PLOS ONE: Nicotine Inhibe Cisplatin-apoptose induite par l'intermédiaire de régulation α5-nAChR /AKT Signalisation dans Human Cancer gastrique Cells

Résumé

L'incidence du cancer gastrique démontre une association étiologique forte avec le tabagisme. La nicotine, le composant majeur dans le tabac, est un agoniste de survie qui inhibe l'apoptose induite par certains agents chimiothérapeutiques, mais les mécanismes impliqués restent largement inconnus. Récemment études ont montré que le récepteur de l'acétylcholine α5-nicotinique (α5-nAChR) est fortement associée au risque de cancer du poumon et de la dépendance à la nicotine. Néanmoins, aucune information n'a été disponible pour savoir si la nicotine affecte également la prolifération des cellules cancéreuses gastriques humaines par la réglementation de α5-nAChR. Pour évaluer l'hypothèse selon laquelle α5-nAChR peut jouer un rôle dans le cancer gastrique, nous avons étudié son expression dans les tissus du cancer de l'estomac et des lignées cellulaires. L'expression de la α5-nAChR a augmenté dans le tissu du cancer de l'estomac par rapport à des tissus para-carcinome. Compte tenu des résultats, nous avons procédé à déterminer si la nicotine inhibe l'apoptose induite par le cisplatine via la régulation α5-nAChR dans la cellule de cancer gastrique. Les résultats ont montré que la nicotine significativement favorisé la prolifération cellulaire dans une dose et d'une manière dépendante du temps grâce à l'activation du nAChR-α5 dans les cellules gastriques humaines. En outre, la nicotine inhibe l'apoptose induite par le cisplatine. Silence de α5-nAChR ablatée les effets protecteurs de la nicotine. Cependant, lorsque la co-administration LY294002, un inhibiteur de PI3K voie /AKT, une augmentation de l'apoptose a été observée. Cet effet en corrélation avec l'induction de la protéine Bcl-2, Bax, la survivine et la caspase-3 par la nicotine dans des lignées de cellules gastriques. Ces résultats suggèrent que l'exposition à la nicotine pourrait avoir un impact négatif sur le potentiel apoptotique des médicaments chimiothérapeutiques et que la signalisation α5-nAChR /AKT joue un rôle clé dans l'activité anti-apoptotique de la nicotine induit par le cisplatine

Citation:. Jia Y , Sun H, Wu H, Zhang H, Zhang X, Xiao D, et al. (2016) Nicotine Inhibe Cisplatin-apoptose induite par l'intermédiaire de régulation α5-nAChR /AKT signalisation dans les cellules de cancer gastrique humain. PLoS ONE 11 (2): e0149120. doi: 10.1371 /journal.pone.0149120

Editeur: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, ETATS-UNIS

reçues: 1 Juin 2015; Accepté 15 Janvier 2016; Publié: 24 Février 2016

Droit d'auteur: © 2016 Jia et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données:. En raison de les restrictions imposées par l'Hôpital central de Jinan, les données sont disponibles sur demande. Les chercheurs intéressés peuvent communiquer avec le Dr Xiaoli Ma ([email protected]) pour demander l'accès aux données

Financement:. Ce travail est soutenu par la National Science Foundation naturel de la Chine (n ° 81272588) et Shandong Provincial Natural Science Fondation de la Chine (n ° ZR2012HM061and ZR2013CM010)

intérêts concurrents:. les auteurs ont déclaré qu'il n'y a pas des intérêts divergents existent

le cancer gastrique introduction est l'une des principales causes. des décès par cancer dans le monde. Apparemment, les facteurs génétiques et environnementaux sont impliqués dans la carcinogenèse gastrique. Des résultats antérieurs ont démêlé la forte association entre la fumée de cigarette et l'incidence du cancer gastrique [1-3], cependant, le mécanisme détaillé n'a pas été entièrement étudiées.

