Establecimiento e identificación de un modelo de conejo de la carcinomatosis peritoneal de cáncer gástrico

Establecimiento e identificación de un modelo de conejo de carcinomatosis peritoneal por cáncer gástrico
Resumen Antecedentes

carcinomatosis peritoneal El cáncer gástrico es un problema clínico común, pero no hay grandes modelos animales adecuados para el estudio de este problema. Este estudio fue establecer un modelo de carcinomatosis peritoneal de conejo estable de cáncer gástrico usando tumor VX2, y analizar las características clínico-patológicas
Métodos
tumor VX2 se implantó en 36 conejos de Nueva Zelanda por 3 métodos:. Ortotópico de inyección de laparotómico las células de cáncer en la capa submucosa del estómago (Grupo A), la implantación laparotómico de tejido tumoral en el epiplón mayor inmediatamente debajo de la antro gástrico (Grupo B), y la inyección percutánea de células tumorales directamente en la cavidad peritoneal (Grupo C), 12 conejos en cada grupo. Los animales fueron observados de cerca y se llevaron a cabo estudios detallados clínico-patológicas.
Resultados
las tasas de éxito de la formación de carcinomatosis peritoneal fue del 100% (12/12), el 91,7% (11/12) y 58,3% (7 /12), respectivamente, para los grupos a, B y C (p = 0,019, a frente a C, p = 0,077, B contra C; P = 0,500, a frente a B, la prueba exacta de Fisher). Dos semanas después de la inyección submucosa células cancerosas en el Grupo A, el cáncer gástrico ulcerosa con carcinomatosis peritoneal mostraron patología típica del tumor VX2, con nódulos metastásicos generalizadas intraperitoneal, ascitis hemorrágica y metástasis pulmonares perspicuas. El patrón de progresión clínico-patológica era muy similar a los pacientes de cáncer gástrico avanzado con carcinomatosis peritoneal. Los grupos B y C mostraron patrón similar de la progresión del cáncer, pero
menos agresivo. Conclusiones
primer modelo animal grande de carcinomatosis peritoneal de cáncer gástrico se ha establecido mediante inyección ortotópica laparotómico de células de cáncer de VX2 en la capa submucosa del estómago , proporcionando un modelo más adecuado para los estudios de intervención quirúrgica. Las características clínico-patológicas de este modelo se parecen a carcinomatosis peritoneal humana.
Antecedentes Francia El progresión locorregional de cánceres gastrointestinales y ginecológicos con frecuencia resulta en carcinomatosis peritoneal (PC), que se caracteriza por la presencia de nódulos tumorales de diversos tamaño, el número y la distribución en la superficie peritoneal, con muy mal pronóstico y una supervivencia media de menos de 6 meses [1, 2]. Los tratamientos actuales para tales PC son la quimioterapia sistémica, mejor cuidado de apoyo y terapia paliativa, sin esperanza de curación. Para hacer frente a este problema, una nueva modalidad de tratamiento denomina cirugía citorreductora (CRS), además de hipertermia quimioterapia intraperitoneal (HIPEC) se ha desarrollado en las últimas dos décadas, tomando ventajas de la cirugía para reducir la carga tumoral visible, y la quimioterapia hipertérmica regional para erradicar las micrometástasis [3-6].
Mientras que los estudios clínicos han hecho progresos, algunos modelos experimentales animales de PC también se han desarrollado, incluyendo modelos de ratones y los modelos de rata para evaluar la eficacia y los efectos adversos de los protocolos experimentales HIPEC [7-10]. Aunque tales modelos animales pequeños son útiles en estudios experimentales, es técnicamente difícil de realizar operaciones en animales pequeños, debido al tamaño corporal pequeño y condiciones hemodinámicas delicados. animales grandes como el cerdo también se ha utilizado para probar la farmacocinética de HIPEC, pero los animales utilizados fueron los cerdos sanos en lugar de cerdos con PC [11]. Por lo tanto, un animal grande modelo PC más adecuado para los estudios de intervención quirúrgica es deseable. Aquí nos informe sobre un modelo de conejo PC de cáncer gástrico, con las características clínico-patológicas imitan a los pacientes con cáncer gástrico avanzado.
