PLoS ONE: Ultra-Deep sekventering afslører den microRNA Expression Mønster af menneskelige mave

Abstrakt

Baggrund

Mens microRNA (miRNA) spiller en vigtig rolle i væv differentiering og i at opretholde basal fysiologi, er lidt om miRNA ekspressionsniveauerne i maven væv. Ændringer i miRNA profil kan føre til celle deregulering, som kan fremkalde neoplasi.

Metode /vigtigste resultater

En lille RNA bibliotek af mave væv blev sekventeret ved hjælp af high-throughput solid sekventering teknologi. Vi opnåede 261.274 kvalitet læser med perfekt matches til den humane miRnome, og 42% af de kendte miRNA blev identificeret. Digital Gene Expression profilering (DGE) blev udført på grundlag læse overflod og viste, at femten miRNA var stærkt udtrykt i gastrisk væv. Efterfølgende blev ekspressionen af ​​disse miRNA valideret i 10 raske individer af RT-PCR viste en signifikant korrelation af 83,97% (P < 0,05). Seks miRNA viste en lav variabel mønster af udtryk (miR-29b, miR-29c, miR-19b, miR-31, miR-148a, miR-451) og kunne betragtes som en del af udtrykket mønster af den sunde gastriske væv.

konklusioner /betydning

Denne undersøgelse havde til formål at validere normale miRNA profiler af menneskelig gastrisk væv til at etablere en reference profil for raske personer. Bestemmelse af de regulerende processer, der handler i maven vil være vigtigt i kampen mod mavekræft, som er den anden førende årsag til kræft dødelighed på verdensplan

Henvisning:. Ribeiro gøremål-Santos Â, Khayat AS, Silva A , Alencar DO, Lobato J, Luz L, et al. (2010) Ultra-Deep sekventering afslører den microRNA Expression Mønster af den menneskelige mave. PLoS ONE 5 (10): e13205. doi: 10,1371 /journal.pone.0013205

Redaktør: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapore

Modtaget: Marts 30, 2010; Accepteret: September 8, 2010; Udgivet: 8 Okt 2010

Copyright: © 2010 Ribeiro gøremål-Santos et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af Genoma Paraense de Genomica e Proteomik Project (Governo do Para /SEDECT /FAPESPA), PROPESP /UFPA, FADESP og slag (Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de Nivel Superior). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

for nylig Friedman et al.
2009 viste, at hovedparten af ​​de menneskelige gener er under kontrol af miRNA. Den > 45.000 miRNA target sites inden menneskelige 3'UTRs er bevaret, og > 60% af det humane protein-kodende gener har været under selektivt pres for at opretholde parringer til miRNA [1]. miRNA er små, ikke-kodende sekvenser af 17-25 bp, der regulerer genekspression ved binding til 3'-enden af ​​mål-mRNA'er, hvilket resulterer i inhibering af translation af mRNA'er [2], [3]. Cirka 14.000 miRNA er blevet identificeret i dyr, planter og svampe [4], [5], [6]

Mekanismer, der involverer miRNA som negative regulatorer af genekspression er ens i dyr og planter.; de regulerer grundlæggende cellulære processer [6]. Hos mennesker er ca. 3% af alle gener forudsiges at kode miRNA prækursorer, og over > 60% af protein-kodende gener kan reguleres af miRNA [1]. MiRNA har væsentlige funktioner i mange cellulære processer, såsom vækst og udvikling, cellulær proliferation, differentiering og apoptose. Følgelig ændringer i miRNA ekspression bidrager til humane sygdomme, såsom cancere [7], [8].

Ændringer i miRNA ekspressionsmønstre er blevet observeret i mange typer af human cancer, såsom bryst-, tyktarms-, lunge-, prostata, leukæmi og mavekræft. miRNA udtryk ændringer føre til et tab eller gevinst af funktion og er forbundet med udviklingen af ​​menneskelig neoplasma via diverse mekanismer [5].

