Etablering og identifisering av en kanin modell av peritoneal karsinomatose fra magekreft

Etablering og identifisering av en kanin modell av peritoneal karsinomatose fra magekreft
Abstract
Bakgrunn
Magekreft peritoneal karsinomatose er et vanlig klinisk problem, men det er ingen egnede store dyremodeller for å studere dette problemet. Denne studien var å etablere en stabil kanin peritoneal karsinomatose modell av magekreft ved hjelp VX2 svulst, og analysere klinisk-patologiske funksjoner
Metoder
VX2 tumor ble implantert i 36 New Zealand kaniner av 3 metoder. Laparotomic orthotopic injeksjon av kreftceller til submucosal lag av magesekken (gruppe A), laparotomic implantasjon av tumorvevet inn i det større omentum umiddelbart under gastrisk antrum (gruppe B), og perkutan injeksjon av tumorceller direkte inn i det peritoneale hulrom (gruppe C), 12 kaniner i hver gruppe. Dyrene ble tett observert og detaljert klinisk-patologiske studier ble utført.
Resultater
Den suksessrate på peritoneal karsinomatose dannelse var 100% (12/12), 91,7% (11/12) og 58,3% (7 /12), henholdsvis for gruppe A, B og C (P = 0,019, A eller C; P = 0,077, B versus C; P = 0,500, A eller B, Fishers eksakte test). To uker etter submucosal kreftceller injeksjon i gruppe A, ulcerøs magekreft med peritoneal karsinomatose viste typisk VX2 svulst patologi, med utbredte intraperitoneal metastatisk knuter, blodig ascites og oversiktlig lungemetastaser. Den klinisk-patologisk progresjon mønster var svært lik pasienter med avansert magekreft med peritoneal karsinomatose. Gruppe B og C viste lignende mønster av kreft progresjon, men mindre aggressive.
Konklusjoner
første store dyremodell av peritoneal karsinomatose fra magekreft har blitt etablert av laparotomic orthotopic injeksjon av VX2 kreftceller inn i submucosal lag av magen , som gir en mer passende modell for kirurgiske intervensjonsstudier. De klinisk-patologiske trekk ved denne modellen ligner menneskelige peritoneal karsinomatose.
Bakgrunn
lokoregionalt progresjon av gastrointestinale og gynekologisk kreft ofte resulterer i peritoneal karsinomatose (PC), som er preget av tilstedeværelsen av tumorknuter av ulike størrelse, antall og fordeling i det peritoneale overflaten, med svært dårlig prognose, og en median overlevelse på mindre enn 6 måneder [1, 2]. Aktuelle behandlinger for en slik PC er systemisk kjemoterapi, best støtte omsorg og palliativ behandling, uten håp om helbredelse. For å takle dette problemet, en ny behandlingsform som kalles cytoreduserende kirurgi (CRS) pluss hyper intraperitoneal kjemoterapi (HIPEC) har blitt utviklet i løpet av de siste to tiårene, ta fordeler av kirurgi for å redusere synlige tumorbyrde, og regional hyper cellegift for å utrydde mikrometastaser [3-6].
Mens kliniske studier har gjort utvikler seg, har noen eksperimentelle dyre PC-modeller har også blitt utviklet, inkludert mus modeller og rottemodeller for å evaluere effekt og bivirkninger av eksperimentelle HIPEC protokoller [7-10]. Selv om slike små dyremodeller er nyttige i eksperimentelle studier, er det teknisk vanskelig å utføre operasjoner på små dyr på grunn av den lille kroppsstørrelse og delikate hemodynamiske betingelser. Stort dyr slik som gris har også blitt anvendt for å teste de farmakokinetiske egenskapene til HIPEC, men dyrene som ble brukt var friske griser i stedet for griser med PC [11]. Derfor er et stort dyr PC-modellen mer egnet for kirurgiske intervensjonsstudier er ønskelig. Her rapporterer vi på en kanin PC-modellen fra magekreft, med klinisk-patologiske trekk ligne pasienter med avansert magekreft.
Metoder for Dyr
trettiseks New Zealand hvite kaniner, 18 hanner og 18 hunner, kroppsvekt mellom 2,5 ~ 3,0 kg, ble hentet fra Animal biosikkerhetsnivå 3 Laboratory på Animal Experimental Center of Wuhan University (Animal Study Certificate SCXK 2003-0004). Dyrene ble individuelt plassert og fri adgang til standard laboratorium mat og vann, samt 12 timer med lys og mørke syklus per dag. Dyret studieprotokoll ble godkjent av Animal Welfare Committee for Senter.