Métodos
mascotas
Treinta y seis conejos blancos de Nueva Zelanda, 18 hombres y 18 mujeres, el peso corporal entre 2,5 ~ 3,0 kg, se obtuvieron de los Animales de Laboratorio de Bioseguridad Nivel 3 en el Centro Experimental de Animales de la Universidad de Wuhan (Animal Certificado de Estudio SCXK 2.003-0.004). Los animales se alojaron individualmente y se les permite el acceso libre a la comida estándar de laboratorio y agua, así como 12 horas de luz y oscuridad ciclo por día. El protocolo de estudio en animales fue aprobado por el Comité de Bienestar Animal del Centro.
Cepa del tumor y la preparación de las células tumorales de carcinoma VX2
conejo se utilizó para establecer el cáncer gástrico con PC en este estudio. El tumor VX2 es un carcinoma de células escamosas de conejo transplantable, caracterizado por un crecimiento rápido del tumor y la metástasis temprana, establecida a partir de un papiloma inducido por el virus de Rous y compañeros de trabajo [12]. El tumor fue mantenida por los sucesivos in vivo
trasplante en la pata trasera de 2 conejos portadores utilizados por cada pasaje.
Cuando el tumor VX2 vino a cerca de 1 cm de diámetro en el conejo portador, el animal fue anestesiado por el oído inyección en la vena de 3% de sodio pentobarbital (30 mg /kg). Después de la preparación de la piel y la desinfección, el tumor se escindió del conejo portador y se coloca en solución helada de cloruro de sodio 0,9%. El tejido tumoral se picó en aproximadamente 1,0 ~ 2,0 mm 3 fragmentos y se suspendió en 2 ml de solución salina normal, a continuación, mezclarse en un ml inyector 2. Otros tejidos tumorales sobre 3,0 ~ 5,0 mm 3 se coloca en el homogeneizador incrustado en baño de hielo, al que se añadió 3 ml de solución salina normal fría helada, y se hizo la suspensión de células tumorales, con la concentración de las células tumorales se ajustó a 5 × 10 10 células vial /l.
Construcción de cáncer gástrico con PC
Todos los conejos tuvieron en ayunas durante la noche antes experimento, pero se le dio agua ad libitum
. Después de la aleatorización, los animales se anestesiaron por inyección en la vena del oído de 3% de sodio pentobarbital (30 mg /kg). La piel abdominal sido limpiado y desinfectado. Se adoptaron tres enfoques para construir modelos de conejo de PC, 12 animales por cada grupo. Grupo A de la inoculación de células tumorales submucosa: Se hace una incisión en la línea media de 3 cm de largo fue hecha a partir de 2 cm por debajo del xifoides y el abdomen superior estaba abierta. El estómago se expuso, 0,1 ml de células tumorales (5 × 10 10 células de viales /l) se inyectaron en la capa submucosa del estómago (Figura 1), a través de la capa serosa y la capa muscular, el sitio de inyección fue de presionado por 1 min para mantener las células tumorales inyectadas en su lugar, y el abdomen se cerró con una doble capa de 3-O vicryl interrumpió sutura. Grupo B de la implantación de tejido tumoral: La incisión fue el mismo que en el Grupo A. Cuando el estómago se expuso, una pequeña pieza de tejido tumoral fresco sobre 1,0 mm 3 se implanta en el epiplón mayor inmediatamente debajo de la antro gástrico, y la herida se cerró. Grupo C de la inyección percutánea de células tumorales: Después de la preparación de la piel, 0,1 ml de células tumorales (5 × 10 10 células de viales /L) se inyectó directamente en la cavidad abdominal superior, y el sitio de inyección se ha pulsado durante 1 min. Después de la inoculación del tumor, la penicilina G a la dosis de 100.000 UI /d se inyectó intramuscularmente a cada animal durante 3 días. Todos los animales fueron dar rehidratación con líquidos intravenosos con 100 ml de solución salina normal al 0,9%. Figura 1 Construcción de conejo modelo de carcinomatosis peritoneal por cáncer gástrico. Cuando el estómago de conejo se expone bajo anestesia general, se insertó una aguja de 16 G a través de las capas serosas y musculares en la capa submucosa del estómago, y 0,1 ml de células tumorales (5 × 1010 vial células /L) fueron inyectados, y la inyección de el sitio fue presionado durante 1 minuto para mantener las células tumorales en su lugar (Ver el texto para una descripción detallada).
