Estabelecimento e identificação de um modelo de coelho de carcinomatose peritoneal de cancer

gástrica estabelecimento e identificação de um modelo de coelho de carcinomatose peritoneal do câncer gástrico da arte abstracta
Fundo
O câncer gástrico carcinomatose peritoneal é um problema clínico comum, mas existem no apropriado modelos animais de grande porte para estudar este problema. Este estudo foi estabelecer um modelo de carcinomatose peritoneal de coelho estável de câncer gástrico utilizando tumor VX2, e analisar as características clínico-patológicas
Métodos
tumor VX2 foi implantado em 36 coelhos da raça Nova Zelândia por 3 métodos:. Injeção ortotópico laparotômica de células cancerosas para a camada da submucosa do estômago (Grupo a), a implantação de laparotomia de tecido de tumor no omento maior imediatamente abaixo do antro gástrico (Grupo B), e injecção percutânea de células tumorais directamente na cavidade peritoneal (Grupo C), 12 coelhos em cada grupo. Os animais foram observados de perto e estudos detalhados clínico-patológicos foram realizados.

Resultados As taxas de sucesso de formação de carcinomatose peritoneal foram de 100% (12/12), 91,7% (11/12) e 58,3% (7 /12), respectivamente, para os grupos a, B e C (P = 0,019, a versus C; P = 0,077, B contra C; P = 0,500, a versus B, o teste exato de Fisher). Duas semanas depois de as células cancerosas submucosa injecção no Grupo A, câncer gástrico ulcerativa com carcinomatose peritoneal mostrou patologia típica tumor VX2, com nódulos generalizadas intraperitoneal metastáticos, ascite sangrentas e metástases pulmonares perspícuas. O padrão de progressão clinico-patológico foi muito semelhante aos pacientes de câncer gástrico avançado com carcinomatose peritoneal. Grupos B e C apresentaram padrão semelhante de progressão do câncer, mas menos agressivo.
Conclusões
Primeiro modelo animal de grande porte de carcinomatose peritoneal do câncer gástrico foi estabelecida pela injeção ortotópico laparotômica de células cancerosas VX2 na camada submucosa do estômago , proporcionando um modelo mais adequado para estudos de intervenção cirúrgica. As características clínico-patológicas de este modelo se parecer com carcinomatose peritoneal humano.
Fundo
A progressão loco-regional de cancros gastrointestinais e ginecológicos freqüentemente resulta em carcinomatose peritoneal (PC), que se caracteriza pela presença de nódulos tumorais de diversos tamanho, número e distribuição sobre a superfície peritoneal, com muito mau prognóstico e uma sobrevivência média de menos de 6 meses [1, 2]. Os tratamentos atuais para tais PC são a quimioterapia sistêmica, melhores cuidados de suporte e terapia paliativa, sem esperança de cura. A fim de resolver este problema, uma nova modalidade de tratamento chamada de cirurgia cytoreductive (CRS) mais quimioterapia intraperitoneal hipertérmica (HIPEC) foi desenvolvido ao longo das últimas duas décadas, tendo vantagens da cirurgia para reduzir a carga tumoral visível, e quimioterapia hyperthermic regional para erradicar a micrometástases [3-6].
Enquanto os estudos clínicos têm feito progressos, alguns modelos experimentais animais de PC também têm sido desenvolvidos, incluindo modelos de ratos e modelos de ratos para avaliar a eficácia e efeitos adversos de protocolos experimentais HIPEC [7-10]. Embora tais modelos animais pequenos são úteis em estudos experimentais, é tecnicamente difícil de executar operações em animais de pequeno porte por causa do tamanho pequeno corpo e condições hemodinâmicas delicados. Animal de grande porte, tais como o porco, também foi usado para testar a farmacocinética do QIPHTO, mas os animais utilizados eram porcos saudáveis, em vez de porcos com PC [11]. Portanto, uma grande animal PC modelo mais adequado para estudos de intervenção cirúrgica é desejável. Aqui nós relatamos em um modelo de PC coelho de câncer gástrico, com características clínico-patológicas imitar pacientes com câncer gástrico avançado.
Métodos
Animais
Trinta e seis coelhos Nova Zelândia brancos, 18 homens e 18 mulheres, peso corporal entre 2,5 ~ 3,0 kg, foram obtidos a partir de Nível de Biossegurança animal 3 Laboratório no Centro Experimental animal da Universidade de Wuhan (estudo animal Certificado SCXK 2003-0004). Os animais foram alojados individualmente e permitido o acesso livre a comida padrão de laboratório e água, bem como 12 h de luz e escuro ciclo por dia. O protocolo do estudo animal foi aprovado pela Comissão do Centro de Bem-Estar Animal.