Tumor belastning og tumor celle forberedelse
Rabbit VX2 karsinom ble brukt til å etablere magekreft med PC i denne studien. Den VX2 svulst er en transplant kanin plateepitelkarsinom, preget av rask tumorvekst og tidlig metastase, etablert fra en virus-indusert papilloma av Rous og medarbeidere [12]. Tumoren ble opprettholdt ved suksessiv in vivo
transplantasjon inn i bakbenet av 2 bære kaniner som brukes for hver passasje.
Når VX2-tumor vokste til omtrent 1 cm i diameter på bæreren kanin, ble dyret bedøvet ved øret veneinjeksjon av 3% natrium-pentobarbital (30 mg /kg). Etter preparering av huden og desinfeksjon, ble tumoren skåret ut fra bæreren kanin og anbringes i iskold 0,9% natriumkloridoppløsning. Tumorvev ble hakket til omtrent 1,0 ~ 2,0 mm 3 fragmenter og suspendert i 2 mL normal saltløsning, og deretter trukket inn i et 2 ml injektor. Andre tumorvev ca. 3,0 ~ 5,0 mm 3 ble plassert i homogenisatoren innleiret i isbad, til hvilken 3 ml iskald normal saltoppløsning ble tilsatt, og den tumorceller suspensjonen ble gjort, med det tumorceller konsentrasjonen justert til 5 × 10 10 hetteglass celler /l.
Bygging av magekreft med PC
Alle kaniner hadde faste over natten før forsøket, men vann ble gitt ad libitum
. Etter randomisering ble dyrene bedøvet ved ørevenen injeksjon av 3% natrium-pentobarbital (30 mg /kg). Abdominal hud ble rengjort og desinfisert. Tre tilnærminger ble vedtatt å bygge kaninmodeller av PC, 12 dyr i hver gruppe. Gruppe A av submucosal svulst celle inokulasjon: En midtlinjen snitt på 3 cm lang ble laget begynner 2 cm under xyphoid og øvre del av magen var åpen. Magen ble eksponert, 0,1 ml av tumorceller (5 x 10 10 ampulle celler /L) ble injisert i submucosal lag av magesekken (figur 1), gjennom den serøse laget og muskellaget, injeksjonsstedet var presset i 1 min for å holde de injiserte tumorcellene på plass, og magen ble lukket med et dobbelt lag 3-O Vicryl avbrutt sutur. Gruppe B av tumorvev implantasjon: Såret var den samme som i gruppe A. Når magen ble utsatt for, en liten del av fersk tumorvev omtrent 1,0 mm 3 ble implantert i større omentum umiddelbart under gastrisk antrum, og såret ble lukket. Gruppe C av perkutan injeksjon av tumorceller: Etter preparering av huden, 0,1 ml av tumorceller (5 x 10 10 ampulle celler /L) ble direkte injisert inn i den øvre bukhulen, og injeksjonsstedet ble presset i 1 minutt. Etter tumor-inokulering, penicillin G i en dose på 100.000 IU /d ble intramuskulært injisert i hvert dyr i 3 dager. Alle dyrene var gi intravenøs væske rehydrering med 100 ml 0,9% normal saltoppløsning. Figur 1 Bygging av kanin peritoneal karsinomatose modell fra magekreft. Når kaninen magen ble eksponert under generell anestesi, ble en 16 G nål satt inn gjennom de serøse og muskellagene inn i submucosal lag av magen, og 0,1 ml av tumorceller (5 x 1010 ampulle celler /L) ble injisert, og injeksjons nettstedet ble trykket i 1 min for å holde kreftceller på plass (se teksten for detaljert beskrivelse).
Animal observasjon og patologiske studier
etter operasjonen, ble daglig observasjon gjort på hver kanin å sjekke matinntak, aktiviteter, og eventuelle forstyrrelser som diaré og dehydrering. Den kroppsvekt ble målt hver 3. dag og den naturlige historien til sykdomsprogresjon ble registrert. For å oppnå en detaljert beskrivelse av den gradvise utvikling av magekreft PC, ble eutanasi utført på 3 kaniner i gruppe A på slutten av uke 1, 2, 3 og 4, ved overdose injeksjon av 3% pentobarbitalnatrium gjennom ørevenen . For dyr i gruppe B og C, ble dødshjelp også utføres når dyrene viste tydelige tegn på stress og avfall, i tråd med UKCCCR retningslinjer for velferden til dyr i eksperimentelle neoplasi [13]. Post mortem patologiske undersøkelser vist brutto patologi som tumorstørrelse og distribusjoner; lokale tumor funksjoner i magekreft inkludert sårdannelse, obstruksjon og perforasjon; særtrekk ved peritoneal karsinomatose som blodig ascites, diskrete eller konfluente tumornoduler på bukhinnen, kreft endringer i større omentum og tarm hindringer; metastaser til viktige organer som lever, binyrene, pankreas og lungene. Alle de mistenkte organ vev ble tatt prøver for rutinemessig undersøkelse histopatologi med delene farget med hematoxylin og eosin (HE flekke).