la observación de animales y estudios patológicos
Después de la operación, la observación diaria se hizo en cada conejo para comprobar la ingesta de alimentos, actividades, y cualquier anormalidad, como la diarrea y la deshidratación. El peso corporal se midió cada 3 días y se registró la historia natural de la progresión de la enfermedad. Con el fin de obtener una descripción detallada del desarrollo progresivo de PC cáncer gástrico, la eutanasia se realizó en 3 conejos en el Grupo A al final de la semana 1, 2, 3 y 4, por inyección sobredosis de 3% de sodio pentobarbital a través de la vena de la oreja . Para los animales de los grupos B y C, la eutanasia también se lleva a cabo cuando los animales mostraron signos evidentes de angustia y de residuos, de acuerdo con las directrices UKCCCR para el bienestar de los animales en la neoplasia experimental [13]. Post mortem exámenes patológicos incluyen patología macroscópica, como el tamaño del tumor y distribuciones; características tumorales locales de cáncer gástrico que incluye la formación de úlceras, obstrucción y perforación; características especiales de la carcinomatosis peritoneal como ascitis hemorrágica, nódulos tumorales discretos o confluentes en el peritoneo, cambios cancerosos en el epiplón mayor y obstrucciones intestinales; metástasis en órganos importantes como el hígado, las glándulas suprarrenales, el páncreas y los pulmones. Todos los tejidos de los órganos sospechosos tomaron muestras para su estudio histopatológico de rutina con secciones teñidas con hematoxilina y eosina (HE mancha).
El análisis estadístico Francia El peso corporal y el peso del tumor se expresaron como media ± desviación estándar (M ± DE). Las metástasis intraabdominales y ascitis hemorrágica se registraron como rangos y medianas. La versión de software estadístico SPSS 10,0 paquete (SPSS Inc., Chicago IL, EE.UU.) se utilizó para el análisis, la prueba bilateral, y P < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
éxito del modelo de PC de construcción Red de 36 animales utilizados para la construcción del modelo de PC, la operación fue exitosa en 33 conejos y 3 animales murieron 3 días después de la operación. De los 3 muertes, 1 conejo en el grupo C murió de peritonitis difusa en el día 3 debido a que la inyección percutánea fue por error en el intestino delgado; y 1 conejo cada uno de los grupos B y C murió de insuficiencia cardíaca congestiva en el día 2 debido a la rehidratación con líquidos rápido. Otros 3 conejos en el Grupo C no se desarrollaron PC por razones desconocidas. Las tasas de éxito fue del 100% (12/12) en el grupo A, el 91,7% (11/12) en el grupo B y el 58,3% (7/12) en el grupo C (p = 0,019, A frente a C, p = 0,077, B frente a C;. P = 0,500, a frente a B, la prueba exacta de Fisher) el crecimiento del tumor
y su impacto sobre el animal
Después de la inyección de las células cancerosas en la submucosa gástrica en el Grupo a, el tumor demostró un crecimiento acelerado. Los tamaños de los tumores fueron (0,028 ± 0,012) cm 3, (1,183 ± 0,148) cm 3 y (7.706 ± 1.629) cm 3, respectivamente, al final de las semanas 1, 2 y 3 . Los animales mostraron disminución progresiva del peso corporal, a partir de (2,48 ± 0,21) kg antes de la operación de (2,45 ± 0,21) kg en la semana 1, (2,24 ± 0,19) kg en la semana 2, (2,02 ± 0,18) kg en la semana 3 y (1,81 ± 0,1) kg en la semana 4. Junto con los cambios de peso corporal, el estado de la alimentación y la salud general de los animales se deterioraron progresivamente. características de crecimiento