La nicotine, une composante majeure de la fumée de cigarette, a été montré pour être impliqués dans l'initiation, la promotion, et même la progression de plusieurs tumeurs, y compris le cancer gastrique. Plusieurs preuves suggèrent que la nicotine exerce ses fonctions cellulaires grâce à des récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine (nAChR). cellules épithéliales différentes, non seulement les cellules neuronales, nAChR express et la structure du nAChR est un homo- (α7or α9) ou hétéropentamère (α2-α10; b2-b4). Des études ont démontré que la nicotine stimule la prolifération des cellules cancéreuses gastriques humaines par son interaction avec α7-nAChR [4, 5]. Bien que les différents membres de la famille nAChR peuvent réglementer la convergence des voies de signalisation, ils ont souvent des actions diverses et même opposées. Récemment, des études d'association génomique larges ont indiqué que α5-nAChR est fortement associée au risque de cancer du poumon et de la dépendance à la nicotine [6, 7]. Néanmoins, aucune information n'a été disponible pour savoir si la nicotine affecte également la prolifération des cellules cancéreuses gastriques humaines par la réglementation de α5-nAChR.

La livraison de chimiothérapeutique cisplatine agent après résection chirurgicale définit actuellement le traitement standard pour le cancer gastrique [8 -dix]. Malheureusement, la résistance acquise au cisplatine est commune et à l'évasion de l'apoptose des cellules est reconnue comme l'un des principaux mécanismes responsables de la résistance au cisplatine [11, 12]. En particulier, la nicotine peut inhiber l'apoptose induite par le cisplatine dans des cellules de cancer du poumon [13-15] et les cancers oraux [16]. L'effet inhibiteur de la nicotine sur l'apoptose a été attribuée à sa capacité à activer les protéines anti-apoptotiques comme Bcl-2 et de la survivine, ainsi que l'inactivation des protéines pro-apoptotiques tels que Bax et de la caspase-3, grâce à l'activation à la fois PI3K /AKT et de la PKC /ERK voies de signalisation dans les cellules cancéreuses [13-15]. Cet effet de la nicotine sur l'apoptose des cellules est également médiée par nAChR, mais en plus de α5-nAChR, d'autres sous-unités semblent être impliqués [17, 18].

Bien que bon nombre de ces mécanismes ont été observées dans le cancer du poumon [19-21], il n'y a aucune preuve de l'effet anti-apoptotique et le mécanisme exercé par la nicotine sur les cellules cancéreuses gastriques. Le but de la présente étude était d'étudier la nicotine inhibe l'apoptose induite par le cisplatine via la régulation α5-nAChR dans la cellule de cancer gastrique. De plus, nous proposons l'implication de facteurs pro-survie, tels que Bcl-2 et survivine, activés par des voies de AKT, respectivement.

Ethique Déclaration
Matériels et méthodes

le protocole d'étude a été approuvé par le Comité d'éthique médicale et essai clinique humain de l'Hôpital Central de Jinan. Le consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les patients.

Les spécimens de tissus, de la culture cellulaire et le traitement médicamenteux

Cinquante échantillons de paraffine fixés au formol contenant 40 spécimens de cancer gastrique et 10 tissus para-carcinome ont été rétrospectivement et choisis au hasard à partir des fichiers de l'hôpital central de Jinan après le protocole a été approuvé par le comité d'éthique de la recherche locale. Selon le dossier du tabagisme (ou non) dans l'histoire des patients de cas, 32 cas avait pas d'antécédents de consommation de tabac, 8 avaient l'histoire de la consommation de tabac. Tous les échantillons ont été évalués pour le diagnostic par deux pathologistes expérimentés pour le diagnostic.

Les lignées cellulaires de cancer gastriques humaines MKN28, SGC7901, BGC823, MGC803, AGS, HGC27 et MKN45 ont été obtenus à partir de la Banque de cellules de Shanghai, Institut de biochimie et de biologie cellulaire, Académie chinoise des sciences. Les cellules ont été cultivées dans du DMEM (Invitrogen) supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS; Invitrogen), 1% d'antibiotiques à 37 ° C dans du CO2 de l'air humidifié à 5%. Dans toutes les expériences, de 60 à 70% des cellules confluentes ont été lavées et incubées dans un milieu sans sérum pendant 24 heures avant le traitement avec de la nicotine, le cisplatine et le LY294002 (Sigma, St. Louis, MO) pendant le temps indiqué.