Statistisk analyse
kroppsvekt og tumorvekten ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (M ± SD). De intraabdominale metastaser og blodige ascites ble registrert som kjeder og medianverdier. SPSS statistisk programvare pakke versjon 10.0 (SPSS Inc., Chicago Il, USA) ble benyttet for analyse, med tosidig test, og P < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
Suksess for PC-modell bygging
av 36 dyr som brukes i PC-modell konstruksjon, operasjonen var vellykket i 33 kaniner og 3 dyr døde 3 dager etter operasjonen. Av de 3 dødsfall, en kanin i gruppe C døde av diffus peritonitt på dag 3 fordi perkutan injeksjon var feilaktig inn i tynntarmen; og en kanin hver i gruppe B og C døde av hjertesvikt på dag 2 på grunn av rask væske utvanning. En annen 3 kaniner i gruppe C ikke utvikle PC av ukjente grunner. Den suksessrate var 100% (12/12) i gruppe A, 91,7% (11/12) i gruppe B og 58,3% (7/12) i gruppe C (P = 0,019, A versus C; P = 0,077, B versus C. P = 0.500, A eller B, Fishers eksakte test)
tumorvekst og dens innvirkning på dyret
Etter kreftceller injeksjon i mage submucosa i gruppe A, viste svulsten akselerert vekst. Tumorstørrelsene ble (0,028 ± 0,012) cm 3, (1,183 ± 0,148) cm 3 og (7,706 ± 1,629) cm 3, henholdsvis ved slutten av uke 1, 2 og 3 . dyrene viste progressiv reduksjon i kroppsvekt, fra (2,48 ± 0,21) kg før operasjonen (2,45 ± 0,21) kg på uke 1, (2,24 ± 0,19) kg på uke 2, (2,02 ± 0,18) kg på uke 3 og (1,81 ± 0,1) kg på uke 4. Sammen med kroppsvektendringer, fôring og generell helsetilstand av dyrene forverret progressivt.
Vekst kjennetegn ved peritoneal karsinomatose i dyremodell
Tumor egenskaper i gruppe A ble nøye registrert . En uke etter submucosa injeksjon av kreftceller, begynte mange små, harde og transparente knuter til å utvikle seg på større omentum og antrum av magen. Ingen ascites ble observert. To uker senere, knuter på større omentum begynte å flette inn konfluente massene uten merkbar demarcations med magen. Massen på den gastriske vegg vokste seg større og stakk inn i bukhulen for å danne typisk ulcerøs kreft (figur 2). Det var omtrent 5 ml av blodige ascites i bukhulen. Tre uker senere mange knuter begynte å dannes i mesenteriet og bukvegg. Den sammenløpende masse på større omentum begynte å invadere leveren og omslutter magesekken (figur 3). Ofte magen masse og større omentum massen sammen til én stor svulst blokk. Blodig ascites kunne nå så mye som 100 ml. Det var også noen væskeansamling i hjerteposen. Mange knuter ble sett på bukveggen. Ingen knuter ble observert i lungene. Fire uker senere, ble en rekke tumorknuter observert i lungene, leveren, binyrene, tynntarm, tykktarm og tverrgående blæren. Bukveggen ble helt invadert av tumoren. Svulster i gruppe B og C viste lignende vekstegenskaper. Figur 2 Rabbit magekreft i gruppe A. To uker etter submucosal inokulering av VX2 kreftceller, patologisk studie etter dyr dødshjelp viser typisk ulcerøs magekreft (pil) i New Zealand kanin.
Figur 3 Rabbit PC-modell av mage opprinnelse fra gruppe A. Tre uker etter VX2 karcinomceller ble injisert i submucosal lag av magen, sammenflytende tumormasse på den større omentum innesluttet i magesekken (sort pil) og leveren (gul pil).
