PLoS ONE: Nikotinas slopina cisplatinos sukeltos apoptozės per reguliavimas α5-nAChR /AKT signalizacijos Žmogaus Skrandžio vėžio ląsteles

Anotacija

Skrandžio vėžio dažnis parodo stiprią etiologinis asociacijos rūkyti. Nikotinas, pagrindinis komponentas tabako, yra išlikimo agonistas, kuris slopina apoptozę sukeltas tam tikrų chemoterapiniais preparatais, tačiau tikslios mechanizmus, iš esmės tebėra nežinoma. Neseniai atlikti tyrimai parodė, kad α5-nikotino acetilcholino receptorių (α5-nAChR) yra labai susijęs su plaučių vėžio rizikos ir nikotino priklausomybės. Nepaisant to, jokia informacija buvo prieinama apie tai, ar nikotinas taip pat turi įtakos plitimą žmogaus skrandžio vėžio ląsteles per reguliavimo α5-nAChR. Įvertinti hipotezę, kad α5-nAChR gali vaidinti svarbų vaidmenį skrandžio vėžio, mes ištirti savo išraišką skrandžio vėžio audinių ir ląstelių linijų. Iš α5-nAChR išraiška padidėjo skrandžio vėžio audinyje lyginant su pusiau karcinoma audiniuose. Atsižvelgiant į rezultatus, pradėjo tirti, ar nikotinas slopina cisplatiną sukeltos apoptozės per reguliavimo α5-nAChR skrandžio vėžio ląstelių. Rezultatai parodė, kad nikotino žymiai skatinamas ląstelių proliferaciją in dozę ir laiko priklausomu būdu per α5-nAChR aktyvacijos žmogaus skrandžio ląstelių. Be to, nikotinas slopina apoptozę sukelta cisplatinos. Tyla α5-nAChR išgarina apsauginį poveikį nikotino. Tačiau, kai bendrai administruojant LY294002, kurio PI3K /AKT kelyje inhibitorių, pastebėta padidėjusi apoptozė. Šis poveikis koreliuoja su Bcl-2, Bax, Survivin ir kaspazės-3 indukcijos nikotino skrandžio ląstelių linijų. Šie rezultatai rodo, kad ekspozicija nikotino gali neigiamai paveikti apoptozės potencialą chemoterapiniais vaistais ir kad α5-nAChR /AKT signalizacijos vaidina svarbų vaidmenį sukeltos cisplatina anti-apoptozės veiklos nikotino

nurodomoji dalis:. Jia Metai Sun H, Wu yra H, Zhang, yra H, Zhang X, Xiao D, ir kt. (2016) Nikotinas slopina cisplatinos sukeltos apoptozės per reguliavimas α5-nAChR /AKT signalizacijos Žmogaus skrandžio vėžio ląsteles. PLoS ONE 11 (2): e0149120. Doi: 10,1371 /journal.pone.0149120

redaktorius Salvatore V. Pizzo, Duke universiteto medicinos centras, JAV

Įstojo: Birželis 1, 2015 m Priėmė: 15 sausio, 2016 m Paskelbta: Vasario 24, 2016

Visos teisės saugomos: © 2016 Jia et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų prieinamumas:. Atsižvelgdami į tai, nustatytų Jinan centrinės ligoninės apribojimai, duomenų pareikalavus. Suinteresuotosios tyrėjai gali susisiekti dr Xiaoli mA ([email protected]) prašyti prieigos duomenų

Finansavimas:. Šis darbas yra remiama Nacionalinio Gamtos mokslo fondo Kinijos (Nr 81.272.588) ir Shandong provincijos gamtos mokslų fondas Kinijos (Nr ZR2012HM061and ZR2013CM010)

konkuruojančių interesų. autoriai paskelbė, kad konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra viena iš pagrindinių priežasčių. mirčių nuo vėžio visame pasaulyje. Matyt, tiek genetiniai ir aplinkos veiksniai dalyvauja skrandžio kancerogenezėje. Ankstesnės išvados išardyti tvirtą ryšį tarp cigarečių dūmų ir skrandžio vėžio atvejų [1-3], tačiau išsamus mechanizmas dar nėra visiškai ištirtas.

