PLOS ONE: casticina Potencializa TRAIL-induziu a apoptose das células cancerosas gástrica através Retículo endoplasmático Stress

Abstract

Fundo

casticina é um dos principais componentes ativos obtidos a partir de Fructus Viticis
e tem sido relatado para exercer actividade anti-cancerígena em uma variedade de células cancerosas, mas o mecanismo exacto subjacente a esta actividade permanece obscuro

Materiais e Métodos

apoptótica actividades de casticina (1,0 umol. /l) e pista (25, 50 ng /ml) isoladamente ou em combinação nas linhas celulares de cancro gástrico BGC-823, a SGC-7901 e MGC-803 foram detectadas pelo uso de um kit de detecção de apoptose celular ELISA, citometria de fluxo ( FCM) com iodeto de propídio (PI) a coloração e actividades de caspase-3, -8 e -9 por ELISA e clivagem de polimerase polyADP-ribose (PARP) de proteína usando a análise de western blot. receptores de morte (DR) os níveis de expressão foram avaliados por meio de análise FCM e western blot. 2 ', 7'-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA) foi utilizado como uma sonda para medir o aumento de espécies de oxigénio reactivas (ROS), os níveis em células. Várias intervenções, tais como siRNA transfecção e inibidores farmacológicos foram usadas para explorar os mecanismos destas ações.

Resultados

subtóxicos concentrações de casticina potencializadas significativamente a citotoxicidade induzida por TRAIL e apoptose em BGC-823, SGC-7901 e as células MGC-803. Casticina regulada dramaticamente a expressão do receptor DR5 mas não teve efeitos na DR4 ou receptores de engodo. Supressão de DR5 por siRNA reduziu significativamente a apoptose induzida pela co-aplicação de TRAIL e casticina. Gene silenciamento da proteína proteína de ligação CCAAT /estimulador homóloga (CHOP) e pré-tratamento com salubrinal, um inibidor de estresse do retículo endoplasmático (ER), atenuou a expressão casticina-induzida do receptor DR5, e apoptose e produção de ROS. Casticina regulada negativamente os níveis das proteínas de sobrevivência celular cFLIP, Bcl-2, XIAP e expressão de survivina. Além disso, casticina também induziu as expressões da proteína DR5 em outras células cancerosas gástricas (SGC-7901 e MGC-803).

Conclusão /Significado

casticina aumenta a apoptose induzida por TRAIL através do downregulation de proteínas sobrevivência celular ea regulação alta dos receptores DR5 através de acções sobre a ROS-ER estresse-CHOP via

Citation:. Zhou Y, Tian L, Long L, M Quan, Liu F, Cao J (2013) casticina Potencializa TRAIL-induziu a apoptose das células cancerosas gástrica através Retículo endoplasmático stress. PLoS ONE 8 (3): e58855. doi: 10.1371 /journal.pone.0058855

editor: Kaustubh Datta, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de junho de 2012; Aceito: 08 de fevereiro de 2013; Publicação: 11 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zhou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Projeto de NSFC (número 30760248), o Projeto de Pesquisa Científica da província de Hunan Bureau Administração de Medicina tradicional chinesa (número 2010081), o Projeto de Pesquisa Científica da província de Hunan, Departamento de Educação (número 10C0975), major item de projeto de Pesquisa científica da província de Hunan Departamento de Educação (número 09A054) eo projeto de Pesquisa científica de Changsha Secretaria Municipal de Ciência e Tecnologia (número K1104060-31). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Fructus Viticis
( Manjingzi
é o nome chinês) ou seja fruto de Vitex trifolia L.
(família Verbenaceae
) que é uma medicina chinesa tradicional usado como um agente anti-inflamatório. Casticina é um dos componentes activos derivados de Fructus Viticis
[1]. Muitos estudos têm demonstrado que casticina exerce actividade anti-cancerígena em cancros da mama [2], cervical [3], próstata [4], do pulmão e do cancro do cólon [5], [6], bem como no cancro gástrico [7] in vitro
. Também tem sido relatado que casticina inibe o crescimento de células de leucemia mielóide humanas [8] e induz a morte de células de leucemia por a indução da apoptose ou uma catástrofe mitótica [9].

