PLOS ONE: A nicotina inibe Cisplatina apoptose induzida por via regulação da sinalização α5-nAChR /AKT em Câncer gástrico humano Cells

Abstract

incidência de câncer gástrico demonstra uma associação etiológico forte com o tabagismo. A nicotina, o componente principal do tabaco, é um agonista de sobrevivência que inibe a apoptose induzida por certos agentes quimioterapêuticos, mas os mecanismos precisos envolvidos permanecem em grande parte desconhecida. Recentemente estudos têm indicado que receptor de acetilcolina nicotínico α5-(α5-nAChR) é altamente associado com o risco de câncer de pulmão e dependência da nicotina. No entanto, nenhuma informação está disponível sobre se a nicotina também afeta a proliferação de células cancerosas gástricas humanas através da regulação de α5-nAChR. Para avaliar a hipótese de que α5-nAChR podem desempenhar um papel no cancro gástrico, foi investigada a sua expressão em tecidos de cancro gástrico e linhas celulares. A expressão de α5-nAChR aumentada em tecido de cancro gástrico em comparação com tecidos para-carcinoma. Em vista dos resultados, procedeu-se a investigar se a nicotina inibe a apoptose induzida pela cisplatina por meio de regulação α5-nAChR em células de câncer gástrico. Os resultados mostraram que a nicotina promoveu significativamente a proliferação de células em uma dose e modo dependente do tempo através da activação α5-nAChR em células gástricas humanas. Além disso, a nicotina inibiu a apoptose induzida por cisplatina. Silêncio de α5 nAChR-ablated os efeitos protetores da nicotina. No entanto, quando se co-administrar o LY294002, um inibidor de PI3K /AKT, foi observado um aumento da apoptose. Este efeito correlacionada com a indução de Bcl-2, Bax, survivina e Caspase-3 por nicotina em linhas de células gástricas. Estes resultados sugerem que a exposição a nicotina pode ter um impacto negativo no potencial apoptótica de fármacos quimioterapêuticos e que a sinalização de α5-nAChR /AKT desempenha um papel fundamental na actividade anti-apoptótica de nicotina induzida pela cisplatina

citação:. Y Jia , Sun H, Wu H, Zhang H, Zhang X, Xiao D, et al. (2016) nicotina inibe Cisplatina apoptose induzida por via Reguladora α5-nAChR /Sinalização AKT em células de câncer gástrico humano. PLoS ONE 11 (2): e0149120. doi: 10.1371 /journal.pone.0149120

editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, United States |

Recebido: 01 de junho de 2015; Aceito: 15 de janeiro de 2016; Publicação: 24 de fevereiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Jia et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Devido restrições impostas pelo Hospital Central Jinan, os dados estão disponíveis mediante solicitação. pesquisadores interessados ​​podem entrar em contato com Dr. Xiaoli Ma ([email protected]) para solicitar o acesso aos dados

Financiamento:. Este trabalho é apoiado pela National Science Foundation Natural da China (No. 81.272.588) e Shandong Provincial de Ciências Naturais Fundação da China (No. ZR2012HM061and ZR2013CM010)

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é uma das principais causas. das mortes por câncer no mundo. Aparentemente, fatores genéticos e ambientais estão envolvidos na carcinogênese gástrica. achados anteriores, revelaram a forte associação entre o fumo do cigarro ea incidência de câncer gástrico [1-3], no entanto, o mecanismo detalhada ainda não foi completamente estudado.

A nicotina, um dos principais componentes da fumaça do cigarro, foi mostrado para estar envolvida na iniciação, promoção, progressão e mesmo de vários tumores, incluindo o cancro gástrico. Várias linhas de evidência sugerem que a nicotina exerce as suas funções celulares através de receptores nicotínicos da acetilcolina (nAChRs). células epiteliais diferentes, não apenas as células neuronais, nAChRs expressas e a estrutura do nAChRs é um homo (α7or α9) ou heteropentamer (α2-α10; b2-B4). Estudos têm demonstrado que a nicotina estimula a proliferação de células de cancro gástrico humano por meio de sua interacção com α7-nAChR [4, 5]. Enquanto os diferentes membros da família nAChR podem regular convergindo vias de sinalização, que muitas vezes têm diversas e até opostas ações. Recentemente, estudos de associação de genoma de largura indicaram que α5-nAChR é altamente associado com o risco de câncer de pulmão e dependência de nicotina [6, 7]. No entanto, nenhuma informação está disponível sobre se a nicotina também afeta a proliferação de células cancerosas gástricas humanas através da regulação de α5-nAChR.

