PLoS ONE: Casticin stiprina TRAIL sukeltos Apoptozę skrandžio vėžio ląsteles per Endoplazminis tinklas Stress

Anotacija

Fonas

Casticin yra vienas iš pagrindinių aktyvių komponentų, gautų iš FRUCTUS Viticis
ir buvo pranešta, kad daryti antikancerogenas veiklą nuo vėžinių ląstelių įvairovė, tačiau tiksli mechanizmo, lemiančio šią veiklą lieka neaiškus.

medžiagos ir metodai

Apoptozė veikla casticin (1,0 mkmol /l) ir TRAIL (25, 50 ng /ml) vienas ar derinyje su skrandžio vėžio ląstelių linijų bgc-823, SGC-7901 ir mgC-803 buvo aptikta skirtą ląstelių apoptozės ELISA nustatymo rinkinys naudoti, tėkmės citometrijos ( FCM) su propidiumo jodido (PI) dažymo ir veiklos kaspaze 3 -8 ir -9 ELISA ir atskėlimo polyADP-ribozės polimerazė (PARP) baltymų, naudojant Vakarų dėmė analizė. Mirtis receptorių (AT) ekspresijos lygis buvo įvertintas naudojant FCM analizę ir Imunoblotingo. 2 ', 7'-dichlorfluoresceino diacetatas (DCFH-DA) buvo naudojamas kaip zondo iki matuoti aktyvių deguonies formų (ROS) kiekis kraujyje, ląstelėse padidėjimą. Keli intervencijos, pavyzdžiui, siRNA transfekciją ir farmakologinių inhibitoriais buvo naudojami ištirti šių veiksmų mechanizmus.

Rezultatai

Subtoxic koncentracijos casticin žymiai stipresnė TRAIL sukeltos toksiškumą ir apoptozę bgc-823, SGC-7901 ir MSV-803 ląstelių. Casticin dramatiškai aktyvinama DR5 receptorių ekspresijos, bet neturėjo apie DR4 ar masalui receptorių poveikį. Išbraukus DR5 pagal siRNA žymiai sumažino apoptozę sukelto bendro taikymo TRAIL ir casticin. Genai yra nuslopinami iš CCAAT /stipriklis privalomas baltymų homologinės baltymų (CHOP) ir pirminio gydymo salubrinal, Endoplazminis tinklas (ER) stresas inhibitorius, susilpnintas casticin sukeltos DR5 receptorių ekspresijos ir apoptozę ir ROS gamybą. Casticin downregulated ekspresijos lygį mobilųjį išgyvenimo baltymų cFLIP, BCL-2, XIAP ir survivin. Be to, casticin taip pat paskatino iš DR5 baltymų išraiškas kituose skrandžio vėžio ląstelių (SGC-7901 ir MSV-803).

Išvada /Reikšmė

Casticin pagerina TRAIL sukeltos apoptozės per downregulation ląstelių išgyvenimo baltymų bei DR5 receptorių ląstelę per veiksmų ROS-ER streso CHOP keliu

nurodomoji dalis:. Zhou Y Tian L, Rimta L Quan, M, Liu F Cao J (2013) Casticin stiprina TRAIL sukeltos apoptozės skrandžio vėžio ląsteles per Endoplazminis tinklas stresą. PLoS ONE 8 (3): e58855. Doi: 10,1371 /journal.pone.0058855

redaktorius: Kaustubh Datta, Nebraskos universitetas medicinos centras, Jungtinių Amerikos Valstijų

Įstojo: Gegužės 11, 2012 m Priėmė: Vasario 8, 2013 m Paskelbta: Kovo 11, 2013

Visos teisės saugomos: © 2013 Zhou et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas buvo palaikomas NSFC projektą (skaičius 30.760.248), mokslo tyrimų Hunan provincijos administracija Biuro tradicinės kinų medicinos (skaičius 2.010.081), mokslo tyrimų Hunan provincija Project, švietimo departamento projekto (skaičius 10C0975), pagrindinių Projektų punktas mokslinio tyrimo Hunan provincijos švietimo departamentas (skaičius 09A054) ir mokslinio tyrimo Changsha miesto biuras mokslo ir technologijų (skaičius K1104060-31) projektą. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

, fructus Viticis
( Manjingzi
yra Kinijos pavadinimas) būtent vaisius Vitex trifolia L. pervežimas (šeimos, Verbenaceae
) kad yra tradicinės kinų medicinos naudojamas kaip priešuždegiminis agentas. Casticin yra viena iš veikliųjų komponentų, gautų iš FRUCTUS Viticis
[1]. Daug tyrimai parodė, kad casticin daro antikancerogenas aktyvumas krūties [2], gimdos kaklelio [3], prostatos [4], plaučių ir storosios žarnos vėžio [5], [6], taip pat į skrandžio vėžio [7] in vitro
. Taip pat buvo pranešta, kad casticin slopina žmogaus mieloidine leukemijos ląstelių [8] augimą ir skatina leukemijos ląstelių mirtį bet kurios apoptozės ar mitoziniam katastrofos [9].