Her præsenterer vi en genetisk undersøgelse af miRNA af den menneskelige mave, fordi på trods betydningen af ​​orglet, er tilgængelige på deres tilstedeværelse og regulering hos mennesker små genetiske data. Dette arbejde er det første fulde miRnome sekventering af normal mave væv ved hjælp af næste generations sekventering teknologi.

Resultater

I nærværende undersøgelse blev profiler opnået ved ultra-dybe sekventering ved hjælp af solid platform ( Life Technologies, CA, USA). Dette er den første undersøgelse at anvende denne procedure til at beskrive miRnome af normalt gastrisk væv. miRNA blev isoleret fra normal gastrisk mucosa mavemunden af ​​en enkelt sund patient. Profilerne valideret ved anvendelse Real Time PCR til at bestemme ekspressionen af ​​de 15 mest højt udtrykte miRNA i yderligere 10 raske patienter.

ULTRA-DEEP SEKVENTERING

Ultra-dybe sekventering gav i alt 104 millioner rå læser og 5 mio læser for gastrisk Cardia miRNA bibliotek. For yderligere analyse, læser blev udvalgt 3,2 mio ifølge sekvens kvalitet (mindst QV≥10 i de første 10 baser) [8]. Efter kortlægning disse til det humane genom (frigive 19), kortlagt samlede læse optælling var 2.534.490 millioner læser (75% af den samlede kvalitet læser). Ca. 38% af 2,5 millioner læser (963.460 læser) blev repetitive DNA-sekvenser, tRNA, rRNA eller andre små molekyler; 10% (261.274) blev accepteret læser, perfekt afstemt med kendte modne miRNA (miRBase udgave 15 Slip 04/2010) [9]; og resten af ​​læser (52%) blev matchet med genome sekvenser (figur 1).

Til ekspression analyse af miRNA, kun læser med tændstikker til modne miRNA sekvenser (261.274 læser) blev medtaget. I gastriske kardia, vi identificeret 404 af 970 kendte modne miRNA sekvenser (42%). For at analysere ekspressionen af ​​miRNA, vi defineret fem intervaller: 1 til 10 læste tæller; 11 til 100; 101 til 1000; 1001 til 5000; og en læse optælling på over 5000 (figur 2) (yderligere oplysninger findes i tabel S1). Det første interval (1-10) omfattede 40% af de observerede miRNA; det andet område (11 til 100) omfattede 26%; den tredje interval (101 til 1.000) omfattede 20%; og den fjerde og femte intervaller (> 1000 read tæller) omfattede 14%

Med denne klassifikation, 347 modne miRNA blev udtrykt mellem den første og tredje intervaller og 57 mellem fjerde og femte intervaller.. Til karakterisering af miRnome, valgte vi et sæt af de 15 miRNA, der blev givet udtryk for på højeste niveau (≥1,000 læser).

Tabel 1 og figur 3 liste de 15 modne miRNA identificeret i de menneskelige gastrisk Cardia . Den Heatmap i figur 4 opsummerer udtryk for disse 15 miRNA i gastrisk Cardia og på tværs af normale humane væv, DGE data tilgængelige i microRNA.org databank [10], [11]. Ældre miRNA udtryk kunne klassificeres i to grupper: i) Cardia-væv: miRNA sjældent udtrykt i andre væv, men udtrykt i gastrisk Cardia, herunder miR-148a, miR-192, miR-200a og miR-200b; ii) kvasi-allestedsnærværende: miRNA udtrykt i mange væv og betingelser, herunder miR-29c, miR-21, miR-24, miR-29b, miR-29a, miR-451, miR-31, miR-145, miR-26a , miR-19b og lad-7b.

real time PCR

de ultra-dybe sekventering resultater blev valideret ved hjælp af den singleplex Real Time PCR (RT-PCR) metode på de 15 miRNA udvalgt til bestemme deres udtryk i den gastriske cardia regionen fra 10 raske individer. Af de testpersoner, 60% var mænd, gennemsnitsalderen var 39,1 (± 12,8) år og 50% af de undersøgte emner testet positiv for H. pylori
, i henhold til internationale kriterier fastsat for deres identifikation [12], [13] (Tabel 2) (yderligere oplysninger findes i tabel S2).