Recentemente, o trabalho anterior de nosso laboratório indicaram que o efeito de casticina sobre a apoptose de células de carcinoma hepatocelular humano está envolvido na via de DR5 independente do estado de p53 [10]. Tem sido documentado que a proteína homóloga da proteína de ligação CCAAT /enhancer (CHOP), também conhecida como a paragem do crescimento e o gene de dano de ADN 153 (GADD153), regula directamente a expressão de DR5 por meio de um local de ligação de CHOP na região 5-flanqueadora do gene de DR5 [11], [12]. Nós, e outros, têm relatado que alguns medicamentos, tais como 5, 7-dimethoxyflavone e dimetil-celecoxib, induzir a expressão DR5 por meio de transativação dependente de CHOP do gene DR5 [13] - [15]. Além disso, vários estudos têm demonstrado uma estreita relação entre retículo endoplasmático estresse (ER) e expressão DR5. ER stress é induzida quando proteínas desdobradas acumular no lúmen do ER [16]. Parece que esta resposta pode ativar vias apoptóticas específicas para eliminar as células severamente danificada, em que os defeitos de dobramento de proteínas não podem ser resolvidos [17], [18]. Vários indutores de stress, tais como er, MG132 [12], tunicamicina [19] e tapsigargina [20], têm sido consistentemente mostraram induzir a expressão na superfície das células de DR5. Embora os mecanismos moleculares para a expressão da proteína DR5 por indutores de stress ER pode variar de acordo com estímulos e tipos de células, o fator de transcrição stress inducible ER, CHOP, tem proporcionado uma ligação entre estresse ER e DR5. No entanto, se casticina induz a expressão de DR5 em células de cancro gástrico e em caso afirmativo, a natureza do mecanismo molecular envolvido é desconhecido.

Um estudo recente demonstrou que o tumor necrose eficaz do ligando indutor de apoptose relacionado com o factor de α ( TRAIL) com base na terapia de combinação pode ser conseguida por expressão upregulating DR4 e DR5, e que visam directamente mitocôndrias de células de tumor para estimular as suas propriedades de indução de apoptose [21]. A capacidade das mitocôndrias para mediar a apoptose é fortemente regulada por membros da família Bcl-2 superfamília [22]. Suprimindo a expressão da proteína anti-apoptótica, com ARN anti-sentido ou ARNsi, foi mostrado para sensibilizar células cancerosas para LIART [23]. Como resultado, os agentes que regulam negativamente as proteínas tais anti-apoptóticos como survivina, celular FADD de enzima do tipo proteína inibidora (cFLIP), Bcl-2, e o inibidor de X-ligada da proteína apoptose (XIAP) conversão de interleucina-1β-potencialmente pode sensibilizar cancro células para os efeitos apoptóticos de TRAIL [23], [24].

no presente estudo, portanto, nós nos concentramos em investigando se casticina potencializa a apoptose de células cancerígenas induzida por TRAIL, e se sim, como casticina potencializa este efeito. Descobrimos que casticina apoptose induzida por TRAIL potenciado pela regulação positiva de DR5 por meio do ERO-ER tensão-CHOP e por via de regular negativamente a expressão das proteínas de sobrevivência celular bcl-2, XIAP, cFLIP, e survivina em células de cancro gástrico.

resultados

subtóxicos concentrações de casticina aumenta selectivamente citotoxicidade induzida por TRAIL em células cancerosas gástricas

A citotoxicidade do casticina e TRAIL, sozinho ou em combinação, foi examinada em linhas de cancro gástrico humano BGC- 823, SGC-7901 e MGC-803, como determinado pelo ensaio de MTT. Casticina e TRAIL sozinho causou citotoxicidade de células de cancro gástrico, de um modo dependente da concentração (Figuras 1A e B). foi observada a uma concentração mais baixa de casticina (1,0 mmol /l, a Figura 1A); citotoxicidade ligeira (20% <). O tratamento de células de cancro gástrico com TRAIL 25-50 ng /ml durante 24 h a citotoxicidade induzida limitado (< 20%). No entanto, o co-tratamento de células de cancro gástrico com casticina (1,0 umol /L) e TRAIL (25 ng /ml ou 50 ng /ml) aumentou marcadamente os efeitos citotóxicos em comparação com o tratamento com casticina ou TRAIL sozinho (Figura 1C).

