Ploche ONE: nikotín inhibuje vyvolané cisplatinou apoptózy cez regulačný α5-nAChR /Akt signalizáciu v rakovina žalúdka ľudských bunkách

abstraktné

Žalúdočné výskyt rakoviny demonštruje silnú etiologický súvislosť s fajčením. Nikotín je hlavnou zložkou v tabaku, je prežitie agonista, ktorý inhibuje apoptózu indukovanú určité chemoterapeutickej látky, ale presný mechanizmus zapojené zostávajú do značnej miery neznámy. V poslednej dobe štúdie ukázali, že α5-nikotínové receptory acetylcholínu (α5-nAChR) je vysoko spojené s rizikom rakoviny pľúc a závislosti na nikotíne. Avšak, žiadna informácia boli k dispozícii informácie o tom, či nikotín ovplyvňuje aj proliferáciu ľudských rakovinových buniek žalúdka prostredníctvom regulácie α5-nAChR. Pre vyhodnotenie hypotézy, že α5-nAChR môže hrať úlohu v rakovine žalúdka, sme skúmali jeho expresiu v karcinómu žalúdka tkanivách a bunkových líniách. Expresie α5-nAChR zvýšila v žalúdočnej tkanive karcinómu v porovnaní s para-karcinómu tkanív. S ohľadom na výsledky sa tak dialo skúmať, či nikotín inhibuje vyvolané cisplatinou apoptózu prostredníctvom regulácie α5-nAChR v žalúdočnej nádorové bunky. Výsledky ukázali, že nikotín významne podporovať proliferáciu buniek v dávke, a je závislý na čase prostredníctvom aktivácie α5-nAChR v ľudských bunkách žalúdka. Okrem toho, nikotín inhibuje apoptózu indukovanú cisplatinou. Ticho α5-nAChR ablatované ochranné účinky nikotínu. Avšak, pri súčasnom riadení LY294002, inhibítor PI3K /Akt dráhy, bola pozorovaná zvýšená apoptóza. Tento efekt koreluje s indukciou Bcl-2, Bax, od survivinu a kaspázy-3 od nikotínu v bunkových líniách žalúdku. Tieto výsledky naznačujú, že expozícia nikotínu môže mať negatívny vplyv na proapoptotický potenciál chemoterapeutických liekov a že α5-nAChR /Akt signalizáciu hrá kľúčovú úlohu v anti-apoptotické aktivitu nikotínu indukované cisplatinou

Citácia :. Jia Y , Sun H, Wu H, Zhang H, Zhang X, Xiao D, et al. (2016) s nikotínom inhibuje vyvolané cisplatinou apoptózy cez regulačný α5-nAChR /Akt signalizáciu v rakovina žalúdka ľudských bunkách. PLoS ONE 11 (2): e0149120. doi: 10,1371 /journal.pone.0149120

Editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Spojené štáty

prijatá: 01.06.2015; Prijaté: 15 január 2016; Publikované: 24.února 2016

Copyright: © 2016 Jia et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Dostupné dát :. Vzhľadom k obmedzenia uvalené Jinan centrálnej nemocnice, sú k dispozícii na vyžiadanie údajov. Zúčastnené výskumní pracovníci môžu kontaktovať Dr Xiaolu Ma ([email protected]) požadovať prístup k dátam

Financovanie :. Táto práca je podporovaná Národná prírodná Science Foundation Číny (No. 81272588) a Shandong provinčné prírodopisu Založenie Číny (č ZR2012HM061and ZR2013CM010)

Konflikt záujmov :. autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

Žalúdočné rakovina je jednou z hlavných príčin. úmrtí na rakovinu vo svete. Zdá sa, že obaja genetické a environmentálne faktory sú zapojené do žalúdka rakoviny. Predchádzajúce zistenia rozpadli silnú asociáciu medzi cigaretového dymu a žalúdka výskytu rakoviny [1-3], však, detailné mechanizmus nebol plne študovaná.