Neseniai ankstesniame darbe nuo indukcijos Mūsų laboratorijoje nurodė, kad casticin poveikis apoptozės žmogaus kepenų ląstelių karcinoma ląstelių dalyvauja DR5 būdo nepriklausomai nuo p53 [10] statusą. Jis buvo dokumentuota, kad CCAAT /stipriklis surišantis baltymas homologiczne baltymų (CHOP schemą), taip pat žinomas kaip augimo arešto ir DNR pažaidos geno 153 (GADD153), tiesiogiai reguliuoja DR5 išraišką per CHOP privalomu svetainėje per 5-gretutinė regione DR5 geno [11], [12]. Mes, ir kiti, pranešė, kad kai kurie vaistai, pavyzdžiui, 5, 7-dimethoxyflavone ir dimetil-celekoksibas, sukelti DR5 išraiška per CHOP-priklauso transactivation į DR5 geno [13] - [15]. Be to, keli tyrimai parodė glaudų ryšį tarp Endoplazminis tinklas (ER) streso ir DR5 išraiška. ER stresas yra sukeliama, kai prasidėjusios baltymai kaupiasi ER spindyje [16]. Atrodo, kad šis atsakymas gali aktyvuoti konkrečias apoptozinių kelius pašalinti stipriai pažeistų ląstelių, kuriuose baltymų lankstymo defektai negali būti išspręsti [17], [18]. Įvairūs ER streso induktoriai, pvz MG132 [12], tunicamycin [19] ir thapsigargin [20], nuolat indukuoja DR5 išraišką ląstelių paviršiuje. Nors molekuliniai mechanizmai DR5 baltymų raiškos er streso induktoriais, gali skirtis dirgiklius ir ląstelių tipų, ER streso indukuojamąją transkripcijos faktorius, pjaustyti, suteikė tarp ER streso ir DR5 nuorodą. Tačiau, ar casticin skatina DR5 išraišką skrandžio vėžio ląsteles ir jei taip, molekulinio mechanizmo pobūdžiui nežinoma.

Neseniai atliktas tyrimas parodė, kad veiksminga naviko nekrozės faktoriaus α susijusių apoptozė skatinančius ligandas ( TRAIL) pagrįsti kombinuotas gydymas gali būti pasiektas upregulating DR4 ir DR5 išraiška, ir tiesiogiai skirta vėžinių ląstelių mitochondrijas skatinti jų apoptozę sukeliančių savybių. [21] Iš mitochondrijų sugebėjimą perteikti apoptozę yra griežtai reguliuojamas narių Bcl-2 superfamily [22]. Slopina kovos su Apoptozė baltymo ekspresija, su RNR ar siRNA, buvo įrodyta, kad atkreipti vėžines ląsteles takas [23]. Kaip rezultatas, agentų, kurie downregulate tokius anti-apoptozinių baltymų, kaip survivin, korinio FADD-kaip interleukino-1β konvertuojančio fermento slopina baltymų (cFLIP), BCL-2, o su X chromosoma susijusi inhibitorių apoptozės baltymų (XIAP) potencialiai gali įjautrinti vėžio ląstelės į apoptozės poveikio TRAIL [23], [24].

šios studijos, todėl mes sutelktas į tiria, ar casticin stiprina TRAIL sukeltos vėžinių ląstelių apoptozę, o jei taip, tai kaip casticin stiprina tai poveikis. Mes nustatėme, kad casticin sustiprėti TRAIL sukeltos apoptozės iki upregulating DR5 per ROS-ER streso CHOP keliu ir downregulating ląstelės išgyvenimo baltymų BCL-2, XIAP, cFLIP ir survivin išraišką skrandžio vėžio ląsteles.

rezultatai

Subtoxic koncentracijos casticin selektyviai sustiprina TRAIL sukeltos citotoksiškumo skrandžio vėžio ląstelių

iš casticin ir takas, atskirai arba kartu citotoksiškumo, buvo tiriamas žmogaus skrandžio vėžio linijų BGC- 823, SGC-7901 ir MSV-803, kurią nustato MTT. vien Casticin ir TRAIL sukelia citotoksinį poveikį skrandžio vėžio ląstelių, nuo koncentracijos priklausomu būdu (skaičiai 1A ir B). Šiek tiek citotoksiškumo (< 20%) buvo pastebėtas už mažesnę koncentraciją casticin (1,0 mkmol /l, 1A pav). Gydyti skrandžio vėžio ląstelių su 25-50 ng /ml TRAIL 24 h sukeltų ribotą citotoksiškumą (< 20%). Tačiau bendrai gydymas skrandžio vėžio ląstelių su casticin (1,0 mkmol /l) ir takas (25 ng /ml arba 50 ng /ml) ženkliai padidino citotoksinių efektų, palyginti su gydymo casticin ar TRAIL vien (1c pav).