porque descobrimos que o tratamento combinado com casticina TRAIL e citotoxicidade induzida fortemente em células de cancro gástrico, o próximo examinado o efeito do tratamento sobre a linha de células humanas imortalizadas gástrico mucosa epitelial GES-1. Curiosamente, a combinação de casticina e TRAIL não induziu citotoxicidade nas células GES-1 (Figura 1D) .Estes resultados indicam que as concentrações subtóxicos de casticina sensibilizados selectivamente as células cancerosas gástricas humanas para TRAIL-induziu citotoxicidade.

concentrações subtóxicos de casticina sensibilizar células cancerosas gástricas para induzida por TRAIL apoptose

para investigar se a apoptose está envolvida na inibição do crescimento celular após co-tratamento com casticina e TRAIL, examinamos primeiro apoptose por meio de análise de citometria de fluxo para detectar aumentos em células hipodiploidia populações. Os resultados revelaram que a taxa de apoptose foi 3,78 ± 1,3%, 4,69 ± 1,7% e 37,1 ± 4,9% (média ± SD, n
= 3) para casticina (1 mmol /l), TRAIL (50 ng /ml) e mais casticina TRAIL, respectivamente (Figura 2A). A população sub-G1 de células BGC-823 foi significativamente aumentada às 12 horas, e atingiu um pico 24 h após o pré-tratamento com 1 umol /l casticina seguido por 50 ng /mL de TRAIL (Figura 2B). A seguir, determinou os níveis de fragmento de histona /DNA de linhas celulares de cancro gástrico BGC-823, a SGC-7901 e MGC-803 usando o kit de detecção de apoptose celular ELISA. Figura 2C ilustra que o tratamento combinado de casticina e TRAIL sinergicamente induzida fragmentação histona /DNA. Os níveis de fragmento de histona /DNA de BGC-823 foram elevados após 12 h e atingiu um pico de 24 h após a co-tratamento com casticina (1 mmol /l) e TRAIL (50 ng /ml, Figura 2D).

próxima examinado se as caspases foram activadas durante a indução, na verdade, de morte celular por apoptose pelo tratamento combinado com casticina e TRAIL em células de cancro gástrico. O tratamento de células cancerosas gastic com 1 umol /L por si só durante 24 h casticina não induziu qualquer actividade de caspase-3, -8 e -9. Em resposta a TRAIL (50 ng /mL), as actividades de caspase-3, -8 e -9 não se alterou. No entanto, o tratamento combinado de casticina e TRAIL induziu a activação de caspase-3 e -8 e ligeiramente activado caspase-9 (Figura 2 E, F e G).

Examinámos também que a caspase foi especificamente activado em casticina resposta ao tratamento e TRAIL utilizando inibidores de caspase, incluindo o inibidor da pan-caspase zVAD-fmk, o inibidor de caspase-3 zDEVD-fmk, o inibidor de caspase-8 zIETD-FMK e o inibidor de caspase-9 zLEHD-fmk. Tal como mostrado na Figura 2E, zVAD-fmk, zDEVD-fmk e zIETD-fmk diminuiu significativamente o nível de actividade de caspase-3 induzida pelo tratamento combinado de casticina e TRAIL, mas zLEHD-fmk teve um ligeiro efeito. zVAD-fmk e zIETD-fmk pode simultaneamente bloquear completamente a activação da caspase-8, e zDEVD-fmk bloqueou parcialmente a activação de caspase-8; No entanto, zLEHD-fmk teve quase nenhum efeito do estado de activação da caspase-8 (Figura 2F). Correspondentemente, descobriu-se que a caspase-9 foi ligeiramente activado em células tratadas com casticina e TRAIL mas não em células tratadas com TRAIL casticina e na presença de Z-IETD-FMK, zVAD-fmk e zLEHD-fmk (Figura 2G). Colectivamente, estes resultados sugerem que casticina com a adição de TRAIL induz a activação da caspase-8 a montante da activação de caspase-9 [10].

finalmente investigou se casticina poderia aumentar a clivagem de PARP induzida por TRAIL e descobriram que casticina reforçada TRAIL-induziu um aumento na clivagem PARP no BGC-823 e as células SGC-7901 (Figura 2H). Estes resultados indicam fortemente que a concentração de subtóxicos casticina intensifica a apoptose induzida por TRAIL de células de cancro gástrico.