Histopatologiske egenskapene av VX2 kanin PC
Alle undersøkt vevsprøver viste omfattende invasiv vekst og ødeleggelse vev. Svulster, på den større krumning av gastrisk antrum, trengt inn i slimhinnen under dannelse av magesår. Mikroskopisk visningen kan finne kreft reir trengende hele magesekken, med typiske invasjon inn i muskelen lag og mage kjertler (Figur 4A). Tumorcellene er rund, oval eller atypisk morfologi med mange patologiske mitotiske figurer (figur 4B). Det var også synlige lymfocytter, plasmaceller og andre inflammatoriske celler infiltrering. Figur 4 Histopatologi av kanin modell magekreft med PC, var 2 uker etter VX2 carcinoma celler injisert i submucosal lag av magen i Gruppe A. VX2 kreftceller invadert hele magesekken (4A, × 100, HE flekker) og viste mange patologiske mitotiske tall (4B, × 200, HE flekken).
Hovedfunksjonene denne kanin modell av PC fra magekreft kan oppsummeres i tabell 1.Table 1 svulst kjennetegn ved tre forskjellige inokulasjon nærmer

Gruppe A
gruppe B
Gruppe C
Teknisk funksjonen
Laparotomic orthotopic
tumorcelle injeksjon i mage submucosa
Laparotomic orthotopic
svulstvev vaksinasjon under mage antrum
perkutan tumorcelle injeksjon i bukhinnen
suksess rate
100% (12/12)
91,7% (11/12)
58,3% (7/12)
Store patologiske hendelser
Rapid tumorprogresjon resulterer i respiratorisk distress syndrom, diffust peritonitt grunn perforasjon av mage tumor, intestinal obstruksjon, nyresvikt
Rapid tumorprogresjon som resulterer i intestinal obstruksjon, nyresvikt
Rapid tumorprogresjon som resulterer i intestinal vedheft en hindring, nyresvikt
Gross patologi
Ulcerøs magekreft med PC, ascites
Ulcerøs magekreft med PC, ascites
PC uten magesår, ascites
Histopatologi
Trengende veksten av kreftceller reir invaderer omkringliggende strukturer, tumor nekrose i den sentrale sonen av tumormasse
Fordeler
ligner mest klinisk magekreft med PC
Teknisk mindre vanskelig
Teknisk enkle
Ulemper
teknisk vanskelig
Ikke akkurat ligne magekreft med PC
Mistaken injeksjon i tarmen
diskusjon
PC representerer et alvorlig klinisk flagget i behandling av gastrointestinale og gynekologisk kreft. I magekreft, er PC en hyppig hendelse med 15% til 50% eller flere pasienter som har PC på kirurgisk leting, spesielt når det er serøse involvering av svulsten [14-16]. Selv etter kurativ reseksjon av magekreft, PC er fortsatt et stort problem av postoperativ tilbakefall. En koreansk studie i 500 magekreftpasienter behandlet av standardiserte radikal gastrektomi og lymphadectomy, fant at innen 5 år etter gastrektomi, er PC den hyppigste mønster (51,7%) av kreft tilbakefall [17]. En annen randomisert prospektiv studie i Japan har også funnet peritoneal gjentakelse er den hyppigste hendelse (15,8%) på 3 år i 530 pasienter behandlet med sterkt standardiserte kurativ gastrektomi [18]. En prospektiv italiensk studie hos 200 pasienter fant at på gjennomsnittlig oppfølgingstid på 42,3 måneder, sto PC for 32,9% av tilbakefall [19]. En annen italiensk studie med 441 mage kreftpasienter viste 17% PC tilbakefall med median oppfølging på 48 måneder [20]. Derfor er synkron og metachronous PC det viktigste problemet med magekreft tilbakefall og metastasering. Slike mage PC er assosiert med dårlig prognose med median overlevelse varierer fra 1-1,6 måneder [21, 22] til 3,1 til 9 måneder [1, 15]. Som det rette angitt, er risikoen for peritoneal tilbakefall av magekreft er særlig høy hos pasienter med diffus-blandet tumorer og infiltrasjon av serosa, mot hvilken kirurgi alene, uansett hvor radikalet kan by på liten mulighet for en kur [20]. Derfor er nye omfattende behandlingsstrategier nødvendig.
Kliniske studier tyder på at CRS pluss HIPEC kan oppnå god effekt hos utvalgte pasienter med PC. Så vidt vi vet er det 4 institusjonelle studier på CRS pluss HIPEC hos pasienter med magekreft, 2 retrospektiv (42 og 26 pasienter, henholdsvis) [3, 23], 1 potensielle (49 pasienter) [4] og en sammenlignende ikke-randomisert ( 34 pasienter) studier [24]. Median overlevelse varierte fra 6,6 måneder [24], 8 måneder [23] til 10-11 måneder [3, 4], og 5-års overlevelse varierte fra 6% [3, 25] 16% [4]. Disse kliniske studier er basert på ikke-homogene og ikke-standardiserte pasientgrupper. For å få mer objektivt vurdere slik behandling, er det nødvendig å studere denne behandlingsform under eksperimentelle betingelser.