Estirpe Tumor e preparação de células tumorais
carcinoma Coelho VX2 foi usado para estabelecer câncer gástrico com PC neste estudo. O tumor VX2 é um carcinoma de células escamosas de coelho transplantáveis, caracterizada pelo crescimento rápido do tumor e metástases precoce, estabelecida a partir de um papiloma induzido por vírus por Rous e colaboradores [12]. O tumor foi mantido por sucessivos in vivo
transplante para a perna traseira de 2 coelhos transportador utilizado para cada passagem.
Quando o tumor VX2 cresceu a cerca de 1 cm de diâmetro, sobre o coelho transportador, o animal foi anestesiado por orelha injecção na veia de 3% de pentobarbital de sódio (30 mg /kg). Após a preparação da pele e desinfecção, o tumor foi excisado a partir do transportador de coelho e colocado em solução gelada de cloreto de sódio a 0,9%. O tecido tumoral foi picada em cerca de 1,0 ~ 2,0 milímetros 3 fragmentos e suspenso em 2 ml de solução salina normal, então arrastado para um injector de 2 mL. Outros tecidos tumorais cerca de 3,0 ~ 5,0 milímetros 3 foram colocados no homogeneizador incorporado no banho de gelo, ao qual foram adicionados 3 mL de solução salina normal gelada, e a suspensão de células tumorais foi feita, com a concentração de células tumorais ajustado para 5 × 10 10 células de frascos /l.
Construção de câncer gástrico com PC
Todos os coelhos tiveram o jejum durante a noite antes da experiência, mas foi dada água ad libitum
. Após a randomização, os animais foram anestesiados por injecção na veia da orelha de 3% de sódio pentobarbital (30 mg /kg). A pele abdominal foi limpo e desinfectado. Três abordagens foram adotadas para construir modelos de coelho de PC, 12 animais para cada grupo. Um grupo de inoculação de células tumorais submucosa: Uma incisão na linha média de 3 cm de comprimento foi realizado a partir de 2 cm abaixo da xifóide e a parte superior do abdómen foi aberto. O estômago foi exposto, 0,1 mL de células tumorais (5 × 10 10 células frasco /L) foi injectado na camada submucosa do estômago (Figura 1), através da camada serosa e camada muscular, o local de injecção foi de pressionado durante 1 min para manter as células de tumor injectadas no lugar, e o abdómen foi fechado com uma camada dupla Vicryl 3-o interrompido sutura. Grupo B do implante de tecido tumoral: A incisão foi o mesmo que no Grupo A. Quando o estômago foi exposto, um pequeno pedaço de tecido de tumor fresco cerca de 1,0 mm 3 foi implantado no omento maior imediatamente abaixo do antro gástrico, e a ferida foi fechada. Grupo C de injecção percutânea de células tumorais: Após a preparação da pele, 0,1 mL de células tumorais (5 × 10 10 células frasco /L) foi injectado directamente para dentro da cavidade abdominal superior, e o local da injecção foi pressionado durante 1 min. Após inoculação do tumor, penicilina G na dose de 100 mil IU /d foi injectada por via intramuscular a cada animal durante 3 dias. Todos os animais foram re-hidratação dar fluido intravenoso com 100 ml de solução de solução salina normal a 0,9%. Figura 1 Constituição do coelho modelo de carcinomatose peritoneal do câncer gástrico. Quando o estômago de coelho foi exposto, sob anestesia geral, uma agulha G 16 foi inserido através da serosa e musculares camadas para a camada da submucosa do estômago, e 0,1 mL de células tumorais (5 × 1010 frasco células /L) foram injectados, e injecção local foi pressionado por 1 min para manter as células tumorais no lugar (Veja o texto para uma descrição detalhada). observação
animal e estudos patológicos
Após a operação, observação diária foi feita em cada coelho para verificar a ingestão de alimentos, atividades, e quaisquer anomalias, tais como diarreia e desidratação. O peso corporal foi medido a cada 3 dias e a história natural da evolução da doença foi registado. De modo a obter uma descrição detalhada do desenvolvimento progressivo de PC cancro gástrico, a eutanásia foi realizada em 3 coelhos do grupo A, no final das semanas 1, 2, 3 e 4, por injecção overdose de pentobarbital sódico 3% através da veia da orelha . Para os animais nos Grupos B e C, a eutanásia também foi realizada quando os animais apresentaram sinais óbvios de aflição e de resíduos, de acordo com as diretrizes UKCCCR para o bem-estar dos animais em neoplasia experimental [13]. Post mortem exames patológicos incluídos patologia grave, tais como tamanho do tumor e distribuições; características tumorais locais de câncer gástrico, incluindo formação de úlcera, obstrução e perfuração; características especiais de carcinomatose peritoneal, tais como ascite sangrentas, nódulos tumorais discretos ou confluentes no peritônio, mudanças cancerosas no omento maior e obstruções intestinais; metástases para órgãos importantes, tais como o fígado, glândulas supra-renais, pâncreas e pulmões. Todos os tecidos de órgãos suspeitos foram amostradas para o estudo histopatológico de rotina com cortes corados pelo HE (HE).