immunohistochimie

coloration immunohistochimique en utilisant le procédé streptavidine-peroxydase (méthode SP) a été réalisée sur 4 um sections d'échantillons de paraffine pour détecter l'expression de α5-nAChR dans les tissus cancéreux et le para-carcinome gastrique. En bref, après déparaffinage et de l'hydratation, les lames ont été traitées avec de la peroxydase endogène dans 0,3% de H _{2 O 2 pendant 30 minutes et bloquées pendant 2 h à température ambiante avec 1,5% de sérum de blocage dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS ). Les sections ont ensuite été incubées avec un anticorps anti-α5-nAChR anticorps (Abcam, Inc. Cambridge, MA) (dilution 1: 100) à 4 ° C pendant une nuit, lavées avec du PBS et incubées avec un anticorps biotinylé anti-souris secondaire (KIT-5010 , Max Vision, Maixin.Bio, Chine) (1: 2000) dans du PBS pendant 30 min à 37 ° C. La liaison d'anticorps a été détecté en utilisant le complexe streptavidine-biotine-peroxydase /HRP (Code K0377; Dako) avec 3, 3- diaminobenzidine pendant 3 min en tant que substrat chromogène. Les lames ont ensuite été légèrement contre-colorées avec de l'hématoxyline. Comme témoin négatif, les sections ont été colorées en double sans exposition aux anticorps primaires. Les résultats ont été observés sous un microscope.}

quantitative en temps réel RT-PCR

ARN total a été isolé en utilisant le réactif Trizol (Invitrogen) selon les instructions du fabricant. Vingt-cinq nanogramme d'ARN total par échantillon a été transcrit de manière inverse en utilisant le kit de transcription inverse de la réaction (Code Takara: DRR061S) selon les instructions du fabricant. PCR quantitative en temps réel a été réalisée analysée sur 7300 PCR System Applied Biosystems en temps réel pour déterminer les quantités relatives de α5-nAChR et β-actine (contrôle interne) ARNm exprimé. Le SYBR Green Supermix a été utilisée pour toutes les réactions de PCR en temps réel. Les amorces de PCR utilisées dans cette étude sont les suivants: α5-nAChR Forward: GAAACTGAGAGTGGTAGTGGACCAA, Reverse: GGGCTATGAATTTCC AATCTTCAAC; glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) vers l'avant, 5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 'et inverse, 5'-AGTCCTTCCACG ATACCAAAGT-3'. Les paramètres de la PCR en temps réel quantitative était de 95 ° C pendant 10 secondes, comme une étape de pré-dénaturation suivie par 40 cycles de PCR de 95 ° C pendant 5 s, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 10 min. Tous les échantillons ont été réalisés en triple exemplaire dans chaque expérience. La quantité relative d'ARNm a été calculé selon la méthode de CT comparative après la normalisation des niveaux d'ARNm-actine ß.

analyse Western blot

Les culots cellulaires ont été homogénéisés dans un tampon d'extraction (50 mmol /L de Tris-HCl pH 6,8, 0,1% de SDS, 150 pmol /L de NaCl, 100 mg /L de fluorure de phénylméthylsulfonyle, 1 mg /L d'aprotinine, 1% de NP-40 et 0,5%, orthovanadate de sodium), on fait incuber à 4 ° C pendant 30 minutes, et centrifugés pendant 20 min à 12 000 g /min. La protéine totale dans le lysat cellulaire a été mesurée avec l'utilisation du kit colorimétrique Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Pour une analyse western blot, la protéine totale a été séparé sur 10% de SDS-PAGE et transférés sur des membranes de nitrocellulose (0,45 pm, Millipore, Billerica, MA, USA), qui ont été incubées pendant 24 h à 4 ° C avec les anticorps pour α5-nAChR (1: 500, ab41173 ou ab166718), AKT (1: 500, Epitomics Cat no: 1085-1), P-AKT (1: 500, Epitomics Cat no: 2118-1), Caspase-3 (1: 500, Epitomics Cat no: 1087-1), Bcl-2 (1: 500, Epitomics Cat no: 1017-1), survivine (1: 500, Epitomics Cat no: 2463-1) et GAPDH (1: 1000; ab37168), puis conjugué à la peroxydase de raifort anti-souris /lapin d'anticorps IgG (Santa Cruz Biotechnology) après un lavage final. Les signaux ont été détectés avec l'utilisation d'un kit de chimioluminescence amplifiée (Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK). niveau de GAPDH était un étalon interne