A entrega de cisplatina agente quimioterápico após ressecção cirúrgica define atualmente o tratamento padrão para câncer gástrico [8 -10]. Infelizmente, a resistência adquirida à cisplatina é comum e a evasão da apoptose das células é reconhecida como um dos principais mecanismos responsáveis ​​pela resistência à cisplatina [11, 12]. Em particular, a nicotina poderia inibir a apoptose induzida por cisplatina em células de cancro do pulmão [13-15] e cancros oral [16]. O efeito inibitório da nicotina sobre a apoptose tem sido atribuído à sua capacidade para activar proteínas anti-apoptóticas como Bcl-2 e Survivina, bem como a inactivação de proteínas pró-apoptóticas como Bax e caspase-3, através da activação de ambos PI3K /AKT e PKC /ERK sinalização em células cancerosas [13-15]. Este efeito da nicotina sobre a apoptose das células também é mediada pelo nAChR, mas além de α5-nAChR, outras subunidades parecem estar envolvidos [17, 18].

Embora muitos destes mecanismos foram observados no cancro do pulmão [19-21], não há nenhuma evidência do efeito anti-apoptótico e o mecanismo exercida pela nicotina em células de cancro gástrico. O objetivo do presente estudo foi investigar a nicotina inibe a apoptose induzida pela cisplatina por meio de regulação α5-nAChR em células de câncer gástrico. Além disso, propõe-se o envolvimento de fatores pró-sobrevivência, tais como Bcl-2 e Survivin, ativados por vias AKT, respectivamente.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

o protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética médica e Clínica Humano Comitê Trial of the Hospital Central Jinan. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes.

Os espécimes de tecido, cultura de células e tratamento da toxicodependência

Cinquenta, amostras embebidos em parafina fixadas em formalina contendo 40 espécimes de câncer gástrico e 10 tecidos para-carcinoma foram retrospectivamente e, aleatoriamente selecionadas a partir dos arquivos do Hospital Central Jinan após o protocolo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa local. De acordo com o registro de fumar (ou não) na história do caso dos pacientes, 32 casos não tinham história ingestão de fumar, 8 tinham história ingestão de fumar. Todas as amostras foram avaliadas para o diagnóstico por dois patologistas experientes para diagnóstico.

As linhas celulares de cancro gástrico humano MKN28, SGC7901, BGC823, MGC803, AGS, HGC27, e MKN45 foram obtidos a partir do Banco de Célula de Shanghai, Instituto de Bioquímica e Biologia celular, da Academia chinesa de Ciências. As células foram cultivadas em DMEM (Invitrogen) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; Invitrogen), 1% de antibióticos, a 37 ° C em 5% de CO2 do ar humidificado. Em todas as experiências, 60-70% de células confluentes foram lavadas e incubadas em meio isento de soro durante 24 horas antes do tratamento com nicotina, cisplatina e LY294002 (Sigma, St. Louis, MO) durante o tempo indicado.

imunohistoquímica

coloração imuno-histoquímica utilizando o método da peroxidase de estreptavidina (método SP) foi realizada em secções de 4 | iM espécimes embebidos em parafina para detectar a expressão α5-nAChR em tecidos de cancro e para-carcinoma gástrico. Em resumo, após desparafinização e hidratação, os slides foram tratados com peroxidase endógena em 0,3% H _{2O 2 durante 30 min e bloqueadas durante 2 h a temperatura ambiente com 1,5% de bloqueio de soro em solução salina tamponada com fosfato (PBS ). As secções foram então incubadas com anti-α5-nAChR anticorpo (Abcam, Inc. Cambridge, MA) (diluição 1: 100) a 4 ° C durante a noite, lavou-se com PBS, e incubadas com o anticorpo biotinilado anti-ratinho secundário (KIT-5010 , Max Vision, Maixin.Bio, China) (1: 2000) em PBS durante 30 min a 37 ° C. A ligação do anticorpo foi detectada usando o complexo biotina-estreptavidina-peroxidase /HRP (Código K0377; Dako) com 3, 3- diaminobenzidina durante 3 min como um substrato cromogénico. As lâminas foram então contrastadas com hematoxilina levemente. Como controlo negativo, as secções duplicadas foram coradas sem exposição aos anticorpos primários. Os resultados foram observados sob um microscópio.}