casticina induz a expressão de DR5 em células de cancro gástrico

a apoptose de células de carcinoma hepatocelular induzidos por casticina estava envolvido na regulação positiva de DR5 [10]. Portanto, tratamos células BGC-823 com casticina durante 24 h e, em seguida, utilizada a análise de Western Blot para examinar as células de expressão do receptor de TRAIL. Casticina aumento da expressão de DR5 em uma maneira dependente da concentração, mas não teve nenhum efeito sobre a expressão de DR4 nem DcR1 ou DcR2 indução (Figura 3A). A indução da expressão de DR5 por casticina ocorreu às 6 horas e atingiu um pico às 24 h (Figura 3B). Estas descobertas sugerem que a supra-regulação de DR5 é um mecanismo através do qual candidato casticina aumenta os efeitos apoptóticos de TRAIL em células BGC-823.

Para determinar se o DR na superfície da célula estava envolvido na indução de apoptose por casticina, a expressão da superfície celular de DR5 e DR4 foi observada usando citometria de fluxo. Após exposição das células à casticina (1,0 umol /L), o nível de DR5 na superfície celular foi aumentada (Figura 3C). No entanto, casticina não influenciaram o nível de expressão de DR4 (Figura 3D). Colectivamente, estes resultados indicam que casticina regula positivamente a expressão de DR5 na superfie celular.

Se a regulação positiva de DR5 por casticina é específico para células BGC-823 ou também ocorre em outras linhas de células de cancro gástrico, também foi investigado. Casticina induzida expressão DR5 no câncer gástrico SGC-7901 e linhas de células MGC-803, mas não teve efeitos óbvios sobre a sua expressão em imortalização gástrica linha de células da mucosa GES-1 (Figura 3E). Juntos, estes resultados sugerem que a regulação positiva de DR5 por casticina não é específico para um determinado tipo de célula de câncer gástrico.

indução DR5 por casticina é necessário para o aumento da apoptose induzida por TRAIL em BGC-823 células

para determinar o papel dos receptores de DR5 na melhoria da apoptose induzida por TRAIL por casticina, usamos siRNA específico para DR5 de regular negativamente a sua expressão. A transfecção de células com siRNA para DR5 mas não com o siRNA de controle reduzida expressão DR5 casticina-induzido.

Para examinar se DR5 regulação positiva envolve a apoptose celular gástrica induzida por TRAIL casticina-reforçada, análise de fluxo de citometria foi usado para examinar se supressão da expressão de DR5 por siARN capaz de atenuar o efeito de casticina na apoptose induzida por TRAIL. A Figura 4B mostra que o efeito de casticina na apoptose induzida por TRAIL foi efectivamente diminuída em células transfectadas com ARNsi de DR5, enquanto que as células transfectadas com ARNsi de controlo não foram afectadas. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a indução de DR5 é crítica para a sensibilização de células tumorais para os efeitos da casticina em apoptose induzida por TRAIL.

induzida por DR5 casticina regulação positiva é mediada através da indução de CHOP no BGC-823 células

regulação positiva de DR5 foi demonstrado mediado-CHOP [11] - [15]; portanto, próximo investigado como este factor de transcrição pode estar envolvido na induzida por DR5 casticina regulação positiva. A Figura 5A mostra que a expressão induzida casticina CHOP, que ocorreu em paralelo com o aumento na expressão de DR5.

Para testar o papel da CHOP na regulação positiva induzida por casticina do DR, foi utilizado o silenciamento do gene de CHOP pelo siRNA. A transfecção com CHOP siARN suprimiu significativamente casticina induzida por DR5 regulação positiva (Figura 5B), enquanto casticina regulada positivamente a expressão de DR5 em células não-transfectadas e transfectadas com controlo (mexidos ARN).

próxima utilizada a análise de citometria de fluxo para examinar se a supressão de CHOP por siRNA atenuou os efeitos sensibilizantes de casticina na apoptose induzida por TRAIL. A transfecção com CHOP siARN significativamente reduzida dos efeitos de (37.1 ± 5.3% a 13.5 ± 1.3%, média ± SD, N
= 3) em casticina além de apoptose induzida por TRAIL (Figura 5C), enquanto que o tratamento com o controle siRNA não teve nenhum efeito (Figura 5C). Estes resultados indicam que CHOP está envolvido na regulação positiva de DR5 e contribui para o efeito sensibilizador de casticina na apoptose induzida por TRAIL em nosso modelo experimental.