ARN interférence

Un double brin siRNA ciblant oligonucléotide CHRNA5, qui code pour α5-nAChR, (sens:. 5'-CCCGCAAACUACAAAAGUUTT-3 ', antisens: 5' -AACUUUUCUAGUUUGCCGGTG-3 ') a été synthétisé par Shanghai Genepharma Co., Ltd (Chine). Une paire de négatif siRNA contrôle a également été conçu avec des séquences différentes de l'ARNsi-CHRNA5 et non homologues à toutes les séquences trouvées dans la banque de gènes (sens: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ', antisens: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGA-3'). Les cellules ont été étalées dans des plaques à six puits. Lorsque les cellules atteignent 30-50% de confluence, les ARNsi ont été ajoutés à une concentration finale de 50 nM avec de la lipofectamine 2000 (Invitrogen) selon les instructions du fabricant.

Essai de viabilité cellulaire

La viabilité des cellules était déterminé par le dosage de la CCK8 (Dojindo, Tokyo, Japon). En bref, des cellules étalées dans des plaques à 96 puits (1500 cellules /puits) ont été traités avec de la nicotine aux doses indiquées. Le dosage de la prolifération cellulaire a été réalisée par l'addition d'une solution CCK8 10 ul dans chaque puits, suivie d'une incubation à 37 ° C pendant 2 h. L'absorbance a été mesurée à une longueur d'onde de 450 nm en utilisant un lecteur de microplaques (Synergy 2 Multi-Lecteur de microplaques; BioTek, Winooski, VT, USA).

Annexin V /7-AAD coloration

BGC823 cellules ont été cultivées à confluence dans des plaques à 6 puits de culture tissulaire (Falcon, Becton Dickinson Labware) dans un milieu complet. Ensuite, le milieu a été remplacé par un milieu complet frais ou par un milieu exempt de sérum; les cellules ont été ensuite stimulées avec 100 uM de nicotine seul ou en combinaison avec le cisplatine 20 mM pendant 24 heures sur la base de nos données précédentes, trypsinisées et lavées deux fois avec du PBS. Les cellules ont été colorées avec du PE marqué annexine V /7-AAD (7-aminoactinomycine-D) selon les instructions du fabricant (annexine V /7-AAD kit; Becton, Dickinson and Company). En bref, un culot cellulaire lavé a été remis en suspension dans 500 pi de tampon de liaison. Ensuite, 5 pi Annexin-V-PE et 5uL 7-AAD ont été ajoutés. l'analyse par cytométrie de flux a été réalisée immédiatement après coloration supravital. l'acquisition et l'analyse des données ont été réalisées dans un flux Becton Dickinson FACSCalibur cytomètre en utilisant le logiciel CellQuest. Les cellules à des stades précoces de l'apoptose étaient AnnexinV positive et 7-AAD négative, alors que les cellules dans les derniers stades de l'apoptose étaient tous les deux AnnexinV et 7-AAD positive.

Hoechst 33342 coloration

Cellules ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits de culture tissulaire et traité avec les concentrations de nicotine et de cisplatine indiquées. A la fin de chaque incubation, les cellules ont été fixées avec 4% de paraformaldehyde pendant 20 minutes, lavées avec du PBS, puis incubées avec Hoechst 33342 (1 pg /ml) pendant 10 min. Après un lavage avec du PBS, les cellules ont été observées en utilisant un microscope à fluorescence (Olympus, Japon). Au moins 400 cellules provenant de 12 champs choisis au hasard par boîte ont été comptées, et chaque traitement a été réalisé en trois exemplaires.