Kadangi mes nustatėme, kad kombinuotas gydymas su casticin ir TRAIL stipriai sukeltas citotoksiškumo skrandžio vėžio ląsteles, kitą kartą nagrinėjo gydymo dėl įamžino žmogaus skrandžio gleivinės epitelio ląstelių linijos GES-1 poveikį. Įdomu tai, kad casticin ir TRAIL derinys nesukėlė citotoksiškumo į GES-1 ląstelių (1d pav) .Šios rezultatai rodo, kad subtoxic koncentracijos casticin selektyviai įjautrintos žmogaus skrandžio vėžio ląsteles Trail sukeltas citotoksiškumo.

Subtoxic koncentraciją iš casticin atkreipti skrandžio vėžio ląsteles takas sukeltos apoptozė

Jei ištirti, ar apoptozė dalyvauja ląstelių augimo slopinimą po bendro gydymo casticin ir takas, mes pirmiausia išnagrinėjo apoptozę, naudojant srauto citometrijos analizę, siekiant nustatyti padidėjimo hypodiploid ląstelių populiacijos. Tyrimo rezultatai atskleidė, kad apoptozės norma buvo 3,78 ± 1,3%, 4,69 ± 1,7% ir 37,1 ± 4,9% (vidurkis ± SD N
= 3), casticin (1 mkmol /l), takas (50 ng /ml) ir casticin plius TRAIL, atitinkamai (2A pav). Sub-G1 gyventojų BGC-823 ląstelių buvo gerokai padidėjo 12 h, ir pasiekė 24 val po pirminio 1 mikromoliai /l casticin po 50 ng /ml, takas (2B pav.) Mes šalia nustatomas histono /DNR fragmentas lygių skrandžio vėžio ląstelių linijų BGC-823, SGC-7901 ir MSV-803, naudojant ląstelių apoptozę ELISA aptikimo rinkinį. 2C pav rodo, kad kombinuotas gydymas nuo casticin ir TRAIL sąveikauja sukeltas histono /DNR fragmentaciją. Histono /DNR fragmentas lygiai bgc-823 buvo padidėjusi po 12 h ir pasiekė 24 val po bendro gydymo casticin (1 mkmol /l) ir takas (50 ng /ml, 2D pav.)

kitas išnagrinėti, ar kaspazių tikrųjų buvo aktyvuota indukcijos apoptozės ląstelių mirtis kombinuotąją gydymo casticin ir takas skrandžio vėžio ląstelių metu. Gydymas gastic vėžinių ląstelių vien 24 h 1 mikromoliai /L casticin nesukėlė jokio kaspazės-3 aktyvumą, -8 ir -9. Atsakydama į takas (50 ng /ml), iš kaspaze 3 veikla, -8 ir -9 nepakeitė. Tačiau kombinuotas gydymas iš casticin ir TRAIL paskatino kaspazės-3 ir -8 ir šiek tiek aktyvuota kaspazė-9 aktyvinimas (2 pav E, F ir G).

Mes taip pat patikrinti, kokia kaspazė buvo konkrečiai aktyvuota atsakas į casticin ir TRAIL gydymas naudojant kaspazės inhibitoriai, įskaitant visos kaspazės inhibitorių zVAD-FMK, kad kaspazės-3 inhibitorių zDEVD-FMK, kad kaspazės-8 inhibitorių zIETD-FMK ir kaspazės-9 inhibitorių zLEHD-FMK. Kaip parodyta 2e pav zVAD-FMK, zDEVD-FMK ir zIETD-FMK žymiai sumažėjo veiklos kaspazės-3 sukeltos Kombinuotosios gydymo casticin ir TRAIL lygį, bet zLEHD-FMK turėjo nedidelį poveikį. zVAD-FMK ir zIETD-FMK vienu metu gali visiškai blokuoti kaspazės-8 aktyvavimo, ir zDEVD-FMK dalinai blokavo aktyvacijos kaspazės-8; Tačiau zLEHD-FMK turėjo mažai įtakos aktyvacijos būseną kaspazės-8 (2F pav). Atitinkamai, mes nustatėme, kad kaspazės-9 buvo šiek tiek suaktyvinti ląstelių gydomiems casticin ir TRAIL bet ne ląstelėse gydomiems casticin ir takas z-IETD-FMK, zVAD-FMK ir zLEHD-FMK (2G pav) buvimą. Bendrai, šie rezultatai rodo, kad casticin su TRAIL to skatina kaspazės-8 aktyvacijos prieš kaspazės-9 aktyvavimo [10].

Mes pagaliau ištirti, ar casticin galėtų sustiprinti TRAIL sukeltos PARP skilimo ir nustatė, kad casticin sustiprintas Trail-pasiţymėjo į PARP skilimo padidinti BGC-823 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 ląstelių (2H pav). Šie rezultatai tvirtai reikšti, kad subtoxic koncentracija casticin pagerina TRAIL sukeltos apoptozės skrandžio vėžio ląsteles.

