CHD5 é regulada através de hipermetilação do promotor em CHD5 cancer

gástrico é regulada através de hipermetilação do promotor no câncer gástrico da arte abstracta
Fundo
proteínas Nonhistone cromossômicas em concerto com histonas desempenham papéis importantes na replicação e reparação de DNA e na regulação da expressão gênica. A desregulação destas proteínas pode contribuir para o desenvolvimento de uma variedade de doenças tais como o cancro. Como uma proteína nonhistone cromossómico, proteínas de ligação ao ADN da helicase chromodomain 5 (CHD5) foi recentemente identificada como o produto de um gene supressor de tumor romance (TSG), promover a transcrição de p19 ink4a
e p16 ARF
. A inativação do CHD5 foi conseguido em parte através da deleção genética, uma vez que está localizado em 1p36, uma região freqüentemente excluído em tumores humanos. Neste estudo, pretendemos estudar o envolvimento de CHD5 no câncer gástrico, o segundo tipo de câncer mais comum no mundo inteiro.
Métodos
expressão CHD5 em um painel de células cancerosas gástricas foram determinadas por RT-PCR quantitativo. A metilação do CHD5 foi avaliada por metilação PCR específico e sequenciamento do genoma bissulfito. O efeito de CHD5 sobre o crescimento de células de cancro gástrico foi testado pelo ensaio de formação de colónias. Os resultados

expressão CHD5 foi regulada para baixo em todas as linhas celulares de cancro gástrico usado (100%, 7/7) e depois restaurado significativamente desmetilação farmacológica. A metilação do promotor CHD5 foi detectada em todas as sete linhas de células de cancro gástrico e na maioria dos tecidos do carcinoma gástrico primários examinados (73%, 11/15). Finalmente, a expressão ectópica de CHD5 em células cancerosas gástricas levaram a uma inibição do crescimento significativo.
Conclusão
CHD5 foi um TSG epigenetically regulada no cancro gástrico.
Fundo
Todos os organismos eucariotas desenvolveram formas elaboradas embalagens de ADN em cromatina através das interacções dinâmicas de várias proteínas associadas a ADN. Tal embalagem é não somente importante para o armazenamento de informação genética com alta fidelidade e integridade, mas também a transferência da informação genética a partir de ADN para ARN de um modo bem controlado. As proteínas que se ligam ao DNA para formar cromatina são tradicionalmente divididos em duas classes gerais: histonas e proteínas cromossómicas nonhistone. Histonas são um grupo de proteínas de ligação de ADN altamente conservadas e suas várias modificações pós-traducionais constituem o "código de histonas" que orienta a embalagem de DNA ou remodelação da cromatina. O código de histonas é iniciada, mantida e interpretada em grande parte por proteínas cromossômicas nonhistone [1-4]. Por exemplo, a acetilação de resíduos de lisina em caudas das histonas por histona-acetiltransferases (HATs) e neutraliza a carga diminui a afinidade das histonas com o ADN, tornando o ADN acessível para factores de transcrição para iniciar a transcrição do gene. Por outro lado, a desacetilação destes resíduos por histona desacetilases (HDACs) restaura a esta afinidade e pode retirar-se DNA a partir de maquinaria transcricional [5]. Além de acetilação, fosforilação e a metilação de restos de histonas são importantes para a associação dinâmica de ADN com a maquinaria de transcrição e outras proteínas cromossómicas [6-8]. proteínas cromossômicas Nonhistone desempenham papéis importantes na interpretação de código de histonas, formando complexos de cromatina remodelação. Ambas as histonas e proteínas cromossômicas nonhistone são importantes para a regulação da expressão gênica, replicação do DNA e reparo do DNA. As desregulações na expressão e actividade destas proteínas pode resultar no desenvolvimento de uma variedade de doenças, tais como cancro [9-13].