Analyse statistique

Le résultat de l'immuno-histochimie a été analysée à l'aide du χ ^{2 tester. Tous les résultats ont été présentés en tant que moyen ± E.T. à partir d'expériences réalisées en triple exemplaire d'une manière parallèle, sauf indication contraire. La signification des différences entre les groupes témoins et les groupes de traitement à la nicotine a été déterminée par le test t de Student à deux queues. Les différences ont été considérées comme significatives à P < 0,05 ou P < 0,01.}

Résultats

expressions a5-nAChR dans des échantillons de tissus de cancer gastrique et des lignées cellulaires

L'expression de α5-nAChR ont été détectés et localisés dans le tissu gastrique humaine paraffine sections. α5-nAChR est principalement localisé sur la membrane des cellules tumorales, même si une certaine coloration cytoplasmique a également été observée (figure 1A). L'expression de α5-nAChR est plus élevée dans les tissus du cancer gastrique (77,5%, 31/40) que celle dans les tissus para-carcinome (20%, 2/10). Les résultats ont montré une tendance à ce que le taux positif de l'expression α5-nAChR accrue chez les patients ayant des antécédents de consommation de nicotine (87,5%, 7/8) par rapport aux patients sans antécédents de consommation de nicotine (75,0%, 24/32).

α5-nAChR ARNm et la protéine ont été détectables dans un panel de lignées cellulaires de cancer gastrique. Les lignées cellulaires expriment différents niveaux de la protéine α5-nAChR, où les lignées cellulaires avec une expression plus élevée étaient BGC823, AGS et SGC7901 normalisées par rapport à celui de la GAPDH (figure 1B). Les niveaux d'expression de l'ARNm α5-nAChR détectés par RT-PCR en corrélation avec les niveaux d'expression de la protéine (figure 1C). BGC823 exprime des taux plus élevés d'α5-nAChR que celle d'autres lignées cellulaires. Pour d'autres expériences fonctionnelles, la lignée cellulaire BGC823 a été choisie en raison de sa plus haute expression (adaptée à l'induction par la nicotine ou le silençage par siRNA).

Nicotine promu gastrique prolifération des cellules cancéreuses par α5-nAChR

Pour déterminer si la nicotine peut réguler la prolifération des cellules gastriques, nous avons examiné l'effet de la nicotine avec différentes concentrations sur la viabilité des cellules dans BGC823 par une analyse de la CCK8 (figure 2A). BGC823 ont été exposés à la nicotine (0, 1, 10, 100, 500, 1000 uM) pendant 24, 48 et 72 heures, respectivement. Comme on le voit sur la figure 2A, la nicotine favorisé la prolifération cellulaire dans une relation dépendant du temps et dépendant de la concentration. La nicotine a stimulé de manière significative la prolifération cellulaire à faible concentration (1, 10, 100, 500 pm) et du temps (24-72 h), mais une diminution sensible du nombre de cellules a été observée dans des cultures de nicotine traitées à une concentration plus élevée (1000 uM) et du temps (72 h). Des études ont montré des niveaux de nicotine dans le corps varient considérablement entre les individus, même en fumant le même nombre de cigarettes identiques [22-24] .La concentration de nicotine (100 uM) utilisé dans la présente étude imité la consommation quotidienne de cigarettes chez les fumeurs modérés [ ,,,0],25, 26]. La concentration de nicotine (100 uM) est équivalente à une concentration dans la salive fumeur qui admission 25 cigarettes /jour [27]. Pour les autres expériences fonctionnelles, la concentration de nicotine (100 pM) a été choisie pour traiter les cellules gastriques pendant 24 h.

Afin de déterminer si la promotion de la nicotine à médiation de la prolifération cellulaire dans les cellules gastriques est médié par la signalisation α5-nAChR, nous avons analysé l'effet de la nicotine sur l'expression de la protéine α5-nAChR dans BGC823 cellules par Western blot. Comme on le voit sur la figure 2B, le traitement de la nicotine, à la dose de nicotine (0, 1, 10, 100, 500, 1000 uM) pendant 24 heures favorisé l'expression de la protéine α5-nAChR d'une manière dépendante de la dose. Pour confirmer davantage la participation des α5-nAChR voie de signalisation dans la promotion de la nicotine à médiation gastrique prolifération des cellules cancéreuses, nous avons bloqué α5-nAChR expression de la protéine par transfection BC823 cellules avec un siRNA α5-nAChR spécifique (si-α5-nAChR) ( la figure 2C) et évalué les effets sur la promotion de la nicotine à médiation de la prolifération cellulaire par dosage CCK (figure 2D). Par comparaison avec le contrôle non spécifique brouillées siRNA (si-NC), la transfection avec-nAChR si-α5 la prolifération cellulaire inhibée. En outre, si-α5 nAChR-transfection a réduit significativement la promotion de la nicotine à médiation de la prolifération cellulaire dans les cellules BGC823 (figure 2D).