Casticin skatina į DR5 išraišką skrandžio vėžio ląstelių

Apoptozę iš kepenų ląstelių karcinoma ląstelių sukeltų casticin dalyvavo DR5 ląstelę [10]. Todėl mes traktuojami BGC-823 ląstelių casticin 24 val ir tada naudojamas Vakarų dėmė analizę išnagrinėti galimybes TRAIL receptorių ekspresijos ląsteles. Casticin padidėjo DR5 išraišką koncentracijos priklausomu būdu, bet neturėjo DR4 raiškos nei DcR1 ar DcR2 indukcijos (3a paveikslas) poveikį. Indukcija DR5 išraiškos casticin įvyko 6 val ir pasiekė 24 h (3b pav.) Šie rezultatai rodo, kad DR5 ląstelę yra kandidatas mechanizmas, per kurį casticin pagerina apoptozės poveikį takas BGC-823 ląstelių.

Norėdami nustatyti, ar DR ant ląstelės paviršiaus buvo dalyvauja apoptozės indukcijos casticin, ląstelių paviršius išraiška DR5 ir DR4 buvo stebimas naudojant tėkmės citometrijos metodą. Po ląstelių poveikio casticin (1,0 mkmol /l), iš DR5 lygis ląstelių paviršiuje buvo padidintas (3C pav.) Tačiau casticin nebuvo paveikti DR4 išraiškos (3D paveikslas) lygį. Bendrai, šie rezultatai rodo, kad casticin upregulates į DR5 išraiška ląstelių paviršiuje.

Ar ląstelę DR5 iki casticin yra specifinė BGC-823 ląstelių arba taip pat pasitaiko kitų skrandžio vėžio ląstelių linijų, taip pat buvo tiriamas. Casticin sukeltas DR5 išraišką skrandžio vėžio SGC-7901 ir MSV-803 ląstelių linijas, bet neturėjo akivaizdžių padarinių jos išraiška įamžinimas skrandžio gleivinės GES-1 ląstelių linijos (3E pav.) Kartu šie rezultatai rodo, kad DR5 ląstelę iki casticin nėra būdingas tam tikro tipo skrandžio vėžio ląstelių.

DR5 indukcijos casticin yra reikalingas TRAIL sukeltos apoptozės gerinimo bgc-823 ląstelių

Norėdami nustatyti DR5 receptorių vaidmuo TRAIL sukeltos apoptozės tobulintų casticin, mes panaudojome siRNA būdingą DR5 į downregulate savo išraišką. Transfekcijq ląstelių su siRNA už DR5 bet ne su kontroline siRNA sumažino casticin sukeltas DR5 išraiška.

Jei išnagrinėti, ar DR5 ląstelę apima casticin padidinto TRAIL sukelta skrandžio ląstelių apoptozę, tėkmės citometrijos analizę buvo naudojamas patikrinti, ar slopinimas DR5 išraiška pagal siRNA gali sušvelninti iš casticin poveikį TRAIL sukeltos apoptozės. 4B paveiksle matyti, kad casticin poveikis TRAIL sukeltos apoptozės buvo efektyviai sumažėjo ląstelių transfektuotose DR5 siRNA, o ląstelės transfektuotose kontrolės siRNA nepakito. Kartu paėmus, šie rezultatai rodo, kad DR5 indukcija yra labai svarbus jautrinimo vėžinių ląstelių iš casticin poveikio TRAIL sukeltos apoptozės.

Casticin sukeltos DR5 ląstelę tarpininkaujant per indukcijos CHOP į bgc-823 ląstelių

CHOP schemą tarpininkaujant ląstelę DR5 buvo įrodyta [11] - [15]; Todėl kitą kartą ištirta kaip tai transkripcijos faktorius gali būti įtraukti į casticin sukeltos DR5 ląstelę. 5A paveiksle matyti, kad casticin sukeltas CHOP išraišką, kuri vyko lygiagrečiai į DR5 raiškos padidėjimas.

Jei išbandyti CHOP vaidmenį casticin sukeltos ląstelę DR, buvo naudojamas genų slopinimo į CHOP iki siRNA. Transfekcijq su CHOP siRNA reikšmingai slopino casticin sukeltas DR5 ląstelę (5b pav), o casticin aktyvinama apie DR5 išraišką ne-perkeltų ir kontrolės-perkeltų (plakta RNR) ląstelių.

Kitas naudojamas srauto citometrijos analizė išnagrinėti, ar CHOP pagal siRNA slopinimo susilpnintas jautrinimo poveikį casticin apie TRAIL sukeltos apoptozės. Transfekcijq su CHOP siRNA gerokai sumažintas poveikis (nuo 37,1 ± 5,3% iki 13,5 ± 1,3%, vidurkis ± SD N
= 3) casticin plius TRAIL sukeltos apoptozės (5c pav), o gydymas kontrolės siRNR neturėjo jokio poveikio (5C pav). Šie rezultatai rodo, kad antspaude dalyvauja DR5 ląstelę ir prisideda prie dirginantis poveikis casticin apie TRAIL sukeltos apoptozės mūsų eksperimentinio modelio.