COMPARARISON MED DGE OG RT-PCR

Både singleplex (RT-PCR) og multiplex (solid platform) teknologier viste høj ekspression (udtryk over 1.000 læser i DGE og 7 gange over den endogene kontrol i RT-PCR) af de 15 miRNA (figur 4 og 5)

De samme RNA-prøver var blevet analyseret af to forskellige platforme: DGE og RT-PCR - Life Technologies.. Resultaterne eksperimenter blev sammenlignet, og blev observeret lineær regression mellem 2 ^{-ΔCt og kvadratroden af ​​læse tæller nummer. Pearson korrelation er høj 83,9% med statistisk signifikant test (P < 0,05). Og validerede solide resultater}

Derudover blev DGE resultater i forhold til kvantificering af udtrykket vifte af miRNA i 10 raske forsøgspersoner, som Real Time PCR. Den regression til gennemsnittet af RT-PCR-analyser versus
kvadratroden af ​​læse tæller nummer. Pearson korrelation er høj 68,4% med statistisk signifikant test (P < 0,05).

Kunne observere miRNA med høj interindividuel variation, for exempla miR-21, og en anden med lav interindividuel variation, f.eks udtryk mønster lidt variabel (miR-29b, miR-29c, miR-19b, miR-31, miR-148a, miR-451).

Diskussion

miRNA regulerer de fleste af menneskelige gener; har dog kun få miRNA havde deres mål og specifikke funktioner identificeret [14]. I vores undersøgelse blev maven prøve fra et enkelt individ uden mave neoplasi eller andre præneoplasi forhold som atrofi, metaplasi eller dysplasi. Forstadier til kræft, såsom gastritis fører til genomisk hypo-methylering i maven, som kunne modificere ekspressionsmønsteret for miRNA [15]. Prøven blev opnået fra det normale væv fra en patient uden nogen patologier, som hjalp med at undgå risikoen for at indsamle en tilsyneladende normal vævsprøve med mikro-invasioner af debuterende tumorigene celler som kan forekomme hos patienter med nogen af ​​de ovennævnte patologier.

Denne undersøgelse er den første ultra-high-throughput sekventering af miRNA i det fysiologisk normale menneskelige mave. Kun 5,06% af miRNA identificeret i gastrisk væv var allerede blevet påvist i andre væv og katalogiseret i bioinformatik databanker såsom microRNA.org [10]. Vi forventer, at denne gruppe af miRNA til at være regulatorer af husholdning gener, som er rigelige i humane væv. En anden 7,84% af miRNA havde ingen kampe i miRNA udtryk databaser og kunne repræsentere miRNA, der er specifikke for fordøjelsessystemet eller maven.

Lignende undersøgelser er blevet udført med andre normale væv, såsom mund, svælg, spiserør, anus og tarmen. Vi sammenlignede disse data med vore miRNA udtryk data til at definere ekspressionsmønsteret af maven væv. Vi fandt høje ekspressionsniveauer i 15 miRNA, 13 som allerede var blevet identificeret som stærkt udtrykt i andre væv.

udtryk for mir-148a og mir-192 var blevet identificeret i andre normale og ondartede humane væv, men var ikke over-udtrykkes. Mir-192 var allerede blevet påvist i gastrointestinale væv, såsom colon, ileum, duodenum, tyndtarm, mave, bugspytkirtel og lever [16]. Basal ekspression af mir-148a er blevet observeret i bindevæv og endokrint væv [17]. For nylig blev mir-148a sig at være undertrykt i navlestrengsblod celler [18] og bragt til tavshed af hypermethylering i kolon tumorer [19]. Vi observerede høj ekspression af mir-200 klynge (a og b) i gastrisk Cardia som observeret i de Langerhanske øer [11]. I et microarray eksperiment blev mir-200a og mir-200b påvist i lave niveauer i gastrointestinale væv men i høje niveauer i colon, mave og pancreas [16]. En nyligt offentliggjort microRNA ekspression atlas viste, at denne miRNA er karakteristisk for endokrine væv [17]. Nylige resultater viser, at den lave ekspression af mir-200 klynge er korreleret med ovariecancer [19], [20]. Derfor kan mir-200 cluster være vigtigt i at bevare integriteten af ​​mave- tarmkanal såsom gastrisk Cardia fordi en sådan høj ekspression opreguleret ekspression af e-cadherin, proteinet er ansvarlig for organiseringen af ​​arkitekturen i den epitel væv. Derudover resultaterne kraftigt antydet en vigtig rolle på MIR-200 familie i undertrykkelsen af ​​den epitel-mesenkymale overgang (EMT) og progressionen af ​​cancer [21].