Nikotín, hlavná súčasť cigaretového dymu, bolo preukázané, že byť zapojení do iniciácie, propagácie a dokonca progresiu niektorých nádorov, vrátane rakoviny žalúdka. Niekoľko línií dôkazov ukazuje, že nikotín uplatňuje svoje bunkové funkcie prostredníctvom nikotínových acetylcholínových receptorov (nAChR). Rôzne epitelové bunky, a to nielen neurónové bunky, expresné nAChR a štruktúra nAChR je homo- (α7or α9) alebo heteropentamer (α2-α10, b2-b4). Štúdie ukázali, že nikotín stimuloval proliferáciu ľudských buniek karcinómu žalúdka prostredníctvom interakcie s a7-nAChR [4, 5]. Kým rôznym členom rodiny nAChR môže regulovať konvergujúci signálne dráhy, ktoré často majú rozdielne a dokonca protichodné akcií. V poslednej dobe genómu široký štúdie združenia ukázali, že α5-nAChR je veľmi spojené s rizikom rakoviny pľúc a závislosti na nikotíne [6, 7]. Avšak, žiadne informácie je k dispozícii informácie o tom, či nikotín ovplyvňuje aj proliferáciu ľudských buniek karcinómu žalúdka prostredníctvom regulácie α5-nAChR.

Dodávka chemoterapeutika cisplatiny po chirurgickej resekcii v súčasnosti definuje štandardnú liečbu karcinómu žalúdka [8 -10]. Bohužiaľ, získaná rezistencia k cisplatine je bežné a vyhýbanie apoptózu buniek je považovaný za jeden z hlavných mechanizmov zodpovedných za rezistenciu cisplatiny [11, 12]. Najmä nikotínu mohol inhibovať apoptózu indukovanú cisplatinou vo buniek pľúcneho karcinómu [13-15] a ústnej rakoviny [16]. Inhibičný účinok nikotínu na apoptózy bol pripočítaný jeho schopnosti aktivovať anti-apoptotické proteíny, ako je Bcl-2 a survivin, a tiež inaktiváciu proapoptotických proteínov, ako je Bax a kaspázy-3, prostredníctvom aktivácie oboch PI3K /Akt a PKC /EKR signálne dráhy v rakovinových bunkách [13-15]. Tento účinok nikotínu na apoptózu buniek je tiež sprostredkovaný nAChR, ale okrem α5-nAChR, iné podjednotky sa zdajú byť zapojené [17, 18].

Aj keď mnohé z týchto mechanizmov sa pozorovali u karcinómu pľúc [19-21], neexistuje žiadny dôkaz o anti proapoptotický efekt a mechanizmus, ktorým pôsobí na nikotíne buniek karcinómu žalúdka. Cieľom tejto štúdie bolo zistiť, nikotín inhibuje apoptózu indukovanú cisplatinou cez regulačný α5-nAChR v žalúdočnej nádorové bunky. Navyše sme navrhnúť zapojenie pre-faktorov prežitia, ako je Bcl-2 a od survivinu, aktivované AKT cestami, v danom poradí.

Materiály a metódy

Ethics vyhlásenie

protokol štúdie bol schválený lekárskej etiky a ľudskej Trial výboru klinickej Ústredná nemocnice Jinan. Písomný informovaný súhlas bol získaný od všetkých pacientov.

Vzorky tkanív, bunkové kultúry a liečbu drogovej závislosti

Päťdesiat formalínom fixované, parafínových vzorky obsahujúce 40 vzoriek rakoviny žalúdka a 10 para-karcinomové tkaniva boli retrospektívne a náhodne vybrané z evidencie Ústredná nemocnice Jinan potom, čo protokol bol schválený miestnej výskumnej etickou komisiou. Podľa záznamu o fajčení (alebo nie) v anamnéze pacientov, 32 prípadov nemal histórii sacie fajčenia, 8 mal histórii sacie fajčenia. Všetky vzorky boli hodnotené pre diagnózu dvoma skúsenými patológov pre diagnostiku.

rakoviny ľudskej bunkové línie žalúdočné MKN28, SGC7901, BGC823, MGC803, AGS, HGC27 a MKN45 boli získané z bunkovej banky Shanghai Institute, biochémie a bunkovej biológie, čínskej akadémie vied. Bunky boli kultivované v DMEM (Invitrogen) doplnenom 10% fetálneho hovädzieho séra (FBS; Invitrogen), 1% antibiotík pri teplote 37 ° C v 5% CO 2 vlhké s vzduchu. Vo všetkých experimentoch, 60 až 70% z konfluentní bunky boli premyté a inkubované v médiu bez séra po dobu 24 hodín pred ošetrením nikotínu, cisplatiny a LY294002 (Sigma, St. Louis, MO) na uvedenú dobu.