Em um estudo recente, a proteína de ligação do ADN da helicase chromodomain 5 (CHD5) foi identificado como um novo gene supressor de tumor (TSG) em neuroblastoma [14]. CHD5 pertence a uma superfamília de ATPases relacionadas com SNF2 SWI2 /, um grande grupo de proteínas cromossômicas nonhistone. CHD5 codifica uma combinação única de domínios funcionais consistindo de dois chromodomains do terminal N, seguido por um domínio semelhante a SNF2-SWI2 /ATPase /helicase e um domínio de ligação de ADN [14]. Ao regular a estrutura da cromatina, CHD5 pode promover a expressão de p19 ARF que funciona para estabilizar p53, o supressor de tumores inactivado, em mais de metade dos cancros humanos [15]. CHD5 está presente num locus de um gene (1p36.31) suprimido em cerca de 35% de neuroblastoma [16]. CHD5 foi previamente pensado para ser expresso especificamente no sistema nervoso, mas o seu papel no cancro em outros tecidos está a começar a emergir [17]. gene CHD5 foi significativamente suprimida em glioma [18]. Para além da deleção do gene, CHD5 pode ser suprimida por outros mecanismos. Em alguns casos de neuroblastoma, existem provas de que a expressão CHD5 epigeneticamente é suprimida por hipermetilação do promotor [19], embora esta observação não foi confirmado por outro estudo [20]. Recentemente, o promotor CHD5 foi encontrado para ser metilado em pequenos subconjuntos de mama (4,4%), cólon (10%), do ovário (15%) e tumores de glioma (17%) [17, 20], sugerindo silenciamento epigenético de CHD5 por metilação pode desempenhar um papel na tumorigénese parcial nesses tecidos. Aqui verificou-se que, em contraste com outros tipos de cancro relatados até agora, CHD5 era frequentemente hipermetilado em cancro gástrico (73% de tumores e linhas de células de 100%). A expressão ectópica de CHD5 em células de cancro gástrico levou a uma inibição significativa do crescimento. Esta correlação marcante da supressão epigenética de CHD5 e câncer gástrico sugere uma relação até então desconhecida entre este TSG e tumorigênese gástrico.
Métodos
cultura de tecidos e RNA /extração de DNA
Todas as linhas celulares de cancro gástrico (AGS, Kato III, MKN28, MKN45, SNU1, SNU16 e NCI-N87) foram obtidos a partir de Riken Gene Bank (Tsukuba, Ibaraki, Japão) e American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). Todas as linhas celulares de cancro foram estabelecidas a partir de carcinomas de células epiteliais gástricas. A menos que especificamente indicado, as células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com soro fetal bovino a 10%, a 37 ° C com 5% de CO 2, e 95% de humidade. Para desmetilação farmacológico, as células foram tratadas com 5 uM de 5-aza-2'-desoxicitidina (AZA) (Sigma, St Louis, MO, EUA) durante três dias consecutivos [21]. Aza foi reabastecido a cada 24 horas. Uma concentração equivalente do veículo (DMSO) foi utilizado como controlo. Para os tecidos primários, os tecidos gástricos normais foram definidos como tecidos não-inflamatórios e não-tumorais. Todos os tecidos do carcinoma gástrico são tecidos de adenocarcinoma. O ARN total e o ADN genómico foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.