Análise estatística
O peso corporal e peso do tumor foram expressos como média ± desvio padrão (M ± SD). As metástases intra-abdominais e ascite sangrentos foram registrados como faixas e medianas. O pacote de software estatístico SPSS versão 10.0 (SPSS Inc., Chicago IL, EUA) foi utilizado para análise, com o teste de dois lados, e P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Resultados
sucesso do modelo de PC construção
Dos 36 animais utilizados para construção do modelo PC, a operação foi bem sucedida em 33 coelhos e 3 animais morreram 3 dias após a operação. Dos 3 mortes, um coelho do grupo C morreram de peritonite difusa no dia 3, porque a injecção percutânea foi erroneamente para o intestino delgado; e 1 coelho de cada nos grupos B e C morreu de insuficiência cardíaca congestiva, porque no dia 2 de re-hidratação rápida do fluido. Outros 3 coelhos do Grupo C não desenvolveram PC por razões desconhecidas. As taxas de sucesso foram de 100% (12/12) no Grupo A, 91,7% (11/12) no Grupo B e 58,3% (7/12) no Grupo C (P = 0,019, A versus C; P = 0,077, B contra C;. P = 0,500, a versus B, o teste exato de Fisher) o crescimento
tumor e seu impacto sobre o
animais Após a injeção células cancerosas na submucosa gástrica no Grupo a, o tumor demonstrou crescimento acelerado. Os tamanhos dos tumores eram (0,028 ± 0,012) cm 3, (1,183 ± 0,148) cm 3 e (7,706 ± 1,629) cm 3, respectivamente, no final das semanas 1, 2, e 3 . Os animais apresentaram diminuição progressiva do peso corporal, a partir de (2,48 ± 0,21) kg antes da operação de (2,45 ± 0,21) kg na semana 1, (2,24 ± 0,19) kg na semana 2, (2,02 ± 0,18) kg na semana 3 e (1,81 ± 0,1) kg na semana 4. Junto com mudanças de peso do corpo, o estado de alimentação e saúde geral dos animais deteriorou progressivamente.
características de crescimento de carcinomatose peritoneal em modelo animal
características dos tumores no Grupo a foram cuidadosamente registrados . Uma semana após a injecção das células cancerosas submucosa, muitos pequenos nódulos, duros e transparentes começou a desenvolver-se no omento maior e o antro do estômago. Não foi observada ascite. Duas semanas depois, nódulos na omento maior começaram a fundir-se em massas confluentes, sem demarcações discerníveis com o estômago. A massa na parede gástrica cresceu mais e se projetava para dentro da cavidade do estômago para formar o câncer ulcerativa típica (Figura 2). Havia cerca de 5 ml de ascite ensanguentadas na cavidade abdominal. Três semanas mais tarde, muitos nódulos começou a se formar no mesentério e no retroperitônio. A massa confluente no omento maior começou a invadir o fígado e encerrar o estômago (Figura 3). Muitas vezes a massa estômago e omento maior massa fundidos em um bloco de tumor grande. Sangrentos ascite pode chegar a até 100 mL. Houve também alguma acúmulo de líquido no pericárdio. Muitos nódulos foram vistos na parede abdominal. Não foram observados nódulos nos pulmões. Quatro semanas mais tarde, numerosos nódulos tumorais foram observados nos pulmões, o fígado, glândulas adrenais, intestino delgado, cólon transversal e da bexiga. A parede abdominal foi totalmente invadida pelo tumor. Os tumores nos grupos B e C mostraram características de crescimento semelhantes. Figura câncer gástrico 2 Coelho no grupo A. Duas semanas após a inoculação submucosa de células tumorais VX2, estudo patológico após a eutanásia de animais mostra câncer gástrico ulcerativa típico (seta) na Nova Zelândia coelho.