Tabel 1 og 2 viser antallet af mulige mål for hver stærkt udtrykt modne miRNA. Tabel 2 viser nogle mål for miRNA forudsagt af den Targetscan mod familier af konserverede miRNA. Med undtagelse af MIR-451, alle delte mindst to andre genmål. Generne ANKD52
UBN2
, er mål for ti af de fjorten miRNA analyserede, mens genet TNRC6B
er ni miRNA, og generne EPS15
, NFAT5
, BACH2
, BRWD1
, NUFIP2
, PTEN
, CDK6
og PTPRD DD6
, er mål for otte miRNA. Dette resultat tyder på, at disse miRNA er stærke kandidater til at blive tavse i Cardia region. Den eksperimentelle validering af disse gener, efterfulgt af en analyse af funktionen af ​​hver enkelt kan afsløre den fysiologiske rolle af disse miRNA i normal gastrisk væv.

Mange miRNA kan regulere oversættelse af proteiner, der handler i væv spredning og væv mønster såsom mir-200a (som kan målrette integrin) og mir-145 (som kan interagere med ErbB4
mRNA). Mange forventede mRNA mål blev fundet at være fælles for flere stærkt udtrykte miRNA. For eksempel HTR4 Hotel (5-hydroxytryptamin [serotonin] receptor) og AFF2
mRNA ( AF4 /FMR2
familie, medlem 2) blev forudsagt til at være mål for 13 af de 15 mest højt udtrykte miRNA. Yderligere fem mRNA'er, herunder IGF-1
(insulin-lignende vækstfaktor 1 [somatomedin C]), var almindelige forudsagte mål for 12 miRNA. Otte miRNA havde 222 forudsagt mål i fælles; for eksempel blev mir-29b forudsiges at målrette 196 af disse. Fem miRNA (19b, 29a, 29b, 29c og 148a) delte 70 forudsagt mål, hvoraf nogle ( CDK6
, PTEN
, IGF1
, FRS2
, PDGFRA
, PIK3R1
og MXD1
) regulerer celleproliferation og tumor undertrykkelse.

Flere observationer link miRNA til kræft. Først mange miRNA involveret i cellulær proliferation og apoptose. For det andet er mange miRNA loci ligger i skrøbelige steder i det menneskelige genom, regioner, der ofte forstærkede eller slettet i menneskelige neoplasier og forårsage store forskelle i miRNA udtryk i forhold til normale væv [21], [22], [23], [24 ].

Real Time PCR-teknik (som bruger relativ kvantificering) bekræftede 15 miRNA, der udviser den højeste udtryk ved solid platform (som er baseret på absolutte tal) (figur 4 og 5). Derfor disse miRNA kan betragtes som værende over-udtrykt [25], [26], [27], [28]. Sammenhængen mellem DGE og RT-PCR-analyser var klart og statistik signifikant. Og DGE eksperiment kunne anses for repræsentative for væv gastriske prøver isoleret fra 10 sundhedsmæssige emner og definere del af udtrykket mønster af den sunde gastriske væv.