Nikotinas, pagrindinė sudedamoji cigarečių dūmų, buvo įrodyta, kad būti įtraukti į inicijavimo, pareigų paaukštinimo ir net progresavimo kelių navikų, įskaitant skrandžio vėžio. Kai kurie faktai rodo, kad nikotino daro savo mobiliuosius funkcijas per nikotino acetilcholino receptorių (nAChRs). Įvairūs epitelio ląstelės ne tik neuronų ląstelės, skubus nAChRs ir nAChRs struktūra yra Homosexual (α7or α9) arba heteropentamer (α2-α10; B2-B4). Tyrimai parodė, kad nikotinas stimuliuoja žmogaus skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją per jos sąveiką su α7-nAChR [4, 5]. Nors skirtingi nariai nAChR šeimos gali reguliuoti susilieja signalizacijos kelius, jie dažnai turi skirtingus ir net priešingų veiksmų. Neseniai genomo pločio asociacijos tyrimai parodė, kad α5-nAChR yra labai susijęs su plaučių vėžio rizikos ir priklausomybei nuo nikotino [6, 7]. Nepaisant to, jokia informacija buvo prieinama apie tai, ar nikotinas taip pat turi įtakos plitimą žmogaus skrandžio vėžio ląsteles per reguliavimo α5-nAChR.

chemoterapinių agentų cisplatina pristatymas po chirurginės rezekcijos metu apibrėžia standartinį gydymą skrandžio vėžio [8 -10]. Deja, įgytas atsparumas cisplatinos yra bendras ir vengimas ląstelių apoptozės yra pripažinta kaip viena iš pagrindinių mechanizmų, atsakingų už pasipriešinimą cisplatina [11, 12]. Visų pirma, nikotinas gali slopinti apoptozę sukeltas cisplatina plaučių vėžio ląstelių [13-15] ir burnos vėžio [16]. Šis poveikis nikotino nuo apoptozės buvo priskirtas jos gebėjimas aktyvuoti Anti-apoptozinių baltymus kaip BCL-2 ir Survivin, taip pat nukenksminimą proapoptotic baltymų, pavyzdžiui, Bax ir kaspazės-3, per tiek PI3K /AKT ir PKC aktyvavimo /ERK signalizacijos keliai vėžinių ląstelių [13-15]. Tai nikotino poveikis ląstelių apoptozę taip pat tarpininkaujant nAChRs, bet be α5-nAChR, kitų subvienetų atrodo, kad būti įtraukti [17, 18].

Nors daugelis iš šių mechanizmų buvo pastebėta plaučių vėžio [19-21], yra ne anti-apoptozės poveikį, duomenų ir mechanizmas, kuria nikotino dėl skrandžio vėžio ląsteles. Šio tyrimo tikslas buvo ištirti nikotino slopina cisplatiną sukeltos apoptozės per reguliavimo α5-nAChR skrandžio vėžio ląstelių. Be to, mes pasiūlyti PRO-išgyvenimo veiksnių, tokių kaip BCL-2 ir Survivin, kurį įjungia akt kelius dalyvavimą, atitinkamai.

Medžiagos ir metodai

Etika pareiškimas

tyrimo protokolas buvo patvirtintas medicinos etikos ir žmogaus klinikinio tyrimo komiteto Jinan Centrinės ligoninę. Parašė informuotas sutikimas buvo gautas iš visų pacientų.

Audinių mėginiai, Ląstelių kultūros ir narkotikų gydymas

Penkiasdešimt formalino fiksuotas, parafino-embedded bandiniai su 40 egzempliorių skrandžio vėžio ir 10 punktas karcinomos audinius retrospektyviai ir atsitiktinai atrinkti iš Jinan centrinės ligoninės failus po protokolas buvo patvirtintas vietos mokslinių tyrimų etikos komitetas. Pasak rūkyti (arba ne) tuo atveju, istorijos pacientų įrašo, 32 atvejų neturėjo rūkyti įsiurbimo istorija, 8 turėjo rūkyti įsiurbimo istoriją. Visi mėginiai buvo įvertintas diagnozuoti du patyrę patologai diagnozės.

žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas MKN28, SGC7901, BGC823, MGC803, AGS, HGC27 ir MKN45 buvo gauti iš ląstelių banko Šanchajuje institutas Biochemijos ir ląstelių biologijos, Kinijos mokslų akademijos. Ląstelės buvo auginamos DMEM (Invitrogen), papildytoje su 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS; Invitrogen), 1% antibiotikų 37 ° C temperatūroje 5% CO2 drėkinamas orą. Visuose eksperimentuose, 60-70% Susiliejančio ląstelių buvo plaunamos ir inkubuojami į terpėje serumo neturinčioje už 24 valandas iki gydymo nikotino, cisplatina ir LY294002 (Sigma, St. Louis, MO) dėl nurodytu laiku.