Casticin sukeltas Endoplazminis tinklas (ER) stresas skrandžio vėžio ląstelių

yra žinoma, kad ER sukelia ER streso baltymus žymenis (pavyzdžiui, GRP78 ir fosfo-eIF2α), kuri upregulates, kad CHOP išraiška [12], [19], [20]. Šioje studijoje buvo nagrinėta casticin įtaka ER streso žymeklis baltymų išraiška. Mūsų rezultatai rodo, kad casticin tiesų sukelia visus šiuos ER streso žymenų BGC-823 ląstelių (6a pav.) Norėdami nustatyti, ar ER stresas dalyvauja casticin apie apoptozės sukeltos takas, salubrinal, kurio ER streso inhibitorių sustiprindamas, buvo naudojamas. Salubrinal (50 mkmol /l), žymiai saugomos bgc-823 ląstelės apoptozės sukeltos bendro taikymo casticin ir TRAIL (6b pav.)

Mes taip pat išbandyti, ar gydymo bgc-823 ląstelių su Endoplazminis tinklas (ER) stresas induktorius, tunicamycin [25], gali pakelti DR5 baltymų lygį ir sustiprinti TRAIL sukeltos Apoptozė ląstelių žūtį. Mes nustatėme, kad tunicamycin (3,0 mkmol /L), skirtingu laiku darytą padidino baltymų lygius DR5, p-eIF2α, GRP78 ir pjaustyti, į BGC-823 ląstelių (6c pav). Cotreatment su tunicamycin (3,0 mkmol /l) ir takas (50 ng /ml) žymiai padidino ląstelių procentą subrangos G1 fazės, palyginti su tunicamycin ar TRAIL vien (6d pav.) Šie rezultatai patvirtina hipotezę, kad ER stresas dalyvavusią stiprinančiu poveikiu casticin apie apoptozės sukeltos takas.

Casticin sukeltos DR5 ląstelę ir apoptozė potenciaciją yra ROS priklausomas į BGC-823 ląstelių

neseniai paaiškėjo, kad 5, 7-dimethoxyflavone selektyviai sustiprina TRAIL sukeltos apoptozės iki ROS stimuliuojami ER-stresas suaktyvina CHOP tarpininkaujant DR5 ląstelę į kepenų ląstelių karcinoma ląstelių [15]. Taigi mes ištirti, ar casticin skatina ROS gamybą. 2 '7'-dichlorfluoresceino diacetatas (DFCH-DA) buvo naudojamas kaip zondo matuoti bet kokį ROS kraujyje padidėjimu ląstelių. Laikui bėgant eksperimentai atskleidė, kad ROS koncentracija iš pradžių padidėjo pervežimas

1 h, pasiekė aukščiausią tašką, esant 3 h ir išsilaikė iki 24 h po gydymo 1.0 mikromoliai /L casticin (7a pav). Casticin sukeltas ROS gamybą koncentracijos priklausomu būdu (7B pav.)

Jei iššifruoti tarp ROS susidarymo ir CHOP priklausoma DR5 indukcijos santykius, mes nagrinėjo, ar ROS reguliuoja casticin sukeltos TRAIL receptorius ir sukapoti dalyvaujant ir nebuvimas, N
-acetylcysteine ​​(ŠAT), kuri yra deguonies laisvųjų radikalų šalintojas. Mes nustatėme, kad išankstinis apdorojimas ląstelių su NAC sumažino casticin sukeltos ląstelę DR5 ir sukapoti išraišką (7c pav.)

Be to, mes ištirti, ar ROS vaidina vaidmenį casticin sukeltos TRAIL sustiprindamas. Kaip parodyta 7D paveiksle, casticin gerokai sustiprinti TRAIL sukeltos apoptozės BGC-823 ląstelių, ir išankstinis apdorojimas ląstelių su NAC ženkliai sumažintas casticin sukeltos apoptozės ląstelių mirties didinti nuo 52,4 ± 3,3% iki 8,2 ± 0,8%, (vidurkis ± SD, n = 3) rodo, kad ROS vaidina lemiamą vaidmenį tarpininkaujant su casticin poveikį TRAIL sukeltos apoptozės.

Casticin downregulates įvairių ląstelių išgyvenimo baltymų raišką bgc-823 ląstelių

buvo pranešta, kad daug anti-apoptoziniu baltymus, tokius kaip survivin, cFLIP, XIAP, Bcl-2 ir Bcl-xL gali reguliuoti TRAIL-sukeltas apoptozę [25], [26]. Šioje studijoje, mes ištirti, ar tam tikriems nustatytiems ląstelių išgyvenimo baltymai dalyvauja stiprinančiu poveikiu casticin apie apoptozės sukeltos takas. BGC-823 ląstelės buvo veikiamos skirtingų koncentracijų casticin 24 h ir tada tikrinama, ar Bcl-XL, Bcl-2, survivin, XIAP, cFLIP, CIAP-1 (korinio inhibitoriaus apoptozės baltymų 1) ir TRAF1 (TNF receptoriaus-susijęs koeficientas 1) išraiška. Casticin slopinamas BCL-XL, BCL-2, survivin, cFLIP ir XIAP išraiška (8a pav.) Iš casticin poveikis Bcl-XL, Bcl-2, survivin, XIAP ir cFLIP išraiškos buvo dramatiška, o CIAP-1 downregulation nebuvo labai ryškus. Šie rezultatai rodo, kad downregulation ląstelių išgyvenimo baltymų yra vienas iš mechanizmų, varančių veiksmingumą stiprinančiu poveikį casticin apie apoptozės, kurį sukelia TRAIL.