Resultaterne fra begge metoder viser, at miRNA-21 var den mest stærkt udtrykt i gastrisk Cardia væv. Denne miRNA distribueres også i andre humane væv (f.eks, dendritiske celler, T-celler, bugspytkirtel) og kunne være involveret i regulering af ekspressionen af ​​housekeeping gener ( ATPAF1
, KIF3A
, CYBRD1
).

solid platform viste, at miR-192 og 148a er specifikke for gastrisk væv. Desuden Real Time PCR bekræftede, at disse miRNA er overudtrykt. Således samlet er disse miRNA sandsynligvis regulere ekspressionen af ​​gener relateret til gastrisk vævshomeostase. Derfor kunne de lave ekspressionsniveauer af disse miRNA være relateret til udviklingen af ​​en mave neoplasi. Den potentielle anvendelse af miRNA-192 og miRNA-148a som risikomarkører i mavekræft kan bedst undersøges gennem analyse af de miRnomes af forskellige histologiske typer af mavekræft.

Forståelse af de regulerende processer, der virker i den menneskelige mave vil være vigtigt i kampen mod mavekræft, som er det andet førende dødsårsag kræft på verdensplan.

Materialer og Metoder

biologisk materiale

den gastrisk Cardia er en mikroskopisk zone, der normalt findes i den mest proximale del af maven, tæt på den esophageal åbning (hjerte- åbning eller mavemunden) og indeholder de kardiale kirtler. Vores friske vævsprøve til ultra dyb sekventering blev opnået fra en gastroskopisk biopsi (-4 mm ^{3). Patienten var 33 år, uden tegn på kræft, og en normal gastroøsofageale forbindelse. Makroskopisk observation af vævet viste ingen tegn på læsioner, og histologisk undersøgelse bekræftede normale og sunde forhold.}

For at bekræfte resultaterne af ultra-dyb sekventering, Cardia prøver, nær cardiac blænde, fra 10 Desuden raske individer var også ved endoskopiske biopsier (-4 mm ^{3), og efter histologisk undersøgelse eksklusive abnormiteter, blev analyseret ved Real Time PCR. H. pylori
infektion blev diagnosticeret baseret på den typiske udseende af bakterien langs slim lag, der dækker den gastriske slimhinde antrale biopsier blev udtaget til histologi evaluering på grund af højere densitet af bakterierne i gastrisk antrum og til den fremragende følsomhed denne diagnostiske metode , ifølge de internationale kriterier, for deres identifikation [12], [13] (yderligere oplysninger findes i tabel S2).}

ETIK ERKLÆRING

skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter, og undersøgelsen blev godkendt af Comité de Etica em Pesquisa (CEP) af Hospital Universitario João Barros Barreto (HUJBB) -. Federal University of Pará (UFPA) (protokol nummer 14.052.004 /HUJBB)

miRNA BIBLIOTEK

det totale lille RNA blev opnået fra prøven væv ved hjælp af Mirvana Isolation Kit (Ambion Inc., US). Koncentrationen og kvalitet blev bestemt ved anvendelse af et NanoDrop 1000 spektrofotometer, og oprensning og udvælgelse størrelse blev udført under anvendelse 6% polyacrylamidgelelektroforese. Brug af den faste Small RNA Expression Kit (Ambion Inc., USA), blev 200 ng af små RNA på 150-200 bp anvendt som en skabelon til opnåelse af miRNA biblioteket. Alle miRNA af biblioteket blev mærket med unikke og specifikke amplifikationsprimere, kendt som stregkoden systemet (Life Technologies, CA, USA). Derefter blev 50 pg af biblioteket poolet med syv andre miRNA biblioteker ved den samme koncentration. En fraktion af biblioteket pool (0,1 pg) blev amplificeret og fikseret på magnetiske perler ved anvendelse emulsion PCR. Det ePCR produkt blev deponeret på en enkelt dias og underkastes den multiplex SOLID sekventering reaktion.