casticina induzida retículo endoplasmático (ER) o stress em células de cancro gástrico

sabe-se que o ER induz proteínas marcadoras ER stress (tal como GRP78 e fosfo-eIF2α), que regula positivamente a expressão de CHOP [12], [19], [20]. No presente estudo, foi examinado o efeito de casticina sobre a expressão de proteínas marcadoras de stress ER. Os nossos resultados mostram que casticina efectivamente induzir todos estes marcadores de ER stress em células BGC-823 (Figura 6A). Para determinar se ER stress está envolvido na potenciação da casticina na apoptose induzida por TRAIL, salubrinal, um inibidor de ER stress, foi usado. Salubrinal (50 umol /L) significativamente protegidos BGC-823 células de apoptose induzida pela co-aplicação de casticina e TRAIL (Figura 6B).

Também testámos se o tratamento de BGC-823 células com o retículo endoplasmático (ER) indutor de stress, tunicamicina [25], pode elevar os níveis de proteína de DR5 e aumentar a morte celular por apoptose induzida por TRAIL. Descobrimos que a tunicamicina (3,0 umol /L) dependente do tempo aumentou os níveis de proteína de DR5, p-eIF2α, GRP78 e CHOP, em BGC-823 células (Figura 6c). Co-tratamento com tunicamicina (3,0 umol /L) e TRAIL (50 ng /mL) aumentou significativamente a percentagem de células na fase sub-G1, em comparação com tunicamicina ou TRAIL sozinho (Figura 6D). Estes resultados suportam a hipótese de que o estresse ER participa do efeito potenciador de casticina na apoptose induzida por TRAIL.

induzida casticina upregulation DR5 e potenciação de apoptose são ROS-dependente em células BGC-823

recentemente, demonstrou que 5, 7-dimethoxyflavone aumenta selectivamente a apoptose induzida por TRAIL pela ROS estimulada ER-stress desencadeamento mediada por DR5 CHOP regulação positiva em células de carcinoma hepatocelular [15]. Nós, portanto, investigou se casticina induz a produção de ROS. 2 '7'-diclorofluoresceína diacetato (DFCH-DA) foi utilizado como uma sonda para medir a qualquer aumento nos níveis de ROS nas células. Tempo de curso experiências revelaram que os níveis de ROS foram aumentados inicialmente pelo

1 h, atingiu um pico em 3 h e persistiu por até 24 horas após o tratamento com 1,0 mmol /l casticina (Figura 7A). Casticina induzida a produção de ROS em uma forma dependente da concentração (Figura 7B).

Para decifrar a relação entre a geração de ROS e indução DR5 dependente de CHOP, examinamos se ROS regula receptores de TRAIL casticina induzidas e CHOP na presença e ausência de N
-acetylcysteine ​​(NAC), que é um sequestrante de radicais livres de oxigénio. Descobrimos que o tratamento prévio de células com NAC reduziu a supra-regulação induzida por casticina de DR5 e CHOP expressão (Figura 7C).

Em seguida, investigámos se ROS desempenha um papel na potenciação induzida por TRAIL casticina. Como mostrado na Figura 7D, casticina aumentou significativamente a apoptose induzida por TRAIL em células BGC-823, e pré-tratamento das células com NAC reduziu marcadamente casticina induzida por aumento da morte celular por apoptose de 52,4 ± 3,3% para 8,2 ± 0,8%, (média ± DP, n = 3), sugerindo que as ROS desempenha um papel crítico na mediação dos efeitos de casticina em apoptose induzida por TRAIL.

casticina regula negativamente a expressão de várias proteínas de sobrevivência celular em células BGC-823

tem sido relatado que várias proteínas anti-apoptóticas, tais como survivina, cFLIP, XIAP, Bcl-2 e Bcl-xL, pode regular a apoptose induzida por TRAIL [25], [26]. No presente estudo, nós investigamos se certas proteínas sobrevivência celular identificados foram envolvidos no efeito potenciador de casticina na apoptose induzida por TRAIL. Células BGC-823 foram expostas a diferentes concentrações de casticina durante 24 h e, em seguida, examinadas para a Bcl-xL, Bcl-2, a survivina, XIAP, cFLIP, cIAP-1 (inibidor celular de proteína de apoptose 1) e (TNF TRAF1 receptor associado fator 1) expressão. Casticina inibida Bcl-xL, Bcl-2, a survivina, a expressão de XIAP e cFLIP (Figura 8A). Os efeitos de casticina sobre a expressão de Bcl-xL, Bcl-2, a survivina, XIAP e cFLIP foram dramáticos, enquanto a regulação negativa da cIAP-1 não foi muito pronunciado. Estes resultados sugerem que a regulação negativa de proteínas de sobrevivência celular é um dos mecanismos de accionamento do efeito potenciador de casticina na apoptose induzida por TRAIL.