imunohistocheminis

imunohistocheminį dažymo naudojant avidino peroksidazės metodu (SP metodu) buvo atlikta 4 mkm skyriuose parafino įterptųjų egzempliorių aptikti α5-nAChR išraišką skrandžio vėžio ir pusiau karcinoma audiniuose. Trumpai tariant, po to, kai deparaffinization ir hidratacijos, skaidres buvo gydomi endogeninio peroksidazės į 0,3% H _{2O 2 30 min ir blokuojamas 2 h kambario temperatūroje su 1,5% blokuoja serumo tirpalo fosfato buferio druskų tirpalo (PBS ). tada dalys buvo inkubuotos su anti-α5-nAChR antikūno (Abcam, Inc Cambridge, MA) (1: 100 praskiedimas), esant 4 ° C temperatūroje per naktį, išplautos su PBS, ir inkubuojami su antriniais anti-pelės biotinilinta antikūnų (KIT-5010 , maks vizija, Maixin.Bio, Kinija) (1: 2000) PBS 30 min 37 ° C temperatūroje. Antikūnų jungimosi buvo aptiktas naudojant avidino-biotino-peroksidazės komplekso /HRP (kodas K0377; DaKo) su 3, 3- diaminobenzidinas 3 min kaip chromogeniniu substrato. Skaidrės buvo tada švelniai counterstained hematoksilinu. Kaip neigiamos kontrolės, pasikartojančių skyriai buvo tamsintas be poveikio pirminių antikūnų. Rezultatai buvo pastebėta po mikroskopu.}

Kiekybiniai Realaus laiko PGR

Viso RNR buvo išskirta naudojant Trizol reagento (Invitrogen) pagal gamintojo instrukcijas. Dvidešimt penkių nanogram RNR už mėginio buvo atvirkštinis perrašyti naudojant atvirkštinę transkripciją reagavimo rinkinį (Takara kodas: DRR061S) pagal gamintojo instrukcijas. Kiekybinis realaus laiko PGR buvo atliekama analizuojama remiantis Applied Biosystems 7300 realiojo laiko PGR sistema, siekiant nustatyti santykinius kiekius α5-nAChR ir beta-aktino (vidinė kontrolė) mRNR išreikšta. SYBR Žalioji SUPERMIX buvo naudojamas visų realaus laiko PGR reakcijų. PGR pradmenis, naudojami šiame tyrime, yra šie: α5-nAChR Persiųsti: GAAACTGAGAGTGGTAGTGGACCAA, Reversas: GGGCTATGAATTTCC AATCTTCAAC; gliceraldehido 3-fosfato dehidrogenazės (GAPDH) į priekį, 5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 'ir atbulinės eigos, 5'-AGTCCTTCCACG ATACCAAAGT-3'. Kiekybiniai realaus laiko PGR parametrai buvo 95 ° C 10s kaip iš anksto-denatūruoti žingsnio, po to 40 PGR ciklų 95 ° C temperatūroje 5 S, 60 ° C temperatūroje 30 s ir 72 ° C temperatūroje 10 min. Visi mėginiai buvo atliktas trimis egzemplioriais Kiekvieno eksperimento metu. Santykinis dydis iRNR buvo apskaičiuojamas naudojant lyginamąjį metodą CT po normalizacijos į beta-aktino iRNR kiekį.

imunoblotingu analizė

Mobilaus ryšio granulės homogenizuoti gavybos buferio (50 mmol /l Tris-HCl , pH = 6,8, 0,1% SDS, 150 mkmol /l NaCl, 100 mg /l fenilmetilsulfonilfluoridą fluorido, 1 mg /l aprotinino, 1% NP-40 ir 0,5% natrio orthovanadate), inkubuojamos 4 ° C temperatūroje 30 min, ir centrifuguojamas 20 min 12000 g /min. Bendras baltymas yra į ląstelių lizato buvo matuojamas su naudojimo Bio-Rad kolorimetrinės rinkinio (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Vakarų blot analizė, kad bendras baltymas buvo atskirtos 10% SDS-PAGE ir perkeliamas ant nitroceliuliozės membranos (0,45 mkm, Millipore ", Billerica, MA, JAV), kuris buvo inkubuojami už 24 h, esant 4 ° C temperatūroje su už α5-nAChR antikūnų (1: 500, ab41173 arba ab166718), AKT (1: 500, Epitomics Kat: 1085-1), P-AKT (1: 500, Epitomics Kat: 2118-1), kaspazės-3 (1: 500, Epitomics Kat: 1087-1), BCL-2 (1: 500, Epitomics Kat: 1017-1), Survivin (1: 500, Epitomics Kat: 2463-1) ir GAPDH (1: 1000; ab37168) tada krienų peroksidazės-konjuguoto anti-pelės /triušis IgG (Santa Krusas biotechnologijos) po galutinio skalbimui. Signalai buvo aptikta su naudojimo sustiprinto cheminės liuminescencijos komplektas (Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, Jungtinė Karalystė). GAPDH lygis buvo vidinis standartas