Imunohistochémia

Imunohistochemické farbenie pomocou streptavidin metódy peroxidáza (metóda SP) bola vykonaná na 4 um úsekoch vzoriek parafínových pre detekciu α5-nAChR expresiu v karcinómu žalúdka a karcinómu para-tkanív. Stručne povedané, po Deparafinizace a hydratáciu, bola sklíčka liečení endogénnej peroxidázy v 0,3% H _{2O 2 po dobu 30 minút a blokované po dobu 2 hodín pri teplote miestnosti s 1,5% blokujúce sérum vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom (PBS ). Rezy boli potom inkubované s anti-α5-nAChR protilátky (abca, Inc. Cambridge, MA) (1: 100 riedenie) pri teplote 4 ° C cez noc, premyté PBS a inkubované so sekundárnou anti-myšou biotinylizované protilátky (KIT-5010 , Max Vision, Maixin.Bio, Čína) (1: 2000) v PBS počas 30 minút pri teplote 37 ° C. Protilátka väzba bola detekovaná pomocou streptavidín-biotín-peroxidáza komplex /HRP (Code K0377, Dako) s 3, 3-Diaminobenzidine po dobu 3 minút ako chromogenním substrátom. Sklíčka sa potom ľahko kontrastné hematoxylínom. Ako negatívna kontrola, duplicitné rezy boli zafarbené bez vystavenia primárnymi protilátkami. Tieto výsledky boli pozorované pod mikroskopom.}

Kvantitatívny Real-time RT-PCR

Celková RNA bola izolovaná za použitia reakčného činidla TRIzolu (Invitrogen) podľa inštrukcií výrobcu. Dvadsaťpäť ng celkovej RNA na vzorku bola reverzne transkribovaných pomocou reakcie reverznej transkripcie Kit (Takara kód: DRR061S) podľa inštrukcií výrobcu. Kvantitatívny real-time PCR bola vykonaná analyzované na Applied Biosystems 7300 real-time PCR systém na určenie relatívnych množstiev α5-nAChR a p-aktínu (vnútorná kontrola) mRNA vyjadrené. SYBR Green Supermix bol použitý pre všetky real-time PCR reakcií. PCR priméry použité v tejto štúdii sú nasledovné: α5-nAChR Forward: GAAACTGAGAGTGGTAGTGGACCAA, Reverse: GGGCTATGAATTTCC AATCTTCAAC; glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogenázy (GAPDH) smerom dopredu, 5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 'a reverzné, 5'-AGTCCTTCCACG ATACCAAAGT-3'. Kvantitatívny real-time PCR parametre boli 95 ° C počas 10 sekúnd, ako pre-denaturáciu krokom nasleduje 40 PCR cyklov 95 ° C počas 5 s, 60 ° C počas 30 s a 72 ° C počas 10 minút. Všetky vzorky boli vykonané v troch vyhotoveniach v každom experimente. Relatívne množstvo mRNA bola vypočítaná za použitia komparatívnej metódy CT po normalizácii na beta-aktínu hladiny mRNA.

Western blot analýza

Bunkové pelety sa homogenizujú v extrakčného pufra (50 mmol /l Tris-HCl , pH 6,8, 0,1% SDS, 150 pmol /l chloridu sodného, ​​100 mg /l fenylmetylsulfonyl fluorid, 1 mg /l aprotinínu, 1% NP-40 a 0,5% orthovanadičnan sodný), inkubuje sa pri teplote 4 ° C počas 30 minút a odstredí po dobu 20 min pri 12000 g /min. Celkového proteínu v bunkovom lyzátu bola meraná s použitím kolorimetrického súpravy Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Pre Western blot analýzu, celková bielkovina sa oddelí na 10% SDS-PAGE a prenesené na nitrocelulózové membrány (0,45 um, Millipore, Billerica, MA, USA), ktoré boli inkubované po dobu 24 hodín pri teplote 4 ° C s protilátkami pre α5-nAChR (1: 500, alebo ab41173 ab166718), AKT (1: 500, Epitomics Cat no: 1085-1), P-AKT (1: 500, Epitomics Cat no: 2118-1), kaspasy-3 (1: 500, Epitomics katalógové číslo: 1087-1), Bcl-2 (1: 500, Epitomics Cat no: 1017-1), survivin (1: 500, Epitomics Cat no: 2463-1) a GAPDH (1: 1000, ab37168), potom s chrenovou peroxidázou konjugovanou anti-myšou /králičie IgG protilátka (Santa Cruz Biotechnology) po konečnom premytí. Signály boli detekované s použitím zvýšenej chemiluminiscencie kitu (Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK). Úroveň GAPDH bola vnútorný štandard