Figura modelo de PC 3 Coelho de origem gástrica de Grupo A. Três semanas após as células de carcinoma VX2 foram injectados para dentro da camada da submucosa do estômago, a massa tumoral confluente sobre a parede do estômago maior omento envolto (seta preta) e o fígado (seta amarela).
características histopatológicas de PC VX2 de coelho
Todos os espécimes tumorais investigadas mostraram grande crescimento invasivo e destruição dos tecidos. Os tumores, na curvatura maior do antro gástrico, penetrou na camada da mucosa para formar úlceras. vista microscópico pode encontrar ninhos cancerosas penetram toda a parede do estômago, com invasão típica para a camada muscular e as glândulas gástricas (Figura 4A). As células tumorais são redondos, oval ou morfologia atípica com muitas figuras mitóticas patológicos (Figura 4B). Há também foram evidentes linfócitos, células plasmáticas e outro a infiltração de células inflamatórias. Figura 4 A histopatologia do cancro gástrico modelo de coelho com o PC, 2 semanas após as células de carcinoma VX2 foram injectados para dentro da camada submucosa do estômago em células de tumor VX2 Grupo A. invadido a parede do estômago inteiro (4A, 100 ×, HE) e mostrou muitos figuras de mitose patológicas (4B, × 200, HE mancha)
. As características principais deste modelo de coelho de PC de câncer gástrico poderia ser resumido na Tabela 1 1.Table características dos tumores de três inoculação diferentes abordagens

B
Grupo C recurso técnico Grupo A
Grupo
célula tumoral ortotópico
laparotômico injeção na submucosa gástrica
laparotômico inoculação tecido
tumor ortotópico abaixo do antro gástrico
injecção de células tumorais percutânea para o peritônio
taxa de sucesso
100% (12/12)
91,7% (11/12)
58,3 principais eventos patológicos
progressão tumoral rápida, resultando em síndrome do desconforto respiratório% (7/12)
, peritonite difusa devido à perfuração de tumor gástrico, obstrução intestinal, insuficiência renal
progressão rápida do tumor, resultando em obstrução intestinal, insuficiência renal
progressão rápida do tumor, resultando em aderência intestinal uma obstrução, insuficiência renal
patologia Gross
câncer gástrico ulcerativa com PC, ascite
câncer gástrico ulcerativa com PC, ascite
PC sem úlcera gástrica, ascite
Histopatologia
crescimento penetrante de ninhos de células cancerosas que invadem estruturas vizinhas, necrose tumoral na zona central da massa tumoral as vantagens
mais se assemelham câncer gástrico clínica com PC
tecnicamente menos difícil
Tecnicamente
Desvantagens fáceis
tecnicamente difícil
Não exatamente imitar câncer gástrico com PC
injecção Mistaken para o intestino
Discussão
PC representa um sério clínica desafio no tratamento de cancros gastrointestinais e ginecológicos. No cancro gástrico, PC é um evento frequente, com 15% a 50% ou mais pacientes com PC na exploração cirúrgica, especialmente quando há comprometimento da serosa pelo tumor [14-16]. Mesmo após a ressecção curativa de câncer gástrico, PC continua a ser um grande problema de recidiva pós-operatória. Um estudo coreano em 500 pacientes com câncer gástrico tratado por gastrectomia radical padronizado e lymphadectomy, descobriu que dentro de 5 anos após a gastrectomia, PC é o padrão mais frequente (51,7%) de recorrência do câncer [17]. Outro estudo prospectivo randomizado no Japão também constatou recidiva peritoneal é o evento mais freqüente (15,8%) em 3 anos em 530 pacientes tratados com gastrectomia curativa altamente padronizado [18]. Um estudo italiano prospectivo em 200 pacientes constatou que, no seguimento médio de 42,3 meses, PC foi responsável por 32,9% de recorrência [19]. Outro estudo italiano com 441 pacientes com câncer gástrico mostrou 17% PC recorrência no período de acompanhamento médio de 48 meses [20]. Portanto, PC síncrona e metacrônica é o problema mais importante de recorrência do câncer gástrico e metástase. Tal PC gástrico está associada com prognóstico ruim, com sobrevida média variando de 1-1.6 meses [21, 22] para 3,1-9 meses [1, 15]. Como é justamente afirmou, o risco de recidiva peritoneal do câncer gástrico é particularmente elevado em pacientes com tumores misturados-difusos e infiltração da serosa, contra a qual a cirurgia sozinha, não importa quão radical, pode oferecer pouca possibilidade de uma cura [20]. Portanto, novas estratégias de tratamento abrangentes são necessários.