SOLID ULTRA-DEEP sekventering og DATA ANALYSE

de faste (version 2.0) sekventering systemet (Life Technologies) blev anvendt til at generere læser, der var 35 bp langt. Det andet skridt var at afkode stregkoden, der matcher hver perle sekvens med identiteten af ​​prøven. Alle små RNA sekvenser af gastrisk Cardia er tilgængelige i NCBI Sekvenser Læs Arkiv (SRA012099). Sekvensanalyse blev udført under anvendelse af solidt system Small RNA Analysis Tool (Life Technologies) og MiRanalyzer [8]. Først, vi bortfiltreret alle sekvenser som matcher RNA kontaminanter, såsom tRNA, rRNA, DNA gentagelser og adaptormolekyler. Efter at have udelukket forurenende læser, vi justeret alle sekvenser mod miRNA precursor-sekvenser (miRBase ver. 12) og derefter kun medtaget den læser som matcher moden miRNA-sekvenser [9]. For at sammenligne disse udtryk data med andre humane væv blev miRNA udtryk data importeret fra microRNA.org databasen, og udtryk for hver modne miRNA blev normaliseret ved total læse count [10]. Grafisk analyse blev udført under anvendelse Genepattern ^{10. De miRNA-biologisk proces relationer blev forudsagt ved hjælp miRNApath (http://lgmb.fmrp.usp.br/mirnapath/tools.php).}

miRNA real time PCR (validering)

Biopsi prøver af gastrisk Cardia væv blev indsamlet fra 10 raske patienter. Efter opsamlingen blev prøverne straks behandlet og opbevaret ved -80 ° C indtil RNA-ekstraktion. Totalt RNA blev ekstraheret ved homogenisering 40 milligram frosset væv, efterfulgt af RNA-isolering af TRlzol-reagens (Life Technologies) ifølge producentens instruktioner. Koncentrationen og kvaliteten af ​​miRNA blev bestemt under anvendelse af et NanoDrop 1000 spektrofotometer (ND-1000, NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). Totalt RNA blev revers transkriberet under anvendelse af en TaqMan @ MicroRNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies).

Analysen af ​​miRNA niveauer blev udført på en 7500 Real-Time PCR System (Life Technologies) med TaqMan miRNA assays ifølge den producentens anvisninger (Life Technologies) under anvendelse af primere designet med Primer Express (Life Technologies). Den gennemsnitlige ekspressionsniveau af tre humane endogene kontroller (Z30, RNU19 og RNU6B - kalibratorer). Blev anvendt som en intern kontrol i alle miRNA eksperimenter for at muliggøre sammenligning af ekspression resulterer

De høje ekspressionsniveauer af miRNA identificeret af ultra-dybe sekventering (i faldende rækkefølge: miR-29c, miR-21, miR-148a, miR-29a, miR-24, miR-29b, miR-192, miR-451, miR-145, miR-31, miR-200a, miR-19b, miR-200b, lad-7b og miR-26a) blev valideret med TaqMan miRNA analyser (Life Technologies). Disse analyser blev anvendt til at måle ekspressionsniveauerne af modne miRNA og inter-individuel variation i de 10 prøver af sund Cardia væv. De udtryk data af hver modne miRNA blev normaliseret til den gennemsnitlige ekspressionsniveauet af de tre humane endogene kontroller (Z30, RNU19 og RNU6B). De relative miRNA ekspressionsniveauer blev derefter beregnet ved den sammenlignende tærskelcyklus (Ct) metode (2 ^{-ΔCt). Korrelation test blev udført ved hjælp af Pearson-metoden (SPSS V.12).}

Støtte oplysninger
tabel S1.
Identitet og overflod data for alle kendte miRNA i fast sekvens datasæt i menneskelige mave og miRamda database
doi:. 10,1371 /journal.pone.0013205.s001
(0,44 MB PDF)
tabel S2.
beskrivelse og RT-PCR resultater af 10 prøver fra raske individer opnået ved endoskopiske biopsier. Prøver størrelse er omkring -4 mm3. For alle prøver blev udført en histologisk undersøgelse og H. pylori afsløring
doi:. 10,1371 /journal.pone.0013205.s002
(0,03 MB XLS)

Tak

forfattere tak D. Calcagno og S. Demaschki for deres kommentarer, ideer og hjælper.

• PLoS ONE: Vejen til et Mans hjerte går gennem hans mave: Hvad med Heste
• PLoS ONE: Konsekvenserne af en Energy Drink på struktur mave og Pancreas af Albino Rat: Kan Omega-3 Giv en Protection