RNA interferencie

Dvojité vlákno siRNA oligonukleotid cielenie CHRNA5, ktorý kóduje α5-nAChR (sense :. 5'-CCCGCAAACUACAAAAGUUTT-3 ', antisencie: 5' -AACUUUUCUAGUUUGCCGGTG-3 ') bol syntetizovaný Shanghai Genepharma Co. Ltd. (Čína). Dvojica negatívne kontrolné siRNA bol tiež navrhnutý s rôznymi sekvenciami z siRNA-CHRNA5 a nie homológnej k akejkoľvek sekvencie sa nachádzajú v génovej banky (zmysle: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 'antisencie: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGA-3'). Bunky boli umiestnené v šiestich jamkami. Keď bunky dosiahli 30-50% zhlukovania, že siRNA boli pridané do konečnej koncentrácie 50 nM s Lipofectamine 2000 (Invitrogen) podľa inštrukcií výrobcu.

životaschopnosti buniek Test

Životaschopnosť buniek bola určená CCK8 testom (Dojindo, Tokyo, Japonsko). V stručnosti, bunky nanesené na 96-jamkových doštičkách (1500 buniek /jamku) boli ošetrené s nikotínom v uvedených dávkach. Test proliferácie buniek bola vykonaná pridaním 10 ul CCK8 roztoku do každej jamky a nasleduje inkubácia pri teplote 37 ° C po dobu 2 hodín. Absorbancia bola meraná pri vlnovej dĺžke 450 nm za použitia čítačky mikrodoštičiek (Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader, Biotek, Winooski, VT, USA).

annexin V /7-AAD farbenie

BGC823 bunky boli kultivované pri ústí do 6-jamkových tkanivových kultivačných doštičkách (Falcon, Becton Dickinson Labware) v kompletnom médiu. Potom bolo médium nahradené čerstvým kompletným médiu alebo médiu bez séra; potom boli bunky stimulované samotným alebo v kombinácii s cisplatinou 20 mM počas 24 hodín na základe našich predchádzajúcich dát 100 uM nikotínu, trypsinizovány a dvakrát premyté PBS. Bunky boli zafarbené PE značené annexin V /7-AAD (7-aminoactinomycine-D), v súlade s pokynmi výrobcu (annexin V /7-AAD kit, Becton, Dickinson and Company). Stručne povedané, premyje bunková peleta bola resuspendované v 500 ul pufru Binding Buffer. Ďalej bolo pridané 5 ul annexin-V-PE a 7-AAD 5 ul. Analýza prietokovou cytometriou bola vykonaná ihneď po supravital farbení. získavanie a analýza dát vykonávali v prúde Becton Dickinson FACSCalibur cytometra pomocou CellQuest software. Bunky v raných fázach apoptózy boli AnnexinV pozitívne a 7-AAD negatívne, zatiaľ čo bunky v neskorých štádiách apoptózy boli obaja AnnexinV a 7-AAD pozitívnych.

Hoechst 33342 farbenie

Bunky boli nasadené na 12-jamkové tkanivové kultivačné doštičky a ošetrené uvedenými koncentráciami nikotínu a cisplatiny. Na konci každej inkubácie boli bunky fixované 4% paraformaldehydom po dobu 20 minút, premyté PBS a potom inkubované s Hoechst 33342 (1 ug /ml) po dobu 10 min. Po premytí PBS boli bunky pozorované pomocou fluorescenčného mikroskopu (Olympus, Japan). Aspoň 400 buniek z 12 náhodne vybraných polí na misky boli spočítané, a každá liečba bola vykonávaná v triplikátech.