Estudos clínicos sugerem que CRS mais HIPEC poderia conseguir boa eficácia em pacientes selecionados com PC. Para o nosso conhecimento, há 4 estudos institucionais sobre CRS mais HIPEC em pacientes com câncer gástrico, 2 retrospectiva (42 e 26 pacientes, respectivamente) [3, 23], 1 prospectivos (49 pacientes) [4] e 1 comparativo não randomizado ( 34 pacientes) estudos [24]. A sobrevida média variou de 6,6 meses [24], 8 meses [23] para 10-11 meses [3, 4], ea sobrevida em 5 anos variaram de 6% [3, 25] para 16% [4]. Estes estudos clínicos estão baseados em grupos não homogéneos e não-estandardizados de pacientes. A fim de avaliar de forma mais objetiva tal tratamento, é necessário estudar esta modalidade de tratamento em condições experimentais.
Modelos animais de pequeno porte de PC foram estabelecidas, incluindo modelos de ratinhos nus e modelos de ratos [26-29]. Na maior parte destes modelos animais, as células cancerosas são injectados directamente no peritoneu, o que resultará em PC generalizada em devido tempo [25, 30-32]. Todos estes pequenos modelos animais só são adequados para sozinho HIPEC porque o tamanho do corpo pequeno e fornecimento de sangue limitada não pode suportar grandes intervenções cirúrgicas. O estabelecimento de um modelo animal de grande porte do PC do câncer gástrico é necessário para experimental CRS testes estudos e HIPEC.
Carcinoma VX2 é um tumor coelho de origem epitelial, estabelecida a partir de um papiloma vírus-induzida por Rous e colegas de trabalho [12]. Caracterizada pelo crescimento tumoral rápida e metástase cedo, este tumor é extremamente maligno e pode ser allogeneously transplantado em quase qualquer lugar em coelhos. Embora VX2 é um modelo de carcinoma de células escamosas, que pode ser diferente do adenocarcinoma, ele tem sido usado em muitos estudos experimentais sobre câncer de cabeça e pescoço [33-36], o cancro do pulmão [37], câncer de esôfago [38, 39], peito câncer [40], câncer gástrico [41, 42], câncer de fígado [43, 44], câncer de cólon [45, 46], câncer renal [47-49], o cancro da bexiga [50], tumor ósseo [51] e simples carcinomatose peritoneal [52]. Neste estudo, nós construímos um modelo de coelho de câncer gástrico com PC. Os nossos resultados demonstraram que a inoculação de células tumorais ortotópico no estômago é o método mais adequado, resultando em cancro gástrico típico ulcerativa e PC progressiva, todas as características semelhantes à progressão clínico-patológico de doentes com cancro gástrico. Em comparação, a injeção percutânea de células de câncer na cavidade abdominal pode resultar em ferimentos intestinal por engano. No câncer gástrico ulcerativa pode ser induzida, e a taxa de absorção do tumor é baixa. Estes resultados suportam a noção de que o modelo de tumor ortotópico é o preferido para o estudo de tumores comportamentos biológicos e intervenções [53]. A história natural deste modelo é cerca de 4 semanas, incluindo uma fase subclínica na primeira semana, estágio clínico na segunda semana, fase acelerada PC na terceira semana e fase terminal na quarta semana. As características típicas de PC são nódulos de câncer peritoneal de vários tamanhos ao longo de toda a cavidade abdominal, "bolo de omento", obstrução intestinal e ascite sangrentas. O fim da primeira semana pode ser considerado como o início de PC, enquanto que o fim da segunda semana como o PC avançado. Portanto, abordagens de tratamento específicas poderiam ser concebidas para atingir qualquer PC cedo ou PC avançado.
Conclusões
Um modelo de coelho de câncer gástrico com PC foi estabelecida através da injeção de células cancerosas VX2 na camada submucosa do estômago. O modelo é caracterizado por câncer gástrico ulcerativa típico com PC progressivo, tornando-o mais adequado para estudos de intervenção cirúrgica para avaliar CRS e HIPEC contra PC gástrico.
Notas
Deite-Jun Mei, Xiao-Jun Yang contribuíram igualmente para este . trabalho
Declarações
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado Fundação para o Autor da National Excelente Tese de Doutorado da China (Sem FANEDD-200464); o Fundo de Ciência para Grupos pesquisa criativa da National Science Foundation Natural da China (No. 20621502, 20921062).
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Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.

• inibição dependente da dose de lesão gástrica por hidrogênio em água potável electrolyzed alcalina
• O exame de lesões no estômago glandular equinos para bactérias Helicobacter spp, incluindo por hibridização fluorescente in situ