šalia tiriama, ar casticin gali moduliuoti proapoptotinį baltymų ekspresiją. Mes nustatėme, kad casticin visiškai aktyvinama, kad Bax ekspresiją koncentracijos priklausomu būdu (8B pav). Casticin pat padidėjo skilimo BID nuo koncentracijos priklausomu būdu, kaip parodyta iki BID baltymų raiškos (8B pav) sumažėjimas. Šie rezultatai rodo, kad casticin vienu metu gali aktyvuoti vidinę mitochondrijos tarpininkaujant kelią ir išorinė DR-sukeltas kelią, kaip matyti iš nupjauto proapoptozinis baltymų pasiūlymą.

Diskusijos

Šioje tyrimo, mes tyrė casticin galimybes, tam polymethoxyflavone gautas iš , fructus Viticis
, moduliuoti TRAIL signalizacijos skrandžio vėžio ląstelių, ir mūsų rezultatai rodo, kad casticin stiprina TRAIL sukeltos apoptozės skrandžio vėžio BGC-823, SGC-7901 ir MGC-803 ląstelės pagal (1) indukuojamojo DR5 saviraiškos ir (2) downregulatin ląstelių išgyvenimo baltymų, susijusių su atsparumu naviko ląstelių takas. pasirodo Casticin ląstelę DR5 būti mediēta aktyvavimo ROS-ER streso CHOP keliu (9 pav.)

parodė, kad casticin sukeltas DR5 išraišką skrandžio vėžio ląsteles. Šie rezultatai sutampa su tais mūsų ankstesniame darbe [10], mes pranešė, kad apoptozės poveikis casticin žmogaus kepenų ląstelių karcinoma ląstelių dalyvauja DR5 ląstelę, tačiau jie nenagrinėjo klausimų, ar casticin gali sustiprinti TRAIL sukeltos apoptozės arba sensibilizacijos mechanizmas. Čia mes parodėme, kad DR5 ląstelę yra labai svarbus sensibilizacijos ląstelių takas, kaip genai yra nuslopinami receptoriaus (DR5) susilpninto TRAIL sukeltos apoptozės. Taigi, DR5 iki reguliavimas gali įjautrinti ląsteles takas sukeltos apoptozės [27]. Daugybė mechanizmai buvo aprašyta indukcijai DR, įskaitant ROS gamybos, p53 indukcija, ir NF-κB, DDIT3 (DNR pažeidimai-indukuojamąją stenograma 3), peroksisomų proliferatoriaus aktyvuota receptorių gama ir MAPK aktyvavimo [27], [28] , Šioje studijoje, mes nustatėme, kad casticin sukeltas CHOP schemą ir kad genai yra nuslopinami ir CHOP pagal siRNA blokavo casticin poveikį ant DRS indukcijos ir TRAIL sukeltos apoptozės. Mūsų išvados yra panašūs į kitų tyrimų, kurie parodė, kad CHOP schemą jungiasi prie DR5 rengėjo ir upregulates šį receptorių ekspresiją [12], [29].

Jis yra gerai žinoma, kad CHOP schemą yra tipiškas ER stresas reguliuojama baltymas dalyvauja ER streso sukeltos apoptozės [11]. Mūsų išvada CHOP indukcijos casticin rodo, kad casticin gali sukelti ER stresą ir padidinti raiškos lygius GRP78 ir eIF2α, kurie yra papildomi baltymai sukauptas arba per ER streso [17] padidėjo. Todėl atrodo, kad casticin skatina ER stresą. Salubrinal yra selektyvus ER streso sukeltos apoptozės [30]. Iš salubrinal buvimas matyt apsaugotas skrandžio vėžio ląsteles nuo casticin plius TRAIL sukeltos apoptozės. Taigi, atrodo, kad casticin indukuoja apoptozę sustiprėjusio įtraukiant ER streso mechanizmus.

Mes nustatėme, kad turbūt svarbiausia prieš signalas susijęs su casticin moduliavimo TRAIL receptorių yra ROS. Mūsų rezultatai rodo, vienareikšmiškai, kad casticin paskatino ROS gamybą ir kad ROS aušinimas Iki antioksidantas N.
-acetylcysteine ​​susilpnintas, kad casticin poveikį CHOP ir DR5 indukcija. Mes nustatėme, kad numalšinti ROS pat silpnos casticin sustiprindamas TRAIL sukeltos apoptozės. Mūsų išvados sutaria su tais, pranešė ankstesniuose tyrimuose, naudojant sulforaphane, zerumbone ir celastrol už DR5 indukcija. Rezultatai dabarties ir ankstesnių tyrimų galima teigti, kad ROS vaidina svarbų vaidmenį TRAIL receptorių DR5 moduliavimo [31], [32]. Mūsų rezultatai sutampa su tais, iš ankstesnio darbo, mes pranešė, kad casticin sukėlė kaupimosi sub-G1 ląstelės ir padidėjo ROS gamybą HeLa, CasKi ir SiHa ląstelių linijas, bet ne PKVL [33]. Bet mes parodė, kad casticin sumažino GSH kiekis ( "P < 0,05
), tačiau neturėjo įtakos intraceliulinės ROS lygį PLC /PRF /5 ir Hep G2 ląstelės [10]. Tikėtinas paaiškinimas akivaizdžiai duomenų konflikto, kad yra skirtumai modalumo, reguliuojantys veiksmus skirtingose ​​ląstelių tipų.