Quantitativa em tempo real de RT-PCR Inversa
reacção de transcrição foi efectuada utilizando 1 ug de ARN total com a transcrição reversa do sistema (Promega, Madison , WI, EUA). Os níveis de expressão de ARNm do CHD5 foram determinados por Kit em tempo real de RT-PCR Master Mix SYBR Green quantitativa (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). desidrogenase de gliceraldeído-3-phosohate (GAPDH) foi usada como um controlo interno da integridade do RNA. Iniciadores utilizados para CHD5 RT-PCR foram CHD5-F: 5'-AGTTCCGTGTGAGGATGAAC e CHD5-R:. 5'-TCAAGGCTGACGTGTTCAAG
metilação específicas de PCR (MSP)
estado de metilação de CHD5 foi determinada pelo MSP usando bissulfato modificado genômico ADN como molde. O ADN genómico foi tratado com bissulfito-Zymo DNA Modification Kit (Zymo Research, Orange, CA, EUA) de acordo com o protocolo fornecido. MSP foi realizada durante 40 ciclos com uma temperatura de recozimento a 62 ° C, tal como previamente descrito [22]. iniciadores específicos de metilação foram: CHD5M-F: 5'-GTTCGGGGTTTAGCGTTTTC (a partir de -525 a -506 relativamente ao local de inicio da transcrição) e CHD5M-R: 5'-GAAACTTAACGAACCCGAACG (a partir de -438 a -418), e específico do unmethylation Os iniciadores foram: CHD5U-F: 5'-GGGTTTGGGGTTTAGTGTTTTT e CHD5U-R: 5'-TCAAAACTTAACAAACCCAAACA. Todos os iniciadores foram confirmadas anteriormente por não amplificar qualquer DNA unbisulfited
Bissulfito sequenciação do genoma (BGS)
bissulfito tratado DNA foi amplificado utilizando iniciadores BGS, CHD5-BF:. 5'-GTTGTAAATTAGATTTATAGTTTT (de -724 a -701) e CHD5-BR: 5'-GCAAATTAAAAAACTAATCCTAAA (a partir de -324 a -301). Os produtos de PCR foram purificados com Illustra GFX ™ PCR e kit de purificação de banda gel (ciências da vida GE Healthcare, Uppsala, Suécia) e clonado no vector pCR4-TOPO para o seqüenciamento (Invitrogen). Pelo menos 6 colónias foram escolhidos aleatoriamente para a extracção de plasmídeo e análise de sequenciação.
Construção de plasmídeos de expressão CHD5
O plasmídeo de expressão CHD5 foi construído por clonagem do comprimento total CHD5-grelha de leitura aberta em mamífero pcDNA3.1 vector de expressão. A grelha de leitura aberta CHD5 foi amplificado a partir de ADNc estômago normal, utilizando alta fidelidade Pfu ADN polimerase (Invitrogen) e clonado em pcDNA-TOPO4 (Invitrogen). Após a validação sequenciação, a inserção foi subclonado em pcDNA3.1 com as enzimas de restrição Hind III e Xba I.
ensaio de formação de colónias
transfectadas transientemente células AGS com pcDNA3.1 vazio ou pcDNA3.1-CHD5 foram usadas para monocamada ensaio de formação de colónia. As células foram cultivadas durante a noite numa placa de 12 poços (1,0 × 10 5 /po) e transfectadas com o vector pcDNA3.1 ou que expressam CHD5 usando Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen). 48 horas mais tarde, os transfectantes foram re-plaqueadas em triplicado e cultivadas durante 10-15 dias em meio RPMI 1640 completo contendo G418 (400 ug /ml). As colónias sobreviventes foram coradas com violeta de genciana após a fixação metanol e colônias superiores a determinado tamanho (≥ 50 células) foram contados. As experiências foram repetidas três vezes. Os resultados

A regulação negativa da expressão CHD5 em linhas celulares de cancro gástrico
A expressão de CHD5 em linhas celulares de cancro gástrico foi determinada por RT-PCR quantitativo. Enquanto CHD5 foi altamente expressa em tecidos normais gástricos, as suas expressões eram sub-regulada em todas as 7 linhas de células de cancro gástrico (AGS, Kato III, MKN28, MKN45 e NCI-N87 SNU1 e SNU16) (fig. 1). A Figura 1 CHD5 é regulada negativamente em linhas celulares de cancro gástrico. A expressão de CHD5 em linhas celulares de cancro gástrico foi determinada por RT-PCR. GAPDH foi utilizada para normalizar a expressão CHD5. O tecido do estômago normal (estômago) foi utilizado como a referência. Resultados das quantitativo em tempo real de RT-PCR foi mostrado no painel superior e o resultado de RT-PCR convencional foi mostrada no painel inferior.