RNR interferencija

dviguba gija siRNR oligonukleotidas orientacija CHRNA5, kuris koduoja α5-nAChR (jausmas:. 5'-CCCGCAAACUACAAAAGUUTT-3 ", Priešprasminis: 5 ' -AACUUUUCUAGUUUGCCGGTG-3 ") buvo susintetintas Šanchajus Genepharma Co Ltd (Kinija). Iš neigiamos kontrolės siRNA pora taip pat buvo sukurta su sekomis, kurios skiriasi nuo siRNA-CHRNA5 o ne homologinių į visus rastus genų banko sekų (ta prasme: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ", Priešprasminis: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGA-3"). Ląstelės buvo padengtą šešių-duobučių lėkštelėse. Kai ląstelės pasiekė 30-50% santaką, kad siRNAs buvo įtraukta į galutinė koncentracija 50 nm lipofectamine 2000 (Invitrogen) pagal gamintojo nurodymus.

Mobilusis gyvybingumo tyrimą

Ląstelių gyvybingumas buvo nustatomas pagal CCK8 tyrime (Dojindo, Tokijas, Japonija). Trumpai, ląstelės, padengtą 96-duobučių lėkštelėse (1500 ląstelių /gerai) buvo gydomi nikotino ne nurodytas dozes. Ląstelių proliferacijos tyrimu buvo atlikta iki 10 mikrol CCK8 tirpalo į kiekvieną šulinėlį, o po to inkubacijos 37 ° C temperatūroje 2 val. Optinių buvo matuojamas esant 450 nm bangos ilgiui, naudojant microplate skaitytojui (sinergija 2 Multi-mode microplate Reader; BioTek, WINOOSKI, VT, JAV).

aneksinu /7-AAD dažymo

BGC823 ląstelės buvo auginamos ne santakoje į 6-duobučių audinių kultūros plokščių ( "Sakalas", "Becton Dickinson laboratory) į visiškai terpėje. Tada vidutinės buvo pakeičiama šviežia visiškai laikmenoje arba serumo neturinčioje terpėje; Po to ląstelės buvo stimuliuojama su vieno arba derinyje su 20 mM cisplatina 24 h remiantis mūsų ankstesniais duomenimis 100 pM nikotino, tripsinizuojamos ir plaunama du kartus PBS. Ląstelės buvo tamsintas su PE paženklinti aneksinu /7-AAD (7-aminoactinomycine-D), atsižvelgiant į gamintojo nurodymus (aneksinu /7-AAD rinkiniu; Becton, Dickinson and Company "). Trumpai tariant, plauti ląstelių nuosėdos buvo resuspenduotos 500 pL rišikliais buferį. Kitas, 5 mikrol aneksinas-V-PE ir 5μl 7-AAD buvo pridėta. Tėkmės citometrijos analizė buvo atliekama iš karto po supravitaliniu dažymo. Duomenų rinkimo ir analizės buvo atliekama Becton Dickinson FACSCalibur srauto citometro naudojant CellQuest programinę įrangą. Į ankstyvosiose stadijose apoptozės ląstelės buvo AnnexinV teigiamas ir 7-AAD neigiamas, o vėlesniuose etapuose apoptozės ląstelės buvo tiek AnnexinV ir 7-AAD teigiamas.

Hoechst 33342 dažymo

Ląstelės buvo pasėjamos į 12-duobučių audinių kultūros plokščių ir apdorojimo su nurodytomis koncentracijos nikotino ir cisplatina. Kiekvieno Inkubavimo pabaigoje, ląstelės buvo nustatyti su 4% paraformaldehido 20 min, plaunamas PBS, ir tada inkubuojami su Hoechst 33342 (1 g /ml) 10 min. Po plovimo su PBS, ląstelės buvo pastebėtas naudojant fluorescentinės mikroskopą (Olympus, Japonija). Bent 400 ląstelių iš 12 atsitiktinai pasirinktų laukų per patiekalas buvo skaičiuojami, ir kiekvienas gydymas buvo atliekamas tris kartus.