Taip pat nustatyta, kad kito mechanizmo jautrumo apima anti-apoptozinių baltymų reguliavimą. Casticin downregulated ekspresijos elevels iš BCL-2, BCL-XL, XIAP ir survivin, kurie visi buvo susijęs su atsparumu naviko ląstelių takas [34], [35]. Iš tiesų, downregulation iš XIAP, BCL-2 ir BCL-XL išraiška buvo įrodyta, kad atkreipti auglio ląsteles TRAIL [36], [37]. Wang , et al.,
(2005) [8] parodė, kad casticin sumažėjo BCL-2 ekspresijos lygį ir downregulated iš BCL-2 /Bax išraiškos santykį K562 ląsteles. Mūsų rezultatai taip pat susitaręs su ankstesniais tyrimais, kurie parodė, kad ekstrahuojant etanoliu džiovintų prinokusių vaisių, Vitex agnus-Castus
sumažino BCL-2 lygio, BCL-XL, bei Perka baltymų ir padidėjo lygis Bax baltymų [7]. Ataskaita iš Chen ir kt., Pervežimas (2011) neseniai parodė, kad "Bax buvo aktyvinama, o ekspresijos lygis BCL-XL, bei XIAP buvo downregulated iki casticin [33].

Kobayakawa et al., Pranešama, kad casticin labai slopino KB ląstelių augimą, bet ne slopinti A431 ląstelių proliferaciją, kuris yra panašus į normalių ląstelių linijų 3T3 Šveicarijos Albino ir TIG-103 [38]. Šiame tyrime, mes parodė, kad casticin konkrečiai sukeltas apoptozę į žmogaus skrandžio vėžio ląstelių, bet ne į GES-1 ląstelių, nors selektyvus apoptozės sužadinimu mechanizmas nebuvo nustatytas. Mūsų rezultatai rodo, kad casticin gali būti konkreti priešnavikinis agentas su mažu toksiškumu.

Apibendrinant, mūsų rezultatai rodo, kad casticin prisideda prie vėžinių ląstelių Trail naudojant kelis mechanizmus jautrumo. Casticin pradžių skatina ROS susidarymą ir sukelia ER stresą tada skatina DR5 ląstelę per aktyvavimo CHOP kuri dėl to didina TRAIL sukeltos aktyvavimo DR5 sukeltas ir mitochondrijų tarpininkaujant apoptozę kelius. Tuo pačiu metu, casticin palengvina TRAIL sukeltos aprotoninis ląstelių žūtį slopinimu antiapoptozės baltymų ekspresijos ir aktyvacijos PRO-apoptozę baltymų. Ateities tyrimai turėtų būti siekiama iki galo įgyvendinti iš casticin ir TRAIL terapijos deriniu gydyti pacientus, sergančius skrandžio vėžio potencialą. Todėl reikės papildomų tyrimų iš casticin veiksmų gyvūnų modeliais.

Medžiagos ir metodai

Reagentai

Casticin (grynumas ≥ 98%) buvo pirktos iš Čengdu Biopurify fitocheminių Ltd (Čengdu, Kinija), dabartis, kaip Geltoni kristalai (molekulinė masė, 374,3). Casticin buvo ištirpinta dimetil-sulfoksido (DMSO), kad 10 mmol /l tirpalo ir praskiesti ląstelių kultūros terpės, iki reikiamos koncentracijos prieš pat vartojimą. Šie reagentai buvo įsigytas iš Hunan Clonetimes Biotech Co. Ltd. (Changsha, Kinija): tirpus rekombinantinio žmogaus takas (Pepro Tech), Mobilusis Apoptozę IFA nustatymo rinkinys (Roche), 2 ", 7'-dichlorfluoresceino DIACETATAS (DCFH-DA; Molekulinė zondai Inc "), salubrinal (EMD Chemicals, Inc., San Diego, Kalifornija), N-acetilcisteino (ŠAT; Sigma"), tunicamycin (sigma), propidiumo jodido (PI; Sigma "), kaspazės 3 Aktyvumas aptikimas komplektas (Millipore), kaspazės 8 Kolorimetrinis Aktyvumas Analizės komplektas 25 ( "Millipore), kaspazės 9 Kolorimetrinis Aktyvumas Analizės komplektas (Millipore), antikūnai prieš DR5 (ProSci Inc"). Antikūnai prieš DR4, PARP, BCL-2, Bax, pasiūlymą, survivin, pjaustyti, GRP78 ir ATF4 buvo gauti iš Santa Cruz Biotechnology. Anti-XIAP antikūnų buvo įsigytas iš mobiliųjų Signalizacijos technologijos Danvers, JAV. Kaspazės inhibitoriai, pavyzdžiui, zVADfmk, zDEVD-FMK, zIETD-FMK ir zLEHD-FMK buvo įsigytas iš R & D sistemos (Mineapolis, MN)

