanns tillgängliga från alla GC patienter som bedömdes vid 3, 6,12 månader och därefter var 6 månader 5 år eller fram till döden.
Immunohistokemi
Alla vävnader avlägsnades och fixerades i 4% paraformaldehyd över natten vid 4 ° C, och därefter behandlades och sektionerades vid 5 | j, m tjocklek. Sektionerade objektglasen färgades genom immunhistokemi för IL-23A, IL-23R och IL-17A (Santa Cruz Biotechnology), följt av inkubering med sekundär antikropp vid 37 ° C under 30 min och reaktion med DAB-reagens i 5-10 min. Objektglasen monterades med neutral tuggummi för mikroskopisk undersökning. Celler med bruna intracellulära granuler (cytoplasma eller kärna) ansågs vara positivt färgas.
ELISA
Koncentration av IL-23A och IL-17A i serum hos GC patienter och friska kandidater mättes med användning av kommersiellt tillgängliga sandwich ELISA-kit ( eBioscience).
Stimulering av IL-23A in vitro
T-celler och makrofager isolerades från perifera mononukleära blodceller genom att använda isolering kit för att T-celler och monocyter respektive (Miltenyi Biotec). T-celler och makrofager samt GC cellinjer (MKN45 och SGC-7901 köptes från ATCC) upprätthölls och stimuleras av Helicobacter pylori
lysat (NCTC 11637, CagA + och VacA +) och analyserades genom intracellulär cytokin färgning in vitro
. För intracellulär cytokin färgning, var T-celler stimulerades vid 37 ° C under 5 timmar med en leukocytaktivering Cocktail (BD Pharmingen). Vidare har T-celler, makrofager och GC-cellinjer färgades med ytmarkörer, fixerades och permeabiliserades med IntraPre Reagent (Beckman Coulter) och slutligen färgas med intracellulära markörer. Data förvärvades på FACSVantage SE och analyseras med Cellquest mjukvara. Fluorokromkonjugerade mAbs mot IL-23A köptes från BD Pharmingen (Kat. 562468).
Flödescytometri
För intracellulär cytokin färgning, stimulerades cellerna vid 37 ° C under 5 timmar med en leukocytaktivering Cocktail (BD Pharmingen) . Cellerna färgades sedan med ytmarkörer, fixerades och permeabiliserades med IntraPre Reagent (Beckman Coulter) och slutligen färgas med intracellulära markörer. Data förvärvades på FACSVantage SE och analyseras med Cellquest mjukvara. Fluorokromkonjugerade monoklonala antikroppar (mAbs) mot IL-23A, CD3 tjänade som markör för T-celler och CD14 fungera som markörer för monocyt och makrofag köptes från BD Pharmingen.
MTS assay
Odlade celler ströks ut med en densitet av 6 x 10 3 celler /brunn i en 96-brunnars platta och förvaras tillsammans med DMEM plus 10% fetalt kalvserum (Invitrogen). Cellviabiliteten utvärderades genom MTS-analys. CellTiter 96Aqueous One Solution Reagent (Promega) tillsattes till varje brunn i enlighet med tillverkarens instruktioner, och plattorna återfördes till inkubatorn. Efter 4 timmar tillsattes cellviabiliteten bestämdes genom mätning av absorbansen vid 490 nm med användning av en datorstyrd plattläsare.
Western blöt
Proteiner extraherades från celler och kvantifierades med användning av en proteinanalys (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Proteinprover (30 ^ g) fraktionerades genom SDS-PAGE och överfördes till ett nitrocellulosamembran. Immunoblot utfördes med användning av antikroppar mot p-iKBa, iKBa, CyclinD1 och IL-17RA (Santa Cruz Biotechnology). Resultaten visualiserades med användning av ett system för kemiluminescerande detektion (Pierce ECL-substrat western systemet blot detektering; Thermo Scientific) och exponerades för autoradiografifilm (Kodak XAR-film) katalog Statistisk analys
Resultaten uttrycks som medelvärde ± SD av åtmin. minst tredubbla experiment. Jämförelser mellan två grupper utfördes med hjälp av Mann-Whitney U
test. Jämförelsen av IL-23A uttryck mellan olika kliniska egenskaper analyserades med hjälp av χ 2 test. Korrelationsanalys mellan uttryck av IL-23A och IL-17A i GC vävnader utfördes med hjälp av Spearman icke-parametrisk relation analys. Överlevnadskurvor uppskattades med Kaplan-Meier produkt-limit-metoden, och betydande skillnader mellan de överlevnadskurvorna bestämdes med användning av log-rank test. P Hotel < 0,05 ansågs statistiskt signifikant
Förkortningar
IL-23.
Interleukin-23
GC:
Magcancer


IL-23R:
IL-23-receptor
IL-17RA
IL-17-receptor subenhet A

NF-kB
Nuclear faktor-kB
STAT4
signalomvandlare och aktivator av transkription 4
NK:
naturliga mördar
förklaringar
Tack
Denna studie stöddes av social utveckling Technology Projekt av Kunshan City, Kina (KS1255) Review Författare ". original inlämnade handlingarna Images of Nedan finns länkar till författarnas ursprungliga inlämnade filer för bilder. 12935_2014_104_MOESM1_ESM.gif Författaroriginalfilen för figur 1 12935_2014_104_MOESM2_ESM.gif Författaroriginalfilen för figur 2 12935_2014_104_MOESM3_ESM.gif Författaroriginalfilen för figur 3 12935_2014_104_MOESM4_ESM.gif Författaroriginalfilen för figur 4 12935_2014_104_MOESM5_ESM.gif Författaroriginalfilen för figur 5 konkurrerande intressen
författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
författarnas bidrag
CL och WZ tänkta och utformade experimenten. CL, YZ, JZ, YZ, QW och Hp utförde experimenten. CL och WZ utfört statistisk analys av all data. CL skrev tidningen. Alla författare är överens med innehållet i manuskriptet och detta påstående. Alla författare läst och godkänt den slutliga manuskriptet.

• Statiner och risken för magcancer i diabetespatienter
• Inblandning av tumörnekrosfaktor-α i uppreglering av CXCR4-uttryck i magcancer inducerad av Helicobacter pylori