quantitativo em tempo real de RT-PCR

O ARN total foi isolado utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Vinte e cinco nanogramas de RNA total por amostra foi transcrito de forma inversa utilizando o Kit de reacção de transcrição inversa (Takara Código: DRR061S) de acordo com as instruções do fabricante. Quantitative PCR em tempo real foi realizada em analisados ​​os Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System para determinar as quantidades relativas de α5-nAChR e β-actina (controlo interno) mRNAs expressos. O SYBR Green Supermix foi usado para todas as reacções de PCR em tempo real. iniciadores de PCR utilizados neste estudo são as seguintes: α5 nAChR-Forward: GAAACTGAGAGTGGTAGTGGACCAA, Reverso: GGGCTATGAATTTCC AATCTTCAAC; gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) para a frente, 5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 'e inverso, 5'-AGTCCTTCCACG ATACCAAAGT-3'. Os parâmetros de PCR quantitativa em tempo real foram de 95 ° C durante 10s, como um passo de pré-desnaturação seguido por 40 ciclos de PCR de 95 ° C durante 5 s, 60 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 10 min. Todas as amostras foram realizadas em triplicado em cada experiência. A quantidade relativa de ARNm foi calculada usando o método comparativo CT após a normalização para a p-actina níveis de mRNA.

análise de transferência de Western

As pelotas de células foram homogeneizadas em tampão de extracção (50 mmol /L de Tris-HCl , pH 6,8, 0,1% de SDS, 150 mol /L de NaCl, 100 mg /L de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 1 mg /L de aprotinina, 1% de NP-40 e 0,5% de ortovanadato de sódio), incubada a 4 ° C durante 30 minutos, e centrifugada durante 20 min a 12000 g /min. A proteína total no lisado celular foi medida com a utilização do kit colorimétrico da Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Para a análise de Western Blot, proteína total foi separado em 10% SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose (0,45 um, Millipore, Billerica, MA, EUA), que foram incubadas durante 24 h a 4 ° C com os anticorpos para α5-nAChR (1: 500, ou ab41173 ab166718), AKT (1: 500, gato Epitomics nO: 1085-1), a P-AKT (1: 500, gato Epitomics nO: 2118-1), caspase-3 (1: 500, Cat Epitomics nO: 1087-1), Bcl-2 (1: 500, gato Epitomics nO: 1017-1), Survivina (1: 500, gato Epitomics nO: 2463-1) e GAPDH (1: 1000; ab37168), em seguida, o anticorpo IgG peroxidase de rábano conjugado com anti-murganho /coelho (Santa Cruz Biotechnology), após uma lavagem final. Os sinais foram detectados com o uso de um kit de quimioluminescência aumentada (Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, Reino Unido). nível GAPDH foi um padrão interno

RNA de interferência

A vertente siRNA oligonucleotídeo dupla segmentação CHRNA5, que codifica α5-nAChR, (sentido:. 5'-CCCGCAAACUACAAAAGUUTT-3 ', antisense: 5' -AACUUUUCUAGUUUGCCGGTG-3 ') foi sintetizado por Shanghai Genepharma Co. Ltd. (China). Um par de siRNA controlo negativo também foi concebida com sequências diferentes de siRNA-CHRNA5 e não homólogas a sequências encontradas em qualquer banco de genes (com sentido: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ', anti-sentido: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGA-3'). As células foram plaqueadas em placas de seis poços. Quando as células atingiram 30-50% de confluência, os siRNAs foram adicionados a uma concentração final de 50 nM com lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.

Ensaio de viabilidade celular

A viabilidade celular foi determinado pelo ensaio de CCK8 (Dojindo, Tóquio, Japão). Resumidamente, as células semeadas em placas de 96 poços (1500 células /poço) foram tratados com nicotina nas doses indicadas. O ensaio de proliferação celular foi realizada por adição de 10 ul de solução de CCK8 a cada poço, seguido de incubação a 37 ° C durante 2 h. A absorvância foi medida a um comprimento de onda de 450 nm usando um leitor de microplacas (Synergy 2 Multi-Modo de Leitora; BioTek, Winooski, VT, EUA).