Hipermetilação do promotor CHD5 em linhas celulares de cancro gástrico e tecidos do carcinoma gástrico primários
Um típico CpG Island (CGI) foi encontrado em torno CHD5 exão 1, utilizando os seguintes critérios: conteúdo GC > 55%, ObsCpG /ExpCpG > 0,65, eo comprimento > 500 pb (Fig 2A.). O estado de metilação do presente CGI em células de cancro gástrico foi determinada por PCR de metilação específico (MSP). Como mostrado na Fig. 2B, a metilação completa ou parcial foi detectada em todas as 7 linhas de células de cancro gástrico examinados. Em consonância com os dados sobre as linhas de células gástricas, o promotor CHD5 também foi metilado na maioria dos tecidos do carcinoma gástrico primário testadas (73%, 11/15) (Fig. 2C). Importante, a metilação do promotor CHD5 foi ou não detectado ou fracamente detectável em tecidos normais adjacentes aos tumores dos mesmos pacientes e nos tecidos gástricos de indivíduos normais. Além disso, a metilação do promotor CHD5 em linhas celulares de cancro gástrico e tecidos do carcinoma gástrico foi confirmada por sequenciação do genoma bissulfito (BGS) (Fig. 2D). Tomados em conjunto, CHD5 foi predominantemente silenciados no cancro gástrico e hipermetilação do promotor parece ser o principal mecanismo de silenciamento CHD5 na tumorigénese deste tecido. Figura 2 promotor CHD5 é hipermetilado no câncer gástrico. A, CHD5 tem uma ilha típica CpG (CGI) em torno do seu exão 1. CGI foi traçada pelo programa GeneTool. As posições dos iniciadores BGS e MSP foram indicados como setas. B, O estado de metilação do promotor de CHD5 em células cancerosas gástricas foi determinada por PCR específica de metilação. H: metilação; L: unmethylation. C, O estado de metilação do promotor de CHD5 em tecidos de cancro gástrico primários foi determinada por PCR específica de metilação, como nos tecidos gástricos normais B. e tecidos não tumorais adjacentes foram usadas como controlos. N1 e N2 são tecidos gástricos normais. T1 e T2 indicam os tecidos do carcinoma gástrico, enquanto A1 e A2 representam tecidos não tumorais adjacentes. resultados representados foram mostrados. D, A metilação do promotor CHD5 em linhas celulares de cancro gástrico e tecidos do carcinoma gástrico primários foi confirmada por BGS. Cada círculo indica um sítio CpG e círculos preenchidos a preto representam metilado locais CpG. Uma linha de círculos representa uma única colónia.
-Regulação da expressão CHD5 após o tratamento Aza
Para confirmar adicionalmente o promotor CGI mediada por hipermetilação silenciamento CHD5 em linhas celulares de cancro gástrico, expressões CHD5 em AGS e Kato III antes e depois de reagente de desmetilação foram analisados ​​tratamento com AZA. Ambas as linhas celulares exibem metilação completa do promotor CHD5. CHD5 expressão nestas duas linhas de células foram significativamente aumentados após desmetilação-Aza induzida de promotor CHD5 (Fig. 3A e 3B), demonstrando que de facto é CHD5 epigeneticamente silenciados no cancro gástrico. Figura 3 desmetilação farmacológico reativa expressão CHD5 em linhas celulares de cancro gástrico. Um, expressões CHD5 relativa antes e após o tratamento Aza foram determinados por RT-PCR, como na Fig. 1. GAPDH foi utilizada para normalizar a quantidade molde. B, A desmetilação do promotor em células CHD5 AGS após tratamento foi confirmada por Aza BGS como na Fig. função inibitória do crescimento 2D.