Statistika analizė

iš imunohistocheminiu rezultatas buvo analizuojami naudojant χ ^{2 testas. Visi rezultatai buvo pristatyti kaip reiškia ± Š.D. iš trigubuose bandymuose, atliekamas vienu metu, nebent nurodyta kitaip. Skirtumo tarp kontrolinių grupių bei nikotino gydymo grupių reikšmingumas buvo nustatomas pagal dviejų-tailed Stjudento t-testą. Skirtumai buvo laikomi reikšmingais, kai p < 0,05 arba P < 0,01.}

Rezultatai

α5-nAChR posakiai skrandžio vėžio audinių pavyzdžius ir ląstelių linijų

iš α5-nAChR išraiška buvo aptiktas ir lokalizuotas parafiną įdėta žmogaus skrandžio audinio sekcijos. α5-nAChR daugiausia buvo lokalizuotas dėl vėžinių ląstelių membranos, nors kai citoplazma dažymo pat buvo pastebėta (pav 1A). Išraiška α5-nAChR buvo didesnis skrandžio vėžio audiniuose (77,5%, 31/40), negu kad pusiau karcinoma audinių (20%, 2/10). Rezultatai parodė tendenciją, kad teigiamas norma α5-nAchR išraiška padidėjo pacientams, sergantiems nikotino įsiurbimo istorijos (87,5%, 7/8), palyginti su pacientais, be nikotino įsiurbimo istorijos (75,0%, 24/32).

α5-nAChR iRNR ir baltymų buvo aptikta iš skrandžio vėžio ląstelių linijų skydelyje. Ląstelių linijų išreiškė skirtingą α5-nAChR baltymų, kur ląstelių linijos su didesniu išraiška buvo BGC823, AGS ir SGC7901 normalizuojamas kad GAPDH (pav 1B). Iš α5-nAChR iRNR išraiškos aptiktų RT-PGR lygiai koreliuoja su baltymų raiškos (pav 1C) lygių. BGC823 išreiškia Didesnieji α5-nAChR lygį nei kitų ląstelių linijų. Dėl papildomos funkcinės eksperimentų, BGC823 ląstelių linija buvo pasirinktas dėl savo aukštojo išraiškos (tinka indukcijos nikotino ar nuslopinami pagal siRNA).

Nikotinas skatina skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją per α5-nAChR

Jei nustatyti, ar nikotinas gali reguliuoti skrandžio ląstelių proliferaciją, mes išnagrinėjo nikotino su įvairiomis koncentracijomis dėl ląstelių gyvybingumo BGC823 poveikį pagal CCK8 analizė (pav 2A). BGC823 buvo veikiami nikotino (0, 1, 10, 100, 500, 1000 mikronų) už 24, 48, ir 72 val, atitinkamai. Kaip parodyta Fig 2A, nikotino skatinamas ląstelių proliferaciją in priklausomai nuo laiko, ir priklausomai nuo koncentracijos atžvilgiu. Nikotino patikimai stimuliavo ląstelių proliferaciją ne mažesnės koncentracijos (1, 10, 100, 500 mikronų) ir laiko (24-72 h), bet pastebimas sumažėjimas ląstelių skaičius buvo stebimas nikotino gydytų kultūrų ne didesnės koncentracijos (1000 mikronų) ir laiko (72 h). Tyrimai parodė lygiai nikotino organizme labai skiriasi tarp individų net tada, kai rūkymas tą patį skaičių vienodų cigarečių [22-24] .Iš nikotino (100 mikromolių), naudojami šiame tyrime koncentracija imitavo kasdien suvartojamų cigarečių saikingai rūkalių [ ,,,0],25, 26]. Nikotino (100 mikromolių) koncentracija yra lygi koncentracijos seilėse ir rūkalius, kuris suvartojimas 25 cigarečių /dieną [27]. Dėl papildomos funkcinės eksperimentų, nikotino (100 mikromolių) koncentracija buvo pasirinkta gydyti skrandžio ląsteles 24h.

Norėdami nustatyti, ar nikotinas tarpininkaujant skatinimas ląstelių proliferaciją skrandžio ląstelių mediēta α5-nAChR signalizacijos, Tyrėme nikotino poveikį α5-nAChR baltymų raiškos BGC823 ląstelėse Vakarų dėmė. Kaip parodyta Fig 2B, gydymo nikotino prie nikotino (0, 1, 10, 100, 500, 1000 mikronų) už 24 valandas vaisto skatinamas α5-nAChR baltymo ekspresiją priklausomai nuo dozės priklausomu būdu. Siekiant dar labiau patvirtina α5-nAChR signalinio kelio dalyvavimą nikotino tarpininkaujant skatinimo skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją, mes užblokuotas α5-nAChR baltymų ekspresiją transfekuoja BC823 ląsteles su α5-nAChR specifinio siRNA (SI-α5-nAChR) ( pav 2C) ir įvertinti jo poveikį nikotino tarpininkaujant skatinimo ląstelių proliferaciją pagal CCK tyrime (pav 2D). Palyginti su plakta nespecifinio kontrolės siRNA (SI-NC), transfekciją su SI-α5-nAChR slopino ląstelių proliferaciją. Be to, SI-α5-nAChR transfekcija žymiai sumažino nikotino tarpininkaujant skatinti ląstelių proliferaciją ir BGC823 ląstelių (pav 2D).