Er etablert små dyremodeller av PC, inkludert nakne mus-modeller og rottemodeller [26-29]. I de fleste av disse dyremodeller, har kreftceller injiseres direkte inn i peritoneum, noe som vil resultere i utstrakt PC i rett tid [25, 30-32]. Alle disse små dyremodeller er bare egnet for HIPEC alene fordi den lille kroppsstørrelse og begrenset blodtilførsel ikke kan stå store kirurgiske inngrep. Etableringen av store dyremodell av PC fra magekreft er nødvendig for eksperimentelle studier testing CRS og HIPEC.
VX2 carcinoma er en kanin svulst i epitelial opprinnelse, etablert fra en virus-indusert papilloma av Rous og medarbeidere [12]. Preget av rask tumorvekst og tidlig metastase, er denne svulsten svært ondartet og kan allogeneously transplantert nesten hvor som helst i kaniner. Selv VX2 er en plateepitelkarsinom modell, som kan være forskjellig fra adenokarsinom, det har blitt brukt i mange eksperimentelle studier på hode og nakke kreft [33-36], lungekreft [37], spiserørskreft [38, 39], bryst kreft [40], magekreft [41, 42], leverkreft [43, 44], tykktarmskreft [45, 46], nyrekreft [47-49], blærekreft [50], bensvulst [51] og enkelt peritoneal karsinomatose [52]. I denne studien har vi konstruert en kanin modell av magekreft med PC. Våre resultater viste at ortotopisk inokulering av tumorceller i magen er den mest hensiktsmessige fremgangsmåten, noe som resulterer i typiske ulcerøs magekreft og progressiv PC, alle funksjoner som ligner på den klinisk-patologisk progresjon av magekreftpasienter. Til sammenligning kunne perkutan injeksjon av kreftceller i bukhulen resultere i tarmskader ved en feiltakelse. Ingen ulcerøs magekreft kan induseres, og svulsten ta hastigheten er lav. Disse resultatene understøtter ideen om at ortotopisk tumormodell er å foretrekke for studiet av tumor biologiske atferd og intervensjoner [53]. Den naturlige historien til denne modellen er ca 4 uker, inkludert et subklinisk scenen i den første uken, klinisk stadium i den andre uken, akselerert PC scenen i tredje uke og sluttfase i den fjerde uken. Typiske PC-funksjoner er peritoneal kreft knuter i forskjellige størrelser gjennom hele bukhulen, "omentum cake", intestinal obstruksjon og blodig ascites. Den ende av den første uken kunne betraktes som den tidlige PC, mens enden av den andre uken som den avanserte PC. Derfor kan spesifikke behandlingsmetoder være utformet for å målrette enten tidlig PC eller avansert PC.
Konklusjoner, En kanin modell av magekreft med PC er blitt etablert ved å injisere VX2 kreftceller inn i submucosal laget av magen. Modellen er preget av typisk ulcerøs magekreft med progressiv PC, noe som gjør den mer egnet for kirurgiske intervensjonsstudier for å evaluere CRS og HIPEC mot mage PC.
Merknader
Ligg-Jun Mei Xiao-Jun Yang bidratt likt til dette . arbeid
Erklæringer
Takk
Dette arbeidet ble støttet stiftelsen for forfatteren av National Excellent doktoravhandling of China (No FANEDD-200464); Science Fund for Creative Forskningsgrupper av Natural Science Foundation of China National (nr 20621502, 20921062).
Forfattere 'originale legges filer for Images Nedenfor er linkene til forfatternes opprinnelige innsendte filer for bilder. 12885_2009_1923_MOESM1_ESM.jpeg Forfatteroriginalfilen for figur 1 12885_2009_1923_MOESM2_ESM.jpeg Forfatteroriginalfilen for figur 2 12885_2009_1923_MOESM3_ESM.jpeg Forfatteroriginalfilen for figur 3 12885_2009_1923_MOESM4_ESM.jpeg Forfatteroriginalfilen for figur 4 12885_2009_1923_MOESM5_ESM.pdf Forfatteroriginalfilen for figur 6 konkurrerende interesser
forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende interesser.

• Doseavhengig hemming av gastrisk skade av hydrogen i alkalisk electrolyzed drikkevann water
• Undersøkelse av equine glandular magen lesjoner for bakterier, inkludert Helicobacter spp ved fluorescens in situ hybridisation