anexina V /7-AAD coloração

BGC823 células foram cultivadas em confluência em placas de 6 poços de cultura de tecidos (Falcon, Becton Dickinson Labware) em um meio completo. Em seguida, o meio foi substituído por meio completo fresco ou por meio isento de soro; as células foram então estimuladas com isoladamente ou em combinação com cisplatina 20 mM durante 24 h com base nos nossos dados anteriores 100 uM de nicotina, tripsinizadas e lavadas duas vezes com PBS. As células foram coradas com PE marcado anexina V /7-AAD (7-aminoactinomycine-D) de acordo com as instruções do fabricante (anexina V /7-AAD kit; Becton, Dickinson and Company). Em resumo, um pelete celular lavado foi ressuspendido em 500 uL de tampão de ligação. Em seguida, foram adicionados 5 ul de Anexina-V-PE e 5 ul de 7-AAD. análise de citometria de fluxo foi realizada imediatamente após a coloração supravital. aquisição e análise de dados foram realizados num fluxo Becton Dickinson FACSCalibur utilizando o software CellQuest citómetro. As células em estágios iniciais de apoptose foram AnnexinV positiva e 7-AAD negativo, enquanto que as células nas fases tardias da apoptose foram AnnexinV e 7-AAD positivo.

Hoechst 33342 coloração

Células foram semeadas em placas de 12 poços de cultura de tecidos e tratados com as concentrações indicadas de nicotina e cisplatina. No final de cada incubação, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 20 min, lavadas com PBS, e depois incubaram-se com Hoechst 33342 (1 ug /ml) durante 10 min. Após lavagem com PBS, as células foram observadas utilizando um microscópio de fluorescência (Olympus, Japão). Pelo menos 400 células a partir de 12 campos selecionados aleatoriamente por placa foram contadas, e cada tratamento foi realizado em triplicado.

Estatísticas análise

O resultado da imunohistoquímica foi analisada através do χ ^{2 teste. Todos os resultados foram apresentados como média ± S.D. de experiências em triplicado realizada de um modo paralelo, a menos que indicado de outra forma. O significado da diferença entre os grupos de controlo e os grupos de tratamento de nicotina foi determinada por um teste t de Student bicaudal. As diferenças foram consideradas significativas para P < 0,05 ou P < 0,01.}

Resultados

expressões a5-nAChR em amostras de tecido de câncer gástrico e linhas celulares

A expressão de α5-nAChR foram detectados e localizados no tecido gástrico humano embebido em parafina Seções. α5-nAChR foi localizada principalmente na membrana das células tumorais, embora alguma coloração citoplasma foi também observado (Figura 1A). Expressão de α5-nAChR foi maior em tecidos de cancro gástrico (77,5%, 31/40) do que em tecidos de carcinoma de para-(20%, 2/10). Os resultados mostraram uma tendência de que a taxa positiva de expressão α5-nAchR aumentada em pacientes com histórico de consumo de nicotina (87,5%, 7/8), em comparação com os pacientes sem história consumo de nicotina (75,0%, 24/32).

α5-nAChR ARNm e proteína foram detectáveis ​​num painel de linhas celulares de cancro gástrico. As linhas celulares expressavam diferentes níveis de proteína α5-nAChR, em que linhas de células com uma expressão mais elevada foram BGC823, AGS e SGC7901 normalizados para que de GAPDH (Figura 1B). Os níveis de expressão de mRNA α5 nAChR-detectados por RT-PCR correlacionada com os níveis de expressão da proteína (Figura 1C). BGC823 expressa níveis mais elevados de α5-nAChR do que a de outras linhas celulares. Para experiências funcionais adicionais, linha de células BGC823 foi escolhido devido à sua expressão mais elevada (adequado para indução por nicotina ou silenciamento por siRNA).