de carcinomatosis peritoneal en modelo animal
las características del tumor en el grupo A fueron cuidadosamente registrados . Una semana después de la inyección submucosa de células de cáncer, muchos nódulos pequeños y duros y transparentes comenzaron a desarrollar en el epiplón mayor y el antro del estómago. No se observó ascitis. Dos semanas más tarde, nódulos en el epiplón mayor empezaron a fundirse en masas confluentes sin demarcaciones discernibles con el estómago. La masa en la pared gástrica se hizo más grande y sobresale en la cavidad del estómago para formar el cáncer ulcerosa típica (Figura 2). Había unos 5 ml de ascitis hemorrágica en la cavidad abdominal. Tres semanas más tarde, muchos nódulos comenzaron a formar en el mesenterio y el retroperitoneo. La masa confluente en el epiplón mayor comenzó a invadir el hígado y el almacenamiento del estómago (Figura 3). A menudo, los medios de estómago y el epiplón mayor masa fusionan en un bloque de tumor grande. ascitis hemorrágica podrían alcanzar hasta 100 ml. Había también algo de acumulación de líquido en el pericardio. Muchos nódulos se observaron en la pared abdominal. No se observaron nódulos en los pulmones. Cuatro semanas más tarde, se observaron numerosos nódulos tumorales en los pulmones, el hígado, las glándulas suprarrenales, intestino delgado, colon transverso y la vejiga. La pared abdominal fue totalmente invadida por el tumor. Los tumores en los grupos B y C mostraron características de crecimiento similares. Figura 2 Rabbit cáncer gástrico en el grupo A. Dos semanas después de la inoculación de las células tumorales submucoso VX2, estudio patológico después de la eutanasia de los animales muestra cáncer gástrico ulcerosa típico (flecha) en conejo de Nueva Zelanda.
Figura 3 conejo modelo PC de origen gástrico del Grupo A. Tres semanas después se inyectaron células de carcinoma VX2 en la capa submucosa del estómago, masa tumoral confluente en la pared del estómago mayor epiplón encerrado (flecha negro) y el hígado (flecha amarilla).
características histopatológicas de PC conejo VX2
Todas las muestras tumorales investigadas mostraron un amplio crecimiento invasivo y la destrucción del tejido. Los tumores, en la curvatura mayor del antro gástrico, penetraron en la capa mucosa para formar úlceras. Vista microscópica podría encontrar nidos de cáncer que penetran toda la pared del estómago, con la invasión típica en la capa muscular y las glándulas gástricas (Figura 4A). Las células tumorales son redondos, ovalados o morfología atípica con muchas figuras mitóticas patológicos (Figura 4B). También hubo linfocitos conspicuos, células plasmáticas y otra infiltración de células inflamatorias. Figura 4 La histopatología del cáncer gástrico modelo de conejo con PC, se inyectaron 2 semanas después de células de carcinoma VX2 en la capa submucosa del estómago en las células tumorales A. VX2 Grupo invadido toda la pared del estómago (4A, × 100, Tinción HE) y mostró muchas mitosis patológicos (4B, × 200, tinción HE)
. Las principales características de este modelo de conejo de PC de cáncer gástrico se podrían resumir en la Tabla 1 1.Table Las características del tumor de la inoculación de tres diferentes enfoques

Grupo A Grupo B

Grupo C
Ficha técnica
laparotómico células tumorales ortotópico
inyección en la submucosa gástrica
la inoculación del tumor ortotópico de tejido
laparotómico debajo del antro gástrico
inyección de células tumorales en el peritoneo percutánea
tasa de éxito
100% (12/12)
91,7% (11/12): perfil del 58,3% (7/12)