próxima examinado se casticina pode modular a expressão de proteínas pró-apoptóticas. Descobrimos que casticina dramaticamente regulada positivamente a expressão da Bax, de um modo dependente da concentração (Figura 8B). Casticina também aumentou a clivagem de Bid, em uma maneira dependente da concentração, tal como indicada pela diminuição da expressão da proteína Bid (Figura 8B). Estes achados sugerem que casticina podem, simultaneamente, ativam a via mediada por mitocôndrias intrínseca e da via-induzida DR extrínseca como evidenciado pela proteína pró-apoptótica truncada Bid.

Discussão

No presente inquérito, investigou-se a capacidade dos casticina, um polymethoxyflavone derivado de Fructus Viticis
, para modular a sinalização de TRAIL em células de câncer gástrico, e os nossos resultados sugerem que casticina potencializa apoptose induzida por TRAIL no câncer gástrico BGC-823, SGC-7901 e MGC-803 células por (1) expressão de DR5 induzir e (2) downregulatin de proteínas de sobrevivência de células associadas à resistência de células tumorais a TRAIL. Casticina regulação positiva de DR5 parece ser mediada através da activação do ERO-ER via o stress-CHOP (Figura 9).

Demonstrámos que a expressão induzida casticina DR5 em células de cancro gástrico. Estes resultados estão de acordo com os de nosso trabalho anterior [10], informamos que o efeito apoptótica de casticina em células de carcinoma hepatocelular humano está envolvido em DR5 regulação positiva, mas eles não abordar as questões sobre se casticina pode melhorar a apoptose induzida por TRAIL ou o mecanismo de sensibilização. Aqui, mostramos que DR5 regulação positiva é crítica para a sensibilização de células para TRAIL, como o silenciamento do gene do receptor (DR5) a apoptose induzida por TRAIL atenuada. Assim, a sobre-regulação de DR5 pode sensibilizar as células para a apoptose induzida por TRAIL [27]. Diversos mecanismos foram descritos para a indução do DR, incluindo a produção de ROS, a indução de p53 e NF-kB, DDIT3 (ADN danos indutível transcrição 3), peroxissoma receptor-γ e MAPK de activação activados por proliferador de [27], [28] . No presente estudo, descobrimos que casticina induzida CHOP e que o silenciamento do gene de CHOP por siRNA bloqueou o efeito de casticina na indução de DRs e na apoptose induzida por TRAIL. Estes resultados são semelhantes aos de outros estudos que indicam que CHOP se liga ao promotor de DR5 e regula positivamente a expressão do receptor [12], [29].

é bem sabido que é uma CHOP ER típico tensão regulada proteína envolvida na apoptose induzida ER-stress [11]. A nossa descoberta da indução CHOP por casticina sugere que casticina podem desencadear o estresse ER e aumentar os níveis de expressão de GRP78 e eIF2α, que são proteínas adicionais acumuladas ou aumentadas durante o estresse ER [17]. Portanto, parece provável que casticina induz estresse ER. Salubrinal é um inibidor selectivo de ER apoptose induzida por stress [30]. A presença de salubrinal aparentemente protegida células cancerosas gástricas de casticina apoptose induzida por TRAIL plus. Assim, parece que casticina induz a apoptose potenciação, envolvendo mecanismos ER estresse.