Štatistiky analýza

Výsledok imunohistochémia bola analyzovaná pomocou χ ^{2 test. Všetky výsledky boli prezentované ako priemer ± smerodajná odchýlka z Tróje experimentov vykonáva paralelným spôsobom, pokiaľ nie je uvedené inak. Význam rozdielu medzi kontrolnými skupinami a nikotínu liečebných skupín bol stanovený bilaterálny t test. Rozdiely boli považované za významné pri P < 0,05 alebo P < 0.01.}

Výsledky

α5-nAChR výrazy vo vzorkách žalúdočné rakovina tkanivových a bunkových línií

boli zistené Expresia α5-nAChR a lokalizované do parafínu zaliate ľudské tkanivá žalúdočné profily. α5-nAChR bol lokalizovaný hlavne na membráne nádorových buniek, aj keď niektoré cytoplazmy farbenie bol pozorovaný (obr 1A). Expresie α5-nAChR bol vyšší u karcinómu žalúdka tkanivách (77,5%, 31/40), než je v para-karcinómu tkaniva (20%, 2/10). Výsledky ukázali trend, že pozitívne miera α5-nAChR expresie zvýšená u pacientov s anamnézou sacím nikotín (87,5%, 7/8) v porovnaní s pacientmi bez nikotínu histórii sania (75,0%, dvadsaťštyri tridsať dvětina).

α5-nAChR mRNA a proteín boli detekovateľné v paneli žalúdočných nádorových bunkových línií. Bunkové línie vyjadrujú rôzne úrovne α5-nAChR proteín, kde bunkové línie s vyššou expresiou boli BGC823, AGS a SGC7901 normalizuje na aktivitu GAPDH (obr 1B). Hladiny expresie α5-nAChR mRNA detekovaná pomocou RT-PCR koreluje s úrovňami expresie proteínu (obrázok 1C). BGC823 vyjadruje vyššej úrovne α5-nAChR než u iných bunkových línií. Pre ďalšie funkčné pokusy, bunková línia BGC823 bol vybraný z dôvodu jeho vyššej expresiu (vhodné pre indukciu nikotín alebo umlčanie pomocou siRNA).

Nikotín podporovaná žalúdočné proliferáciu nádorových buniek prostredníctvom α5-nAChR

určenie, či nikotín môže regulovať proliferáciu žalúdočných buniek, sme skúmali vplyv nikotínu s rôznymi koncentráciami na životaschopnosť buniek v BGC823 analýzou CCK8 (obr 2A). BGC823 boli vystavené na nikotíne (0, 1, 10, 100, 500, 1000 uM) po dobu 24, 48 a 72 hodín, resp. Ako je znázornené na obr 2A, nikotín podporoval proliferáciu buniek v závislosti na čase a koncentrácii závislá na pomere. Nikotín výrazne stimuloval proliferáciu buniek pri nižších koncentráciách (1, 10, 100, 500 uM) a čas (24 až 72 h), ale bol pozorovaný značný pokles počtu buniek v kultúrach, nikotínu spracovaný pri vyšších koncentráciách (1000 um) a čas (72 h). Štúdie preukázali, hladiny nikotínu v tele sa veľmi líši medzi jedincami, aj keď fajčenie rovnaký počet identických cigariet [22 až 24] .v koncentrácie nikotínu (100 uM), použité v tejto štúdii napodobnil dennej dávky cigariet v miernych fajčiarov [ ,,,0],25, 26]. Koncentrácia nikotínu (100 uM), je ekvivalentná koncentráciu v slinách v fajčiar, ktorý sanie 25 cigariet /deň [27]. Pre ďalšie funkčné pokusy, koncentrácie nikotínu (100 uM) bol vybraný pre liečbu žalúdočných buniek po dobu 24 hodín.

Ak chcete zistiť, či je nikotín-sprostredkované propagácie bunkovej proliferácie v žalúdočných buniek je sprostredkovaná α5-nAChR signalizácia, sme analyzovali vplyv nikotínu na expresiu α5-nAChR proteínu BGC823 bunkách pomocou Western blot. Ako je znázornené na obr 2B, spracovanie nikotínu v dávke nikotínu (0, 1, 10, 100, 500, 1000 uM) po dobu 24 hodín, podporované expresie α5-nAChR proteínu spôsobom závislým od dávky. Pre ďalšie potvrdenie zapojenie α5-nAChR signálne dráhy na nikotíne sprostredkované podpore žalúdočné proliferácie nádorových buniek, sme blokovaná expresia α5-nAChR proteínu transfekcia BC823 buniek s α5-nAChR špecifické siRNA (si-α5-nAChR) ( obr 2C) a vyhodnotený jeho účinky na nikotíne sprostredkované podpore bunkovej proliferácie CCK testu (obr 2D). V porovnaní s miešaná nešpecifickej kontroly siRNA (Si-NC), transfekciu s Si-α5-nAChR proliferáciu buniek potlačený. Okrem toho si-α5-nAChR transfekcia významne znížil nikotín sprostredkované propagácie bunkovej proliferáciu v BGC823 buniek (obr 2D).