principales eventos patológicos
rápida progresión del tumor resultante en el síndrome de dificultad respiratoria, la peritonitis difusa debido a la perforación del tumor gástrico, obstrucción intestinal, insuficiencia renal
rápida progresión del tumor que resulta en la obstrucción intestinal, insuficiencia renal
rápida progresión del tumor resultante en la adhesión intestinal una obstrucción, insuficiencia renal
anatomía patológica macroscópica
cáncer gástrico ulcerosa con PC, ascitis
cáncer gástrico ulcerosa con PC, ascitis
PC sin úlcera gástrica, ascitis
Histopatología
penetrante crecimiento de nidos de células cancerosas invaden las estructuras circundantes, de necrosis tumoral en la zona central de la masa tumoral
Ventajas
más se asemejan a cáncer gástrico clínica con PC Técnicamente
menos difícil
técnicamente fácil
Desventajas
técnicamente difícil
No exactamente imitan el cáncer gástrico con PC
inyección equivocada en los intestinos
Discusión
PC representa una seria clínica desafío en el tratamiento de los cánceres gastrointestinales y ginecológicos. En el cáncer gástrico, PC es un evento frecuente con 15% a 50% o más pacientes que tienen PC en la exploración quirúrgica, especialmente cuando hay participación serosal por el tumor [14-16]. Incluso después de la resección curativa del cáncer gástrico, PC sigue siendo un problema importante de la recurrencia postoperatoria. Un estudio coreano en 500 pacientes con cáncer gástrico tratados con gastrectomía radical y linfadenectomía estandarizada, encontró que dentro de los 5 años posteriores a la gastrectomía, PC es el patrón más frecuente (51,7%) de recurrencia del cáncer [17]. Otro estudio prospectivo aleatorizado en Japón también encontró recidiva peritoneal es el caso más frecuente (15,8%) a los 3 años en 530 pacientes tratados con gastrectomía curativa altamente estandarizada [18]. Un estudio prospectivo italiano en 200 pacientes encontró que, en el seguimiento medio de 42,3 meses, PC representó el 32,9% de recurrencia [19]. Otro estudio italiano con 441 pacientes con cáncer gástrico mostró 17% ​​de recurrencia PC en la mediana de seguimiento de 48 meses [20]. Por lo tanto, PC síncrona y metacrónico es el problema más importante de la recurrencia del cáncer gástrico y metástasis. Tal PC gástrica se asocia con un mal pronóstico con una supervivencia media que oscila entre 1-1,6 meses [21, 22] a 3.1-9 meses [1, 15]. Como se afirma con razón, el riesgo de recidiva peritoneal del cáncer gástrico es particularmente elevada en los pacientes con tumores y la infiltración de la serosa difusas-mezclado, en contra de lo que la cirugía sola, no importa cuán radical, puede ofrecer poca posibilidad de una cura [20]. Por lo tanto, se requieren nuevas estrategias de tratamiento integral.
Estudios clínicos sugieren que CRS más HIPEC podría conseguir una buena eficacia en pacientes seleccionados con PC. A nuestro entender hay 4 estudios institucionales sobre CRS además HIPEC en pacientes con cáncer gástrico, 2 retrospectiva (42 y 26 pacientes, respectivamente) [3, 23], 1 prospectivos (49 pacientes) [4] y 1 comparativo no aleatorio ( 34 pacientes) los estudios [24]. La mediana de supervivencia varió de 6,6 meses [24], 8 meses [23] a 10-11 meses [3, 4], y la supervivencia a 5 años osciló entre el 6% [3, 25] al 16% [4]. Estos estudios clínicos se basan en grupos no homogéneos y no estandarizados de pacientes. Con el fin de evaluar de manera más objetiva tal tratamiento, es necesario estudiar esta modalidad de tratamiento en condiciones experimentales.