nicotine inhibition de l'apoptose induite par le cisplatine

Pour caractériser davantage l'apoptose effets de la nicotine combinée avec la cisplatine sur BGC823, le cisplatine a été utilisé pour induire l'apoptose dans les cellules BGC823. Les cellules ont été traitées avec du cisplatine 20 mM [28]. Comme on le voit sur la figure 3A, les cellules apoptotiques sont devenues arrondies en forme et leurs noyaux présentent une morphologie fragmentée, la formation de corps apoptotiques. En revanche, les cellules de co-traitées avec de la nicotine et du cisplatine ont montré peu de fragmentation nucléaire et peu de corps apoptotiques.

apoptose induite par le cisplatine a en outre été analysée par AnnexinV /7-AAD coloration. La cytométrie en flux a révélé que les parcelles les proportions de cellules apoptotiques total (AnnexinV + /7-AAD-) a diminué from43.2 ± 2,32% ± 1,26% to29.9, lorsqu'ils sont exposés au cisplatine combiné avec 100 pM de nicotine (figure 3B). Ces résultats suggèrent que la nicotine peut supprimer l'apoptose induite par le cisplatine.

α5-nAChR /AKT voie de signalisation impliquée dans des effets anti-apoptotiques de la nicotine dans l'apoptose induite par le cisplatine de BGC823 cellules

Pour déterminer la le rôle de l'AKT dans la médiation des effets de la nicotine dans ces cellules, nous avons déterminé que la nicotine induit une activation de l'AKT dans BGC823 cellules. Sur la figure 4A, 20 mM cisplatine fortement réprimé l'activité de l'AKT (voie 2), mais la nicotine augmentation de l'expression de l'AKT (piste 3), en présence de cisplatine. Il a suggéré que AKT a été activée après une exposition à 100 pM de nicotine dans BGC823 cellules comme indiqué dans divers documents [29, 30]. La régulation négative de l'expression de α5-nAChR diminution de l'expression de P-AKT (piste 4). Le traitement avec 10 mM LY294002, un phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) de la voie /AKT, une diminution des effets anti-apoptotiques de la nicotine dans les cellules BGC823 (piste 5). En outre, le traitement avec LY294002 combiné avec si-CHRNA5 transfection réprimée de manière significative les niveaux induits par la nicotine P-AKT protéines (ligne 6). Ces données suggèrent que α5-nAChR /voies de AKT jouent un rôle essentiel dans la médiation des effets de la nicotine et de la chimiothérapie dans les cellules de cancer gastrique.

Nous avons également examiné les effets de la nicotine sur induite par le cisplatine-caspase-3 activation dans BGC823 cellules par test Western blot. Comme cela est représenté sur la figure 4B, le cisplatine induit une augmentation de l'activation de la caspase-3, alors que la nicotine ont bloqué l'activation de la caspase-3 induite par le cisplatine dans BGC823 cellules. De plus, l'exposition des cellules à BGC823 cisplatine a provoqué l'expression de la protéine Bax d'apoptose a augmenté tandis que la protéine prosurvival Bcl-2 et une diminution de la survivine, qui ont été inhibée par le traitement avec de la nicotine.

Cependant, comme représenté sur la figure 4C, la effet anti-apoptotique de la nicotine était évidemment bloquée par si-α5-nAChR dans BGC823 cellules. La cytométrie en flux tracés ont montré que la proportion de cellules apoptotiques total (AnnexinV + /7-AAD-) est passée de 18,5 ± 0,92% à 34,9 ± 1,74% après 5 si-traitement par rapport au groupe Si-CN. L'addition d'un inhibiteur de l'AKT LY294002 avec si-α5-nAChR promu de manière significative l'effet apoptotique de cisplatine de 31,5 ± 1,57% à 61,2 ± 3,06% par rapport au groupe LY294002. Ces résultats indiquent que la nicotine joue un rôle important dans la prévention de l'apoptose induite par le cisplatine par voie α5-nAChR /signalisation AKT.