A nicotina promoveu a proliferação de células de câncer gástrico através α5 nAChR-

Para determinar se a nicotina pode regular a proliferação de células gástricas, examinámos o efeito da nicotina com várias concentrações sobre a viabilidade das células em BGC823 por uma análise CCK8 (Fig 2A). BGC823 foram expostas à nicotina (0, 1, 10, 100, 500, 1.000 uM) durante 24, 48 e 72h, respectivamente. Como mostrado na Fig 2A, nicotina promoveu a proliferação de células em uma relação tempo-dependente e dependente da concentração. A nicotina estimulou significativamente a proliferação de células na concentração mais baixa (1, 10, 100, 500 uM) e tempo (24-72 horas), mas uma diminuição notável do número de células foi observada nas culturas tratadas com nicotina na concentração mais elevada (1.000 uM) e a hora (72 h). Estudos mostraram níveis de nicotina no corpo variam amplamente entre indivíduos, mesmo quando se fuma o mesmo número de cigarros idênticos [22-24] .A concentração de nicotina (100? M) utilizado no presente estudo imitou a ingestão diária de cigarros em fumantes moderados [ ,,,0],25, 26]. A concentração de nicotina (100? M) é equivalente a uma concentração na saliva em fumador que a ingestão de 25 cigarros /dia [27]. Para as experiências funcionais adicionais, a concentração de nicotina (100? M) foi escolhida para tratar células gástricas durante 24 h.

Para determinar se a promoção de nicotina mediada por proliferação celular em células gástricas é mediada através de sinalização α5-nAChR, analisou-se o efeito da nicotina sobre a expressão da proteína α5-nAChR em BGC823 células por Western blot. Como mostrado na Fig 2B, o tratamento de nicotina a uma dose de nicotina (0, 1, 10, 100, 500, 1.000 uM) durante 24 horas proporcionou a expressão de proteína α5-nAChR de uma forma dependente da dose. Para confirmar ainda mais o envolvimento das α5-nAChR via de sinalização na promoção mediada por nicotina da proliferação de células de cancro gástrico, que bloqueou a expressão da proteína α5-nAChR por transfecção BC823 células com um siRNA específico-α5-nAChR (Si-α5-nAChR) ( Figura 2C) e avaliados os seus efeitos sobre a promoção mediada por nicotina da proliferação celular pelo ensaio de CCK (Figura 2D). Em comparação com o controlo não específica mexidos siRNA (Si-CN), transfecção com proliferação celular inibida-nAChR Si-α5. Além disso, Si-α5-nAChR transfecção reduziu significativamente a promoção mediada por nicotina da proliferação celular em células BGC823 (Figura 2D).

A nicotina inibição de apoptose induzida por cisplatina

Para caracterizar ainda mais a apoptose efeitos da nicotina combinado com cisplatina em BGC823, a cisplatina foi usada para induzir a apoptose nas células BGC823. As células foram tratadas com cisplatina 20 mM [28]. Como mostrado na Fig 3A, as células apoptóticas se tornou de formato arredondado e seus núcleos exibiram uma morfologia fragmentada, formação de corpos apoptóticos. Em contraste, as células co-tratadas com nicotina e cisplatina mostraram pouca fragmentação nuclear e alguns corpos apoptóticos.

apoptose induzida por cisplatina foi adicionalmente ensaiado por coloração AnnexinV /7-AAD. A citometria de fluxo mostrou que as parcelas de proporções de células apoptóticas totais (AnnexinV + /7-AAD-) diminuiu from43.2 ± 2,32% to29.9 ± 1,26%, quando exposto a cisplatina combinado com 100? M de nicotina (Fig 3B). Estes resultados sugerem que a nicotina pode suprimir a apoptose induzida por cisplatina.

α5-nAChR via de sinalização /AKT envolvidos em efeitos anti-apoptóticos de nicotina na apoptose induzida por cisplatina de BGC823 células

Para determinar a papel de AKT na mediação dos efeitos da nicotina nestas células, determinou-se a nicotina induz a activação de AKT em BGC823 células. Na Figura 4A, a cisplatina 20 mM suprimiu fortemente a actividade de AKT (pista 2), mas a nicotina aumentou a expressão de AKT (pista 3) na presença de cisplatina. É sugerido que a AKT foi activado após exposição a 100? M de nicotina em células BGC823 como relatado em vários trabalhos [29, 30]. A infra-regulação da expressão α5-nAChR diminuição da expressão P-AKT (pista 4). O tratamento com LY294002 a 10 mM, um fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) /inibidor da via do AKT, diminuiu os efeitos anti-apoptóticos de nicotina em células BGC823 (pista 5). Além disso, o tratamento com LY294002 a transfecção combinada com Si-CHRNA5 significativamente reprimido a nicotina níveis de proteína P-AKT induzidas (pista 6). Estes dados sugerem que α5-nAChR /vias AKT desempenha um papel crítico na mediação dos efeitos da nicotina e quimioterapia em células de cancro gástrico.