Nós achamos que talvez o sinal mais importante a montante ligada a casticina modulação dos receptores de TRAIL é ROS. Os nossos resultados demonstram, inequivocamente, que casticina induzida a produção de ROS, e que a têmpera de ROS por o antioxidante N
-acetylcysteine ​​atenuado o efeito de casticina na indução de CHOP e DR5. Descobrimos que extingue ROS também atenuada casticina potenciação da apoptose induzida por TRAIL. Nossos resultados estão de acordo com os relatados em estudos anteriores usando o sulforafano, zerumbone e Celastrol para indução DR5. Os resultados de estudos actuais e anteriores indicam fortemente que as ROS desempenha um papel importante na modulação do receptor DR5 de TRAIL [31], [32]. Os resultados estão de acordo com aqueles do trabalho anterior, que relatou que casticina causada acumulação de células sub-G1 e aumentou a produção de ROS em células HeLa, CaSki e SiHa linhas celulares, mas não em PBMC [33]. Mas nós mostramos que casticina reduziu o teor de GSH ( P < 0,05
), mas não afetou o nível de ROS intracelular em /PRF /5 e Hep células G2 PLC [10]. Uma explicação plausível para o conflito de dados aparente é que existem diferenças na modalidade que regulam ações em diferentes tipos de células.

Também identificamos que o outro mecanismo de sensibilização envolve a regulação das proteínas anti-apoptóticos. Casticina regulada negativamente as elevels expressão de Bcl-2, Bcl-xL, XIAP e survivina, todos os quais foram ligados a resistência de células tumorais a TRAIL [34], [35]. Com efeito, a regulação negativa de XIAP, Bcl-2 e Bcl-xL foi mostrado para sensibilizar células tumorais para LIART [36], [37]. Wang et ai.
(2005) [8] mostrou que casticina diminuiu Bcl-2 e os níveis de expressão regulada negativamente a proporção de expressão de Bcl-2 /Bax em células K562. Nossos resultados também estão de acordo com estudos anteriores que demonstraram que um extracto de etanol do fruto maduro seca de Vitex agnus-castus
diminuiu o nível de Bcl-2, a proteína Bcl-xL e Bid, e aumento na nível da proteína Bax [7]. O relatório de Chen et al.
(2011) recentemente mostrou que Bax foi regulada, enquanto que os níveis de Bcl-xL e XIAP expressão foram reprimidos por casticina [33].

Kobayakawa et al. relataram que casticina marcadamente inibido o crescimento de células KB, mas não inibiu a proliferação de células A431, que é semelhante às linhas de células normais 3T3 de Swiss albino e TIG-103 [38]. No presente estudo, mostrou que casticina especificamente induzida apoptose em células de cancro gástrico humano, mas não nas células GES-1, embora o mecanismo de indução selectiva de apoptose ainda não foi determinada. Nossos resultados sugerem que casticina pode ser um agente específico anti-tumor com baixa toxicidade.

Em resumo, os nossos resultados demonstram que casticina contribui para a sensibilidade das células tumorais a trilha utilizando vários mecanismos. Casticina promove inicialmente geração de ROS e desencadeia o estresse ER, em seguida, induz DR5 regulação positiva através da ativação de CHOP o que consequentemente aumenta a ativação induzida por TRAIL de DR5-induzida e vias de apoptose mediada por mitocôndrias. Simultaneamente, casticina facilita a morte celular por apoptose induzida por TRAIL pela inibição da expressão da proteína anti-apoptose e activação de proteínas pró-apoptose. Futuras investigações devem ser destinadas para realizar plenamente o potencial de uma combinação de terapia casticina e TRAIL para tratar pacientes com câncer gástrico. Portanto, serão necessários estudos adicionais das acções de casticina em modelos animais.

Materiais e Métodos

Reagentes

casticina (pureza ≥ 98%) foi adquirida a partir de Chengdu Biopurify fitoquímicos Ltd. (Chengdu, China), presente como cristais amarelos (peso molecular, 374,3). Casticina foi dissolvido em dimetil-sulfóxido (DMSO) para fazer uma solução de /l de estoque de 10 mmol e diluída num meio de cultura de células para a concentração necessária imediatamente antes da utilização. Os seguintes reagentes foram adquiridos a partir de Hunan Clonetimes Biotech Co. Ltd. (Changsha, China): solúvel de TRAIL humano recombinante (Pepro Tech), apoptose celular Kit de Detecção de ELISA (Roche), 2 ', 7'-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA; Molecular Probes Inc), salubrinal (EMD Chemicals, Inc. San Diego, CA), N-acetilcisteína (NAC; Sigma), a tunicamicina (Sigma), iodeto de propídio (PI; Sigma), a caspase 3 Actividade Detecção Kit (Millipore), Caspase 8 Colorimetric Assay Kit Actividade 25 (Millipore), a caspase 9 Colorimétrico Actividade Assay Kit (Millipore), anticorpo contra DR5 (ProSci Inc). Os anticorpos contra DR4, PARP, Bcl-2, Bax, Bid, survivin, CHOP, GRP78 e ATF4 foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology. O anticorpo anti-XIAP foi adquirido a Cell Signaling Technology, Danvers, EUA. inibidores de caspases, como zVADfmk, zDEVD-fmk, zIETD-fmk e zLEHD-fmk foram adquiridos de R & D Systems (Minneapolis, MN)