Nikotín inhibícia vyvolané cisplatinou apoptózy

Pre ďalšie charakterizáciu apoptózu účinky nikotínu v kombinácii s cisplatinou na BGC823, cisplatina bol použitý na indukciu apoptózy v bunkách BGC823. Bunky boli ošetrené 20 mM cisplatiny [28]. Ako je znázornené na obrázku 3a, apoptotické bunky stali sa zaoblený tvar a ich jadrá vykazovali fragmentovanú morfológiu, tvoriace apoptotických teliesok. Naproti tomu, bunky čo-liečených nikotínu a cisplatinou vykazovali malú nukleárnej fragmentácii a niekoľko apoptotických teliesok.

Cisplatina indukovaná apoptóza bola ďalej testovaná AnnexinV /7-AAD farbenie. Prietoková cytometria pozemkov ukázala, že pomer celkového počtu apoptotických buniek (AnnexinV + /7-AAD-) sa znížil from43.2 ± 2,32% to29.9 ± 1,26%, keď je vystavený cisplatiny v kombinácii s 100 uM nikotínu (obr 3B). Tieto výsledky naznačujú, že nikotín môže potlačiť apoptózu indukovanú cisplatinou.

α5-nAChR /AKT signálnej dráhy podieľa na anti-apoptotických účinkov nikotínu v cisplatinou indukovanú apoptózu buniek BGC823

Pre stanovenie úloha AKT v sprostredkovaní účinkov nikotínu v týchto bunkách, sme zistili, či nikotín indukuje aktiváciu Akt v bunkách BGC823. Na obr 4A, 20 mM cisplatina silne potlačená aktivity AKT (dráha 2), ale nikotín zvyšuje expresiu Akt (dráha 3), v prítomnosti cisplatiny. To navrhol, že AKP bol aktivovaný po expozícii 100 uM nikotínu v BGC823 bunkách, ako je uvedené v rôznych dokumentoch [29, 30]. Nadol-regulácia α5-nAChR expresie klesla P-AKT výraz (dráha 4). Liečba s 10 mM LY294002, je fosfatidylinozitol 3-kinázy (PI3K) /AKT inhibítora dráhy, sa znížil anti-apoptotické účinky nikotínu v BGC823 buniek (dráha 5). Navyše liečba LY294002 v kombinácii s Si-CHRNA5 transfekcia výrazne potlačená indukovaného hladín proteínov P-AKT nikotínu (dráha 6). Tieto údaje naznačujú, že α5-nAChR /Akt dráhy hrajú rozhodujúcu úlohu v sprostredkovaní účinkov nikotínu a chemoterapie buniek karcinómu žalúdka.

Ďalej sme skúmali účinky nikotínu na vyvolané cisplatinou kaspasy-3 aktiváciu v BGC823 bunky podľa testu Western blot. Ako je znázornené na obr 4B, cisplatinou indukované zvýšenie kaspázy-3 a aktivácia, pričom aktivácia nikotín zablokované vyvolané cisplatinou kaspázy-3 v BGC823 bunkách. Okrem toho expozície BGC823 buniek k cisplatine spôsobili expresiu apoptických proteínov Bax zvýšenej zatiaľ čo kontrolujúcich prežitie proteín Bcl-2 a survivin sa znížil, ktoré boli inhibované reakciou s nikotínom.

Medzitým, ako je znázornené na obr 4C je anti-apoptotické účinok nikotínu bol zrejme blokovaná Si-α5-nAChR v BGC823 bunkách. Prietoková cytometria pozemkov ukázalo, že podiel z celkového počtu apoptotických buniek (AnnexinV + /7-AAD-) sa zvýšila z 18,5 ± 0,92% na 34,9 ± 1,74%, po si-5 liečby v porovnaní s Si-NC skupiny. Pridanie inhibítora LY294002 AKT s Si-α5-nAChR významne podporoval proapoptotický účinok cisplatiny zo 31,5 ± 1,57% na 61,2 ± 3,06% v porovnaní so skupinou LY294002. Tieto výsledky ukazujú, že nikotín hrá dôležitú úlohu v prevencii cisplatinou indukovanej apoptózy pomocou α5-nAChR /AKT signalizačné dráhe.