Discussion

Cette étude est la première à démontrer un rôle essentiel de α5-nAChR dans la nicotine anti-apoptose de cisplatine dans des cellules de cancer gastrique humain. L'analyse des échantillons cliniques ont indiqué que l'expression de α5-nAChR est généralement plus élevée dans les cellules tumorales par rapport aux cellules para-carcinome. Les résultats ont montré une tendance à ce que le taux positif de l'expression α5-nAChR était plus élevé chez les patients ayant des antécédents d'admission de nicotine que les patients sans antécédents de consommation de nicotine. Les résultats in vitro ont montré que la nicotine régulée à la hausse l'expression de la protéine α5-nAChR et inhibé l'apoptose induite par le cisplatine par le contrôle de la voie de signalisation α5-nAChR /AKT dans les cellules cancéreuses gastriques. La nicotine a empêché l'activation induite par le cisplatine de la caspase-3 et de Bax, et une régulation positive de l'expression des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et la survivine. De plus, l'activation de l'AKT a été trouvé à jouer un rôle dans la médiation de l'apoptose induite par le cisplatine, ainsi que des effets anti-apoptotiques de la nicotine dans BGC823 cellules. Il peut être intéressant de prêter attention à la relation entre la fumée de cigarette (deuxième tabagisme) et l'incidence du cancer de l'estomac.

Des résultats antérieurs ont démêlé la forte association entre la fumée de cigarette et le cancer gastrique [31, 32]. La nicotine a été montré pour augmenter la prolifération et la migration des cellules cancéreuses gastriques en induisant cyclooxgenase-2 (COX-2), la prostaglandine E2, le VEGF, la ß-adrénergiques, protéine kinase C [26, 33, 34]. Ces effets semblent être induits par les a7-nAChR homopentameric [35]. Cependant, des études récentes ont démontré un effet inattendu des a5-nAChR heteropentameric sur la consommation de nicotine [36-38]. Nos travaux antérieurs ont indiqué que la voie de nicotine /α5-nAChR est essentielle pour la cellule du cancer du poumon viabilité [21, 39]. Néanmoins, aucune information n'a été disponible pour savoir si la nicotine affecte également la prolifération des cellules cancéreuses gastriques humaines par la réglementation de α5-nAChR. Ici, nous avons étudié le rôle de α5-nAChR dans le cancer gastrique humain. Nos résultats ont montré que l'expression de α5-nAChR est plus élevée dans les tissus du cancer de l'estomac par rapport au tissu para-carcinome, ce qui suggère que α5-nAChR peut jouer un rôle dans la carcinogenèse gastrique. Par ailleurs, la nicotine favorisé l'expression des protéines de α5-nAChR et le blocage de l'activation du nAChR-α5 par ARNsi atténué gastrique prolifération des cellules cancéreuses induites par la nicotine. Il a suggéré que α5-nAChR est l'une des principales molécules de médiation prolifération cellulaire stimulée par la nicotine dans les cellules de cancer gastrique.

La chimiothérapie standard actuelle pour le cancer gastrique est le cisplatine, mais le taux de ce traitement de réussite est faible. L'efficacité du cisplatine dépend de la capacité à induire des lésions de l'ADN [40, 41]. Par conséquent, la façon dont les cellules cancéreuses réagissent à l'apoptose induite par cisplatine joue un rôle critique dans la sensibilité au cisplatine. Des rapports récents montrent que la nicotine inhibe le cisplatine induit l'apoptose dans les cellules cancéreuses du poumon, cancer de la bouche, RAW264.7 et El4 cellules [13, 16, 18], ce qui peut suggérer que la nicotine a la capacité non seulement de promouvoir le développement du cancer en activant les voies de croissance cellulaire mais aussi de réduire l'efficacité des agents chimiothérapeutiques, en stimulant les voies de survie. En accord avec les résultats précédents, les résultats de la présente étude ont montré que la co-traitement des cellules avec du cisplatine et de la nicotine, une activation significative de la caspase-3 a été observée, ce qui indique que la nicotine est capable de déterminer l'inhibition du potentiel apoptotique de la cisplatine dans le cancer gastrique.