Examinámos ainda mais os efeitos da nicotina sobre a activação induzida pela cisplatina caspase-3 em BGC823 células por ensaio Western blot. Como mostrado na Fig 4B, cisplatina induziu um aumento na activação de caspase-3, enquanto que a nicotina bloqueou a activação de caspase-3 induzida por cisplatina em BGC823 células. Além disso, a exposição das células à cisplatina BGC823 causou a expressão da proteína Bax apoptose aumentou, enquanto a proteína prosurvival Bcl-2 e diminuíram a Survivina, que foram inibidas por tratamento com nicotina.

Enquanto isso, como mostrado na Fig 4C, o efeito anti-apoptótica de nicotina foi obviamente bloqueado por si-α5-nAChR em BGC823 células. A citometria de fluxo lotes mostrou que a percentagem de células apoptóticas totais (AnnexinV + /7-AAD-) aumentou de 18,5 ± 0,92% para 34,9 ± 1,74% de Si após o 5-tratamento, em comparação com o grupo Si-CN. A adição de inibidor de AKT LY294002 com si-α5 nAChR-promovido significativamente o efeito apoptótica de cisplatina de 31,5 ± 1,57% para 61,2 ± 3,06% em comparação com o grupo de LY294002. Estes resultados indicam que a nicotina tem um papel importante na prevenção da apoptose induzida pela cisplatina por meio de via α5-nAChR /sinalização AKT.

Discussão

Este estudo é o primeiro a demonstrar um papel vital α5-nAChR em nicotina anti-apoptose de cisplatina em células cancerosas gástricas humanas. A análise de espécimes clínicos indicaram que a expressão α5-nAChR é geralmente mais elevada em células tumorais em comparação com células de carcinoma para-. Os resultados mostraram uma tendência de que a taxa positiva de expressão α5-nAchR foi maior em pacientes com história consumo de nicotina do que pacientes sem história consumo de nicotina. Os resultados in vitro mostraram que a nicotina se-regulada a expressão da proteína α5-nAChR e apoptose induzida por cisplatina inibiu a regulação da via de sinalização por α5-nAChR /AKT em células de cancro gástrico. A nicotina impediu a activação induzida por cisplatina de caspase-3 e Bax, e supra-regulados a expressão das proteínas anti-apoptóticas, Bcl-2 e Survivina. Além disso, a activação de AKT foi encontrado para desempenhar um papel na mediação da apoptose induzida por cisplatina, bem como efeitos anti-apoptóticos de nicotina em BGC823 células. Pode ser interessante para pagar a atenção para a relação entre a fumaça do cigarro (segunda tabagismo) ea incidência de câncer gástrico.

achados anteriores desvendados a forte associação entre o fumo do cigarro e câncer gástrico [31, 32]. A nicotina foi mostrada para aumentar a proliferação e migração de células de cancro gástrico, induzindo cyclooxgenase-2 (COX-2), prostaglandina E2, VEGF, p-adrenoceptores, proteína quinase C [26, 33, 34]. Estes efeitos parecem ser mediados através dos homopentameric-a7 nAChR [35]. No entanto, estudos recentes têm demonstrado um efeito inesperado das a5-nAChRs heteropentamérica no consumo de nicotina [36-38]. Os nossos trabalhos prévios relataram que a via de nicotina /α5-nAChR é crítico para a viabilidade celular de cancro do pulmão [21, 39]. No entanto, nenhuma informação está disponível sobre se a nicotina também afeta a proliferação de células cancerosas gástricas humanas através da regulação de α5-nAChR. Aqui, nós estudamos o papel de α5-nAChR no cancro gástrico humano. Os nossos resultados demonstraram que a expressão de α5-nAChR foi maior em tecidos de cancro gástrico em comparação com o tecido para-carcinoma, o que sugeriu que α5-nAChR podem desempenhar um papel na carcinogénese gástrica. Além disso, a nicotina promovida a expressão da proteína α5-nAChR e bloqueando a activação de α5-nAChR por ARNsi atenua a proliferação de células de cancro gástrico induzida por nicotina. É sugerido que α5-nAChR é uma das principais moléculas para mediar a proliferação celular estimulada por nicotina em células de cancro gástrico.