Se han establecido modelos animales pequeños de PC, incluyendo modelos de ratones desnudos y los modelos de rata [26-29]. En la mayoría de estos modelos animales, las células cancerosas se inyectan directamente en el peritoneo, lo que resultará en generalizada PC a su debido tiempo [25, 30-32]. Todos estos pequeños modelos animales solamente son adecuados para HIPEC solo, porque el pequeño tamaño del cuerpo y el suministro de sangre limitado no pueden soportar intervenciones de cirugía mayor. El establecimiento de gran modelo animal de la PC de cáncer gástrico es necesario para las pruebas experimentales CRS estudios y HIPEC.
Carcinoma VX2 es un tumor de origen epitelial conejo, establecida a partir de un papiloma virus inducida por Rous y compañeros de trabajo [12]. Caracterizado por un crecimiento rápido del tumor y la metástasis temprana, este tumor es extremadamente maligno y puede ser trasplantado allogeneously en casi cualquier lugar en conejos. Aunque VX2 es un modelo escamosas carcinoma de células, que puede ser diferente de adenocarcinoma, se ha utilizado en muchos estudios experimentales en cáncer de cabeza y cuello [33 a 36], cáncer de pulmón [37], cáncer de esófago [38, 39], de mama cáncer [40], cáncer gástrico [41, 42], cáncer de hígado [43, 44], cáncer de colon [45, 46], cáncer de riñón [47-49], cáncer de vejiga [50], tumor óseo [51] y sencillo carcinomatosis peritoneal [52]. En este estudio se construyó un modelo de conejo de cáncer gástrico con PC. Nuestros resultados demuestran que la inoculación ortotópico de células tumorales en el estómago es el método más apropiado, lo que resulta en el cáncer gástrico ulcerosa típico y PC progresiva, todas las características similares a la progresión clínico-patológica de pacientes con cáncer gástrico. En comparación, la inyección percutánea de células de cáncer en la cavidad abdominal podría dar lugar a lesión intestinal por error. No cáncer gástrico ulcerosa puede ser inducida, y la tasa de absorción del tumor es baja. Estos resultados apoyan la idea de que se prefiere modelo de tumor ortotópico para el estudio de los comportamientos y las intervenciones [53] biológicos tumorales. La historia natural de este modelo es de aproximadamente 4 semanas, incluyendo una etapa subclínica en la primera semana, el estadio clínico en la segunda semana, la etapa PC acelerado en la tercera semana y la etapa terminal en la cuarta semana. Las características típicas de PC son nódulos de cáncer peritoneal de diferentes tamaños a lo largo de toda la cavidad abdominal, "pastel de epiplón", obstrucción intestinal y ascitis hemorrágica. El final de la primera semana se podría considerar como principios del PC, mientras que el extremo de la segunda semana como el PC avanzada. Por lo tanto, los enfoques de tratamiento específicos podrían ser diseñados para dirigir ya sea PC temprano o PC avanzada.
Conclusiones
un modelo de conejo de cáncer gástrico con PC se ha establecido mediante la inyección de células de cáncer de VX2 en la capa submucosa del estómago. El modelo se caracteriza por cáncer gástrico ulcerosa típica con PC progresiva, por lo que es más adecuado para los estudios de intervención quirúrgica para evaluar CRS y HIPEC contra el PC gástrico.
Notas
Lie-Jun Mei, Xiao-Jun Yang contribuyeron igualmente a este Declaraciones de trabajo.

Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional del Autor de la Tesis de Doctorado excelente de China (n FANEDD-200464); el Fondo de Ciencias Creativas Grupos de Investigación de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 20621502, 20921062).
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Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

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• El examen de lesiones en el estómago glandular equinos para las bacterias Helicobacter spp, incluyendo por fluorescencia de examen hybridisation