Les voies de signalisation qui régulent les processus cellulaires, y compris la prolifération cellulaire, de la progression du cycle cellulaire et l'apoptose cellulaire, d'avoir un impact significatif sur la réponse cellulaire à décider cisplatine. Des études antérieures ont montré que l'activation de la voie AKT peut conduire à une résistance au cisplatine [42, 43]. Une surexpression de la serine phosphorylée AKT a été détecté dans une large gamme de cancers humains, y compris le cancer gastrique [44, 45]. Comme il est indiqué dans les différents papiers, en se liant à la nicotine nAChR conduit à l'activation en aval des protéines tumorales y compris la promotion de l'activation des voies AKT [46-48]. L'exposition à la nicotine pourrait avoir un impact négatif sur le potentiel apoptotique du cisplatine dans des cellules humaines de cancer de la bouche, et la voie AKT a été nécessaire pour la fonction de la nicotine [16]. Cependant, Akt de la signalisation en aval nicotinique et les effets anti-apoptotiques de la nicotine dans les cellules cancéreuses gastriques étaient inconnus. Par conséquent, nous avons étudié si P-AKT peut expliquer l'effet antagoniste de la nicotine sur la cytotoxicité du cisplatine. Nous avons constaté que l'augmentation de l'apoptose induite par le cisplatine co-traitées avec l'ARNsi-α5-nAChR et le LY294002, un inhibiteur de la voie PI3K /AKT et a atténué les effets de la nicotine dans BGC823 cellules. Plusieurs études ont mis en évidence la nicotine active les voies de signalisation Akt est dans la modulation de la prolifération cellulaire et la survie par activation de la protéine Bcl-2 prosurvival et la survivine [15, 49, 50]. Notre recherche a également démontré que le rôle de la nicotine sur l'apoptose cellulaire induite par le cisplatine par α5-nAChR /AKT est confirmée par l'induction de la survivine et Bcl-2, comme effecteurs finaux des voies ci-dessus.

En résumé, nous avons démontré que la nicotine active α5-nAChR /Akt et est impliqué dans la résistance du cisplatine dans le cancer gastrique. Ces résultats fournissent de nouveaux aperçus sur les mécanismes moléculaires possibles de l'inhibition de la nicotine de l'apoptose induite par le cisplatine dans des cellules de cancer gastrique humain (figure 5). La nicotine présente dans la fumée de cigarette peut interférer avec le cancer gastrique traitement pharmacologique en inhibant chimiothérapeutique apoptose induite par la drogue. Les stratégies visant à la compréhension de la signalisation de la nicotine à médiation peut faciliter le développement de thérapies améliorées dans le cancer gastrique.

Informations complémentaires
S1 Fig. Expression de α5-nAChR et α7-nAChR avec ou sans traitement α5-siRNA
doi:. 10.1371 /journal.pone.0149120.s001
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S2 Fig. Down-régulation de l'expression α5-nAChR diminué le niveau de P-AKT
doi:. 10.1371 /journal.pone.0149120.s002
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S3 Fig. Expression de α5-nAChR dans BGC823 cellules avec ou sans traitement si-α5-nAChR
doi:. 10.1371 /journal.pone.0149120.s003
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S4 Fig. Nicotine promu BGC823 la prolifération cellulaire par α5-nAChR et α7-nAChR
doi:. 10.1371 /journal.pone.0149120.s004
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S5 Fig. Nicotine promu SGC7901 la prolifération cellulaire par α5-nAChR
doi:. 10.1371 /journal.pone.0149120.s005
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S6 Fig. inhibition de la nicotine de l'apoptose induite par le cisplatine de SCG7901
doi:. 10.1371 /journal.pone.0149120.s006
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• PLOS ONE: Un système de stadification des ganglions lymphatiques pour le cancer gastrique: Un type hybride basé sur les systèmes topographiques et numériques
• PLOS ONE: N-terminal Polypeptide de Annexin A2 Diminue Infection de Mycoplasma hyorhinis aux cellules de cancer gastrique