Mobilusis kultūra

BGC-823, Tarybos generalinis sekretoriatas. -7901 ir MSV-803 žmogaus skrandžio vėžio ląstelės buvo gautos iš Kinijos centro tipas kultūros kolekcijos (CCTCC; Wuhan, Kinija) ir GES-1 ląstelių iš Onkologijos instituto Pekino universitete. Ląstelės buvo prižiūrimi Dulbecco modifikuota Eagle terpėje (DMEM, Life technologies ", Grand Island, NY) papildytas 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS) (Invitrogen), 100 V /ml penicilino ir 100 V /ml streptomicino drėgnoje atmosferoje, 5% CO _{2 37 ° C temperatūroje. Ląstelės buvo gydomi įvairios koncentracijos casticin arba TRAIL arba abu MTT. Casticin (1,0 mkmol /l) ir takas (25, 50 ng /ml) atskirai arba kartu buvo taikomi bgc-823 ląstelių, naudojamų aptikti apoptozę.}

MTT

Ląstelės buvo pasėjamos į 96-šulinėlių plokštelės, esant 0.5104 ląstelių /duobutėje ir inkubuojami 24 h tankio, po to veikiant su įvairios koncentracijos casticin ir TRAIL 24 h ar apdoroti su casticin 12 valandų, po to veikiant su TRAIL dar 24 h. MTT kolorimetrinės analizė buvo atlikta, kaip aprašyta anksčiau [10]. IC _{50 vertė, už kurią 50% ląstelių augimo inhibavimo lyginant su Dimetilsulfoksido (DMSO), kontrolę buvo}

apskaičiuojama netiesinio regresinę analizę, naudojant GraphPad Prism programinę įrangą (San Diego, CA). Srauto citometrijos naudojant PI dažymo

Ląstelės buvo pasėjamos esant tankiui 4 × 10 ^{6 ląstelių /ml 100 ml kultūros kolbos 24 h ir tada gydomi vidutinio yra įvairių koncentracijų casticin ar TRAIL ar abu kartu už nurodyto laiko. Mobilusis apoptozė buvo aptiktas naudojant tėkmės citometrijos metodą. (FCM; Amerikos BD Company, FACS 420)}

Histono /DNR fragmentas IFA

mobilųjį apoptozė IFA aptikimo rinkinys buvo naudojamas siekiant aptikti apoptozę ląstelių gydomiems casticin pagal gamintojo protokolą. Trumpai, ląstelės buvo pasėjamos į 96 šulinėlių plokštelės tankio 1 × 10 ^{4 ląstelių /gerai 24 h, o terpėje, turinčioje įvairios koncentracijos casticin pridedamas kaip reikalaujama. Po 24 h, kontrolės ir gydymo grupių citoplazma buvo perkeltas į 96 šulinėlių plokštelės peridiumed pagal streptavidinu, inkubuojami su biotinilintu Histonas antikūnų ir peroksidazės-Tagged pelės anti-žmogaus DNR 2 val kambario temperatūroje. Absorbcija esant 405 nm buvo matuojamas EXL-800 tipo imunofermentinės aparatą.}

Analizė kaspazės-3, -8 ir -9 veikla

kaspazės-3 veikla, -8 ir -9 buvo įvertintas naudojant kaspazės 3 aktyvumas nustatymo rinkinys, į kaspazės 8 Kolorimetrinis aktyvumo tyrimas Kit 25 ir kaspazės 9 Kolorimetrinis aktyvumo tyrimas Kit, atitinkamai. Trumpai tariant, ląstelių fragmentai buvo apdorotos po jų atitinkamų gydymo eksperimentines agentai. Kad tyrimai buvo atlikti 96-duobučių lėkštelėse inkubuojant 20 mikrogramų ląstelių lizato 100 pL reakcijos buferinio tirpalo (1% NP-40, 20 mM Tris-HCl, (pH 7,5), 137 mM NaCl, 10% glicerolio), kuriame yra 5 mikronų iš kaspazės-3 substrato AC-DEVD- p
NP, The kaspazės-8 substratas AC-IETD- p
NP arba kaspazės-9 substratas AC-LEHD- p
NP. Lizatai inkubuojamas 37 ° C temperatūroje 2 val.

• PLoS ONE: II fazės tyrimo vertinimas 2 dozavimas geriamųjų Foretinib (GSK1363089) cMet /KEAFR 2 inhibitorius, pacientams, sergantiems skrandžio vėžiui
• PLoS ONE: Asociacija tarp mažinimo Plazminiai adiponektino kiekį kraujyje ir rizikos bakterinės infekcijos po skrandžio vėžio chirurgijos