Nikotinas slopinimas cisplatina sukeltos apoptozė

Norėdami papildomai apibūdinti apoptozę poveikis nikotino kartu su cisplatina dėl BGC823, cisplatina buvo naudojami siekiant didesnio apoptozę į BGC823 ląstelių. Ląstelės buvo gydomi 20 mM cisplatina [28]. Kaip parodyta Fig 3A, apoptozės ląstelės tapo suapvalintas formos ir jų branduoliai eksponuojama suskaidytą morfologiją, formavimo apoptozinių įstaigas. Priešingai, ląstelės bendrai gydomi nikotino ir cisplatina parodė šiek tiek branduolinės fragmentaciją ir keletą apoptozinių kūnus.

cisplatinos sukelta apoptozė buvo toliau tiriami AnnexinV /7-AAD dažymo. Tėkmės citometrijos sklypų parodė, kad iš visų apoptozinių ląstelių (AnnexinV + /7-AAD-) proporcijos sumažėjo from43.2 ± 2.32% to29.9 ± 1,26%, kai susiduria su cisplatina kartu su 100 mkm nikotino (pav 3b). Šie rezultatai rodo, kad nikotino gali slopinti apoptozę sukeltas cisplatina.

α5-nAChR /AKT signalizacijos kelias dalyvauja kovos apoptozinių poveikio nikotino cisplatina sukeltos apoptozės BGC823 ląstelės

Siekiant nustatyti vaidmuo AKT tarpininkavimo nikotino poveikį šių ląstelių, mes nustatyti, ar nikotinas sukelia aktyvavimo AKT į BGC823 ląsteles. Fig 4A, 20 mM cisplatina stipriai slopinama aktyvumą AKT (2 juosta), bet nikotinas padidėjo AKT išraišką (juostų 3) cisplatinos buvimą. Jis pasiūlė, kad AKT buvo aktyvuota po sąlyčio su 100 mikromolių nikotino BGC823 ląstelių, kaip nurodyta įvairiuose dokumentuose [29, 30]. Žemyn-reguliavimas α5-nAChR išraiška sumažėjo P-AKT išraišką (juostos 4). Gydymas 10 mm LY294002 A fosfatidil 3-kinazės (PI3K) /AKT kelyje inhibitorių, sumažėjo kovos su apoptozinių poveikį nikotino BGC823 ląstelių (juostų 5). Be to, gydymas LY294002 kartu su SI-CHRNA5 transfekciją žymiai represuoti nikotino sukeltas P-AKT baltymų kiekis (juostą 6). Šie duomenys rodo, kad α5-nAChR /AKT keliai vaidina svarbų vaidmenį tarpininkauti nikotino ir chemoterapijos poveikį skrandžio vėžio ląsteles.

Mes taip pat išnagrinėjo nikotino poveikį gydant cisplatinos sukelta kaspazės-3 aktyvacijos BGC823 ląstelės Vakarų blot tyrimu. Kaip parodyta Fig 4B, cisplatina pasižymėjo į kaspazė-3 aktyvavimo padidėjimą, kadangi nikotinas užblokuotas cisplatinos sukelta kaspazė-3 aktyvaciją BGC823 ląstelių. Be to, poveikis BGC823 ląstelių ir cisplatinos sukėlė apoptozės baltymų Bax padidėjo, o prosurvival baltymų Bcl-2 ir Survivin sumažėjo, kurie buvo slopinamas gydymo nikotino išraiška.

Tuo tarpu, kaip parodyta Fig 4C, anti-aprotoninis poveikis nikotino buvo akivaizdžiai užblokuotas sI-α5-nAChR į BGC823 ląsteles. Tėkmės citometrijos sklypų parodė, kad iš visų apoptozinių ląstelių dalis (AnnexinV + /7-AAD-) po SI-5 gydymo, palyginti su SI-NC grupės padidėjo nuo 18,5 ± 0,92% iki 34,9 ± 1,74%. Papildymas AKT inhibitorių LY294002 su SI-α5-nAChR gerokai paaukštintas apoptozės poveikį cisplatina nuo 31,5 ± 1,57% iki 61,2 ± 3,06%, palyginti su LY294002 grupei. Šie rezultatai rodo, kad nikotino vaidina svarbų vaidmenį gydant cisplatinos sukelta apoptozės prevencijos per α5-nAChR /AKT signalizacijos keliu.