cultura celular

BGC-823, a SGC. -7901 e MGC-803 células cancerosas gástricas humanas foram obtidas a partir do Centro China para Type Culture Collection (CCTCC; Wuhan, China) e 1 GES células do Instituto de Oncologia na Universidade de Pequim. As células foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Invitrogen), 100 U /ml de penicilina e 100 U /ml de estreptomicina, em atmosfera humidificada com 5% de CO _{2 a 37 ° C. As células foram tratadas com várias concentrações de casticina ou TRAIL ou ambos para o ensaio de MTT. Casticina (1,0 umol /L) e pista (25, 50 ng /ml) sozinhos ou em combinação foram aplicados a BGC-823 células utilizadas para detectar a apoptose.}

Ensaio MTT

As células foram semeadas numa placa de 96 poços a uma densidade de 0.5104 células /poço e incubado durante 24 h, seguido por tratamento com várias concentrações de casticina e TRAIL durante 24 h ou tratados com casticina durante 12 h seguido por tratamento com TRAIL durante mais 24 h. análise colorimétrica do MTT foi realizado como descrito anteriormente [10]. A IC _{50 valor, no qual 50% de inibição de crescimento celular comparada com o controlo dimetil sulfóxido (DMSO), foi calculada por análise de regressão não linear, utilizando o software GraphPad Prism (San Diego, CA).}

Fluxo citometria utilizando coloração de PI

As células foram semeadas a uma densidade de 4 x 10 ^{6 células /ml em 100 ml de frascos de cultura de 24 h e, em seguida, tratadas com meio contendo várias concentrações de casticina ou TRAIL ou os dois juntos durante os tempos indicados. apoptose celular foi detectado utilizando citometria de fluxo. (FCM; americana BD Company, FACS 420)}

Histona /fragmento de DNA de ELISA

O kit de detecção de apoptose celular ELISA foi utilizado para detectar a apoptose em células tratadas com casticina de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células foram semeadas numa placa de 96 poços a uma densidade de 1 x 10 ^{4 células /poço, durante 24 h, e o meio contendo várias concentrações de casticina adicionado conforme necessário. Após 24 h, o citoplasma dos grupos de controlo e de tratamento foi transferido para a placa de 96 poços peridiumed pela estreptavidina, incubadas com o anticorpo de histona biotinilado e o DNA de rato anti-humano marcado com peroxidase durante 2 h à temperatura ambiente. A absorvância a 405 nm foi medida com um aparelho de imunossorvente EXL-800 tipo Enzyme-Linked.}

Análise de caspase-3, -8 e -9 actividades

As actividades de caspase-3, -8 e -9 foram avaliados usando o Kit de Detecção 3 Actividade de Caspase, a caspase 8 Colorimetric Assay Kit Actividade 25 e a caspase 9 Colorimétrico Actividade Assay Kit, respectivamente. Em resumo, os lisados ​​celulares foram preparados após o respectivo tratamento com agentes experimentais. Os ensaios foram realizados em placas de 96 poços por incubação de 20 ug de lisados ​​de células em 100 ul de tampão de reacção (1% de NP-40, Tris-HCl a 20 (pH 7,5), NaCl 137 mM, glicerol a 10%) contendo 5 uM do substrato da caspase-3 Ac-DEVD- p
nA, a caspase-8 substrato Ac-IETD- p
AN ou caspase-9 substrato Ac-LEHD- p
NA.

• PLOS ONE: Fase II estudo avaliando 2 esquemas de dosagem de Foretinib Oral (GSK1363089), cMET /VEGFR2 Inhibitor, em Pacientes com metastático Câncer Gástrico
• PLOS ONE: associação entre a redução dos níveis plasmáticos de adiponectina e risco de infecção bacteriana após cirurgia de câncer gástrico