Diskusia

Táto štúdia je prvou, ktorá ukazujú zásadnú úlohu α5-nAChR nikotínu anti-apoptózu cisplatiny v ľudských buniek karcinómu žalúdka. Analýza klinických vzoriek ukázala, že α5-nAChR výraz je všeobecne vyššia v nádorových bunkách v porovnaní s para-bunkách karcinómu. Výsledky ukázali trend, že pozitívne miera α5-nAChR expresie bola vyššia u pacientov s históriou nikotínu sania, než u pacientov bez nikotínu histórii sania. Výsledky in vitro ukázali, že nikotín up-regulované expresiu α5-nAChR proteínu a inhibuje vyvolané cisplatinou apoptózy regulovaním α5-nAChR /Akt signálne cestu do buniek karcinómu žalúdka. Nikotín zabránila aktivácii vyvolanej cisplatinou kaspázy-3 a Bax, a up-regulované expresiu antiapoptotických proteínov Bcl-2 a survivin. Okrem toho sa zistilo, že aktivácia Akt, že hrá úlohu pri sprostredkovaní cisplatinou indukovanú apoptózu, rovnako ako anti-apoptotické účinky nikotínu v BGC823 bunkách. To môže byť zaujímavé venovať pozornosť vzťahu medzi cigaretovým dymom (druhá fajčenie) a žalúdočné výskytu rakoviny.

Predchádzajúca zistenie rozlúštil silný vzťah medzi cigaretovým dymom a rakovinou žalúdka [31, 32]. Nikotín bolo preukázané, že zvýšenie proliferácie a migrácie buniek karcinómu žalúdka vyvolaním cyclooxgenase-2 (COX-2), prostaglandín E2, VEGF, beta-adrenergných receptorov, proteín kinázy C [26, 33, 34]. Tieto účinky sa zdajú byť sprostredkovaný cez homopentameric a7-nAChR [35]. Avšak, nedávne štúdie preukázali, neočakávaný účinok heteropentameric α5-nAChR na nikotíne príjmu [36-38]. Naše predchádzajúce práce uvádzajú, že nikotín /α5-nAChR cesta je zásadný pre životaschopnosť buniek karcinómu pľúc [21, 39]. Avšak, žiadna informácia boli k dispozícii informácie o tom, či nikotín ovplyvňuje aj proliferáciu ľudských rakovinových buniek žalúdka prostredníctvom regulácie α5-nAChR. Tu sme študovali úlohu α5-nAChR v ľudskej rakoviny žalúdka. Naše výsledky ukazujú, že expresia α5-nAChR bola vyššia v žalúdočných rakovinové tkanive v porovnaní s para-karcinómu tkanivá, ktoré naznačujú, že α5-nAChR môže hrať úlohu v žalúdočnej karcinogenéze. Okrem toho, nikotín podporoval expresie proteínu α5-nAChR a blokuje aktiváciu α5-nAChR o siRNA atenuovaný nikotín vyvolané žalúdočné proliferáciu rakovinových buniek. Sa navrhuje, aby α5-nAChR, je jedným z hlavných molekúl sprostredkovávajú bunkovej proliferácie stimulovanej nikotínu do buniek karcinómu žalúdka.

Súčasný štandardné chemoterapia pre rakovinu žalúdka je cisplatina, ale úspešnosť tejto liečby je zlá. Účinnosť cisplatiny závisí od schopnosti indukovať poškodenie DNA [40, 41]. Z tohto dôvodu, ako rakovinové bunky reagujú na cisplatiny indukovanej apoptózy hrá dôležitú úlohu v citlivosti cisplatiny. Nedávne správy ukazujú, že nikotín inhibuje apoptózu indukovanú cisplatinou v rakovinových bunkách pľúc, rakovinu ústnej dutiny, Raw264.7 a EL4 bunky [13, 16, 18], ktoré môžu naznačovať, že nikotín má schopnosť nielen na podporu rozvoja rakoviny aktiváciou rast buniek ciest , ale aj k zníženiu účinnosti chemoterapeutických činidiel stimuláciou dráhy prežitia. V súlade s predchádzajúcimi poznatkami, výsledky tejto štúdie ukázali, že bolo pozorované súčasné ošetrenie buniek s cisplatinou a nikotínu, významné aktivácia kaspázy-3, čo naznačuje, že nikotín je schopný určiť inhibíciu apoptotické potenciálu z cisplatinou u karcinómu žalúdka.