Diskusijos

Šis tyrimas yra pirmasis įrodyti esminį vaidmenį α5-nAChR nikotino antiapoptozės cisplatinos žmogaus skrandžio vėžio ląsteles. Iš klinikinių mėginių analizė parodė, kad α5-nAChR išraiška paprastai yra didesnė vėžinių ląstelių, lyginant su pusiau karcinoma ląsteles. Rezultatai parodė tendenciją, kad teigiamas norma α5-nAchR išraiška buvo didesnis pacientams, kurių nikotino įsiurbimo istorijos, nei pacientams be nikotino įsiurbimo istorijoje. In vitro rezultatai rodo, kad nikotino iki-sureguliavo α5-nAChR baltymų ir inhibuoja cisplatina sukeltos apoptozės išraišką reguliuojant α5-nAChR /AKT signalizacijos kelią skrandžio vėžio ląsteles. Nikotino užkirstas kelias cisplatinos sukelta aktyvavimą kaspazės-3 ir Bax, ir iki reguliuojama kovos su apoptozinių baltymų ekspresiją, Bcl-2 ir Survivin. Be to, buvo nustatyta aktyvavimo AKT vaidinti vaidmenį tarpininkauti cisplatiną sukeltos apoptozės, taip pat kovos su apoptozinių poveikio nikotino BGC823 ląsteles. Tai gali būti įdomu atkreipti dėmesį į tarp cigarečių dūmų (antras rūkymo) ir skrandžio vėžio atvejų santykius.

Ankstesnės išvados išardyti tvirtą ryšį tarp cigarečių dūmų ir skrandžio vėžio [31, 32]. Nikotinas buvo įrodyta, kad padidinti platinimu ir migracijos skrandžio vėžio ląsteles, sukeldami cyclooxgenase-2 (COX-2), prostaglandino E2 VEGF, beta-adrenoreceptorių, baltymų kinazės C [26, 33, 34]. Šie reiškiniai atrodo, tarpininkaujant per homopentameric α7-nAChRs [35]. Tačiau naujausi tyrimai parodė netikėtą efektą iš heteropentameric α5-nAChRs apie nikotino vartojimas [36-38]. Mūsų ankstesni darbai pranešė, kad nikotinas /α5-nAChR būdas yra svarbus plaučių vėžio ląstelių gyvybingumą [21, 39]. Nepaisant to, jokia informacija buvo prieinama apie tai, ar nikotinas taip pat turi įtakos plitimą žmogaus skrandžio vėžio ląsteles per reguliavimo α5-nAChR. Čia mes studijavo α5-nAChR vaidmenį žmogaus skrandžio vėžio. Mūsų rezultatai parodė, kad išraiška α5-nAChR buvo didesnis skrandžio vėžio audiniuose, palyginti su pusiau karcinoma audinių, kurie leidžia manyti, kad α5-nAChR gali vaidinti svarbų vaidmenį skrandžio kancerogenezėje. Be to, nikotinas skatina α5-nAChR baltymo ekspresija ir blokuoja α5-nAChR aktyvacija siRNA susilpnintas nikotino sukeltas skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją. Jis pasiūlė, kad α5-nAChR yra vienas iš pagrindinių molekulių tarpininkauti ląstelių proliferaciją stimuliuojami nikotino skrandžio vėžio ląsteles.

dabartinis standartas chemoterapija skrandžio vėžys yra cisplatina, tačiau sėkmės rodiklis šio gydymo yra prasta. Cisplatinos veiksmingumas priklauso nuo gebėjimas sukelti DNR žalą [40, 41]. Taigi, tai, kaip vėžinės ląstelės reaguoja į cisplatinos sukelto apoptozę vaidina lemiamą vaidmenį cisplatina jautrumo. Naujausi pranešimai rodo, kad nikotino slopina cisplatiną sukeltos apoptozės plaučių vėžio ląsteles, burnos vėžį, Raw264.7 ir EL4 saugos standartus [13, 16, 18], kuris gali reikšti, kad nikotinas turi galimybę ne tik skatinti vėžio vystymąsi aktyvuojant ląstelių augimo kelius , bet taip pat siekiant sumažinti chemoterapiniais preparatais veiksmingumą skatinant išgyvenimo kelius. Sutinka su ankstesnių tyrimų išvadas, rezultatai iš šiame tyrime parodė, kad buvo pastebėtas bendro gydymas iš ląstelių, turinčių cisplatina ir nikotino, labai aktyvavimo kaspazės-3, tai rodo, kad nikotino gali nustatyti kad, apoptozės potencialo inhibavimo cisplatina skrandžio vėžio.