A corrente convencional de quimioterapia para o cancro gástrico é a cisplatina, mas a taxa de sucesso deste tratamento é pobre. A eficácia da cisplatina depende da capacidade para induzir danos no ADN [40, 41]. Assim, como as células cancerosas responder aos cisplatina induziu a apoptose desempenha um papel crítico na sensibilidade cisplatina. Relatórios recentes mostram que a nicotina inibe a cisplatina induziu apoptose em células de câncer de pulmão, câncer oral, as células RAW264.7 e EL4 [13, 16, 18], o que pode sugerir que a nicotina tem a capacidade não só para promover o desenvolvimento do câncer, ativando vias de crescimento celular , mas também para reduzir a eficácia dos agentes quimioterapêuticos por estimular os percursos de sobrevivência. De acordo com os resultados anteriores, os resultados do presente estudo demonstraram que foi observada co-tratamento das células com cisplatina e nicotina, uma activação significativa da caspase-3, o que indica que a nicotina é capaz de determinar a inibição do potencial apoptótica do cisplatina no câncer gástrico.

As vias de sinalização que regulam processos celulares, incluindo proliferação celular, a progressão do ciclo celular e apoptose celular, têm impacto significativo em decidir resposta celular à cisplatina. Estudos anteriores têm demonstrado que a activação de Akt pode conduzir a resistência a cisplatina [42, 43]. Uma sobre-expressão de serina fosforilada AKT tem sido detectado numa vasta gama de cancros humanos, incluindo o cancro gástrico [44, 45]. Como relatado em vários papéis, nicotina por ligação a nAChR conduz à activação a jusante de proteínas promotoras de tumores, incluindo a activação das vias de AKT [46-48]. A exposição à nicotina pode impactar negativamente sobre o potencial apoptótica de cisplatina em células cancerosas orais humanos e da via AKT foi necessário para a função de nicotina [16]. No entanto, Akt de sinalização a jusante nicotínico e os efeitos anti-apoptóticos de nicotina em células de cancro gástrico eram desconhecidos. Portanto, foi investigado se o P-AKT pode explicar o efeito antagonista da nicotina sobre a citotoxicidade de cisplatina. Descobrimos que um aumento da apoptose induzida por cisplatina co-tratadas com siRNA-α5-nAChR e LY294002, um inibidor de PI3K /Akt, e atenuou os efeitos da nicotina em BGC823 células. Vários estudos em destaque nicotina activadas vias de sinalização AKT, na modulação da proliferação celular e sobrevivência através da activação da proteína Bcl-2 prosurvival e Survivina [15, 49, 50]. A nossa investigação também demonstrou que o papel da nicotina na apoptose celular induzida pela cisplatina por meio de α5-nAChR /AKT é confirmada por indução de Survivina e Bcl-2, como efectores finais das vias acima.

Em resumo, demonstrámos que a nicotina activado α5-nAChR sinalização /AKT e está envolvido na resistência de cisplatina em cancro gástrico. Estes resultados fornecem novas perspectivas sobre os possíveis mecanismos moleculares da inibição da nicotina de apoptose induzida pela cisplatina em células cancerosas gástricas humanas (figura 5). A nicotina presente na fumaça do cigarro pode interferir com câncer gástrico tratamento farmacológico por inibir a apoptose induzida por drogas quimioterápico. Estratégias destinadas a compreender a sinalização mediada por nicotina pode facilitar o desenvolvimento de terapias melhoradas no câncer gástrico.

Informações de Apoio
S1 Fig. Expressão de α5-nAChR e α7-nAChR sem ou com tratamento α5-siRNA
doi:. 10.1371 /journal.pone.0149120.s001
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S2 Fig. Down-regulação da expressão de α5-nAChR diminuiu o nível de P-AKT
doi:. 10.1371 /journal.pone.0149120.s002
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S3 Fig. Expressão de α5-nAChR em BGC823 células sem ou com tratamento si-α5 nAChR-
doi:. 10.1371 /journal.pone.0149120.s003
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S4 Fig. A nicotina promoveu BGC823 proliferação celular através α5-nAChR e α7-nAChR
doi:. 10.1371 /journal.pone.0149120.s004
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S5 Fig. A nicotina promoveu SGC7901 proliferação celular através α5 nAChR-
doi:. 10.1371 /journal.pone.0149120.s005
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S6 Fig. inibição de nicotina de apoptose induzida por cisplatina de SCG7901
doi:. 10.1371 /journal.pone.0149120.s006
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