signálne dráhy, ktoré regulujú bunkové procesy, vrátane bunkovej proliferácie, progresiu bunkového cyklu a apoptózu buniek, majú významný vplyv na rozhodovanie o tom, bunkovej odpovede na cisplatinu. Predchádzajúce štúdie ukázali, že aktivácia Akt dráhy môže viesť k rezistencii k cisplatine [42, 43]. Cez-výraz serín fosforylovaná AKT bola detekovaná v širokej škále ľudských nádorov, vrátane rakoviny žalúdka [44, 45]. Ako je uvedené v rôznych dokumentoch, nikotínu väzbou na nAChR vedie k následnému aktivácii nádorových propagáciu proteínov, vrátane aktivácie Akt dráh [46-48]. Expozícia nikotínu môže mať negatívny vplyv na apoptotické potenciál cisplatiny v ľudských bunkách rakoviny ústnej dutiny, a AKT dráha bola nutná pre funkciu nikotínu [16]. Avšak, AKT dráha nikotínové signalizácie downstream a anti-apoptotických účinkov nikotínu vo buniek karcinómu žalúdka boli neznáme. Preto sme skúmali, či P-AKT môže zodpovedať za antagonizované účinku nikotínu na cytotoxicitu cisplatiny. Zistili sme, že spolupráca liečení siRNA-α5-nAChR a LY294002, inhibítora PI3K /Akt dráhy, zvýšená apoptóza vyvolané cisplatinou a oslabený účinky nikotínu v BGC823 bunkách. Niekoľko štúdií zvýraznené nikotínové aktivácii Akt signálne dráhy je v modulácii bunkovej proliferácie a prežitia prostredníctvom aktivácie kontrolujúcich prežitie proteínu Bcl-2 a survivin [15, 49, 50]. Náš výskum tiež preukázal, že úloha nikotínu na apoptózu buniek indukovanú cisplatinou pomocou α5-nAChR /Akt je potvrdená indukciou survivinu a Bcl-2, ako koncové efektory dráh vyššie.

V súhrne sme ukázali že nikotín aktivuje α5-nAChR /Akt signalizáciu a podieľa sa na odolnosti cisplatinou u karcinómu žalúdka. Tieto nálezy poskytujú nový pohľad na možných molekulárnych mechanizmov nikotínu inhibícia vyvolanej cisplatinou apoptózy u ľudských buniek karcinómu žalúdka (obrázok 5). Nikotín prítomný v cigaretovom dyme môžu interferovať s rakovinou žalúdka farmakologickú liečbu tým, že zabráni chemoterapiou apoptózy drogami indukovanej. Stratégie zamerané na pochopenie nikotínu sprostredkovanú signalizáciu môže uľahčiť rozvoj pokročilejších terapií u karcinómu žalúdka.

Podporné informácie
S1 Obr. Expresie α5-nAChR a a7-nAChR bez alebo s α5-siRNA liečby
doi :. 10,1371 /journal.pone.0149120.s001
(TIF)
S2 Obr. Down-regulácia α5-nAChR vyjadrenie sa znížil hladinu P-Akt
doi :. 10,1371 /journal.pone.0149120.s002
(TIF)
S3 Obr. Expresie α5-nAChR v BGC823 bunkách bez alebo s liečbou Si-α5-nAChR
doi :. 10,1371 /journal.pone.0149120.s003
(TIF)
S4 Obr. Nikotín podporoval BGC823 proliferáciu buniek cez α5-nAChR a α7-nAChR
doi :. 10,1371 /journal.pone.0149120.s004
(TIF)
S5 Obr. Nikotín podporoval SGC7901 proliferáciu buniek cez α5-nAChR
doi :. 10,1371 /journal.pone.0149120.s005
(TIF)
S6 Obr. Nikotín inhibícia cisplatinou indukovanej apoptózy SCG7901
doi :. 10,1371 /journal.pone.0149120.s006
(TIF)

• Ploche ONE: lymfatické uzliny Staging systém pre rakoviny žalúdka: Hybridný typ na topografických a numerických systémov založených
• Ploche ONE: N-Terminal polypeptid annexinu A2 Znižuje Infekcia Mycoplasma hyorhinis sa rakovina žalúdka Cells