signalizacijos keliai, kurie reguliuoja ląstelių procesus, įskaitant ląstelių proliferaciją, ląstelės ciklo progresavimo ir ląstelių apoptozę, turi didelę įtaką sprendžiant ląstelių atsaką į cisplatina. Ankstesni tyrimai parodė, kad aktyvacija AKT kelyje gali sukelti atsparumo cisplatina [42, 43]. Pernelyg išraiška serino fosforilinamos AKT buvo aptikta įvairių žmogaus vėžio, įskaitant skrandžio vėžio [44, 45]. Kaip pranešė įvairiuose dokumentuose, nikotinas, prisijungdamas prie nAChR veda į vartotojų aktyvavimo naviko skatinti baltymų, įskaitant aktyvavimo akt takais [46-48]. Ekspozicijos nuo nikotino, gali neigiamai paveikti apoptozės potencialo cisplatina žmogaus burnos vėžio ląsteles ir AKT kelyje buvo reikalingas nikotino funkciją [16]. Tačiau AKT kelyje nuo nikotino vartotojų signalizacijos ir anti-apoptozinių poveikio nikotino skrandžio vėžio ląstelės buvo nežinoma. Todėl, mes ištirti, ar P-AKT gali atsižvelgti į antagonizuojantis poveikis nikotino dėl cisplatina citotoksiškumo. Mes nustatėme, kad kartu gydomi siRNA-α5-nAChR ir LY294002 A PI3K /AKT kelyje inhibitorius, didina cisplatiną sukeltos apoptozės ir silpnos nikotino poveikį BGC823 ląsteles. Keli tyrimai išryškino nikotino aktyvuota akt signalo perdavimo kelių yra tolygiam ląstelių proliferaciją ir išlikimą per aktyvavimo prosurvival baltymų BCL-2 ir Survivin [15, 49, 50]. Mūsų tyrimas taip pat parodė, kad nikotinas vaidmenį ląstelių apoptozės sukeltos cisplatinos per α5-nAChR /AKT patvirtina indukcijos Survivin ir BCL-2, kaip galutiniai vykdomuosius virš kelių.

Apibendrinant, mes parodė kad nikotinas aktyvuota α5-nAChR /AKT signalizacijos ir dalyvauja cisplatinos atsparumo skrandžio vėžio. Šie duomenys pateikti naujų įžvalgų į galimus molekulinius mechanizmus nikotino slopinimo cisplatinos sukelta apoptozę žmogaus skrandžio vėžio ląsteles (5 pav). Nikotinas dalyvauja cigarečių dūmai gali trukdyti skrandžio vėžio farmakologinio gydymo slopindamas chemoterapinių vaistų sukeltas apoptozę. Strategijos, skirtos suprasti nikotino tarpininkaujant signalizacijos gali palengvinti geresnių gydymo plėtrą skrandžio vėžio.

Pagalbinė informacija
S1 pav. Išraiška α5-nAChR ir α7-nAChR su ar be α5-siRNR gydymo
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s001
(TIF)
S2 pav. 10,1371 /journal.pone.0149120.s002
(TIF)
S3 pav: žemyn reguliavimo α5-nAChR išraiškos
Doi sumažėjo P-AKT lygį.. Išraiška α5-nAChR į BGC823 ląstelių su ar be SI-α5-nAChR gydymo
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s003
(TIF)
S4 pav. Nikotinas skatina BGC823 ląstelių proliferaciją per α5-nAChR ir α7-nAChR
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s004
(TIF)
S5 pav. Nikotinas skatina SGC7901 ląstelių proliferaciją per α5-nAChR
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s005
(TIF)
S6 pav. Nikotinas slopinimas cisplatina sukeltos apoptozės SCG7901
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s006
(TIF)

• PLoS ONE: a limfmazgio Skirstymas sistema skrandžio vėžys: Hibridiniai tipas Remiantis topografinius ir skaitinį Systems
• PLoS ONE: N-terminalas polipeptidas aneksino A2 Sumažina Infekcija Mycoplasma hyorhinis skrandžio vėžio Cells