de CHD5
A propriedade supressão do tumor de CHD5 em células cancerosas gástricas foi investigado por uma estratégia de ganho de função. full frame de leitura aberta (ORF) de CHD5 foi clonado em mamíferos pcDNA3.1 vetor de expressão. O efeito da expressão ectópica CHD5 sobre o crescimento de células de cancro gástrico AGS foi determinada com ensaio de formação de colónia em monocamada. A expressão forçada de CHD5 em células AGS foi confirmada por RT-PCR (Fig. 4A). O número de colónias formadas sobre a placa de células que sobre-expressam CHD5 foi significativamente reduzida (p
< 0,01) (Figura 4B e 4C.), Indicando que CHD5 pode suprimir o crescimento de células de cancro gástrico. Figura 4 CHD5 inibe o crescimento de linha celular de cancro gástrico AGS. O efeito da expressão ectópica CHD5 sobre o crescimento de células tumorais foi investigada pelo ensaio de formação de colónia em monocamada. A, expressão em células CHD5 AGS após transfecção foi determinada por RT-PCR. A fotografia de colônias formadas por células AGS transfectadas com pcDNA3.1 (vector) ou pcDNA3.1-CHD5 (CHD5) foi mostrado em B. C, análises quantitativas dos números de colónias são mostrados como valores de ± desvio padrão. Os valores de P
foram calculados utilizando o teste t de estudante. O asterisco indica diferença estatisticamente significativa (p Art < 0,01).
Discussão
Ao longo dos últimos anos, muitas ETG foram encontrados para ser epigenetically inativada no câncer gástrico, o que indica que o silenciamento epigenético de ETG é um das principais alterações moleculares no processo de carcinogênese gástrica [22-25]. Neste estudo, CHD5 foi identificado como outro potencial TSG cuja inactivação epigenética pode contribuir para a carcinogénese gástrica. Ele foi frequentemente regulada através de hipermetilação do promotor em linhas celulares de cancro gástrico. A expressão ectópica de CHD5 conduziu à inibição do crescimento de células de cancro gástrico, o que indica que CHD5 funciona como um TSG epigeneticamente silenciados no cancro gástrico.
Hipermetilação do promotor CHD5 em cancro tem sido observada em outros cancros [17, 20]. No entanto, a incidência de CHD5 metilação do promotor em linhas celulares de cancro e tumores gástricos foi encontrado neste estudo a ser relativamente elevado, em comparação com a frequência de CHD5 metilação em outros cancros (geralmente abaixo de 20%) [17, 20]. Naturalmente, mais amostras deve ser utilizado para confirmar este resultado com os mesmos iniciadores de MSP nos seguintes estudos. No entanto, a nossa descoberta sugere que CHD5 inactivação pode ser mediada por mecanismos diferentes em tecidos diferentes. Considerando CHD5 é inactivada através do número de cópias anormalidade em vários cancros [15, 16], hibridação genómica comparativa (CGH) indicou que 1p36, o locus do gene contendo CHD5, não é significativamente desequilibrado em cancros gástricos [26]. Em vez disso, como demonstrado neste estudo, CHD5 parece ser silenciado predominantemente por hipermetilação do promotor no câncer gástrico.
Há evidências crescentes de que a hipermetilação do promotor TSG representa uma das principais alterações moleculares no desenvolvimento do câncer. A elevada incidência de CHD5 hipermetilação do promotor em cancro gástrico pode ser explorado não apenas como um diagnóstico de cancro gástrico mas também o prognóstico de predição. Para este fim, é importante caracterizar a metilação do promotor CHD5 em associação com características clínicas, tais como a idade, o sexo, a infecção por H. pylori, o grau do tumor, a classificação Lauren e diferenciação. Dado que a grande heterogeneidade de tecidos de carcinoma gástrico primários, a metilação analisa com maior resolução, como a análise específica de metilação quantitativa usando Sequenom ou Taqman PCR em tempo real será útil para avaliar se o promotor CHD5 metilação é útil para a detecção do câncer gástrico precoce e previsão prognóstico.
Apesar de metilação do promotor frequentemente inactiva CHD5 em linhas celulares de cancro gástrico, não podemos excluir a presença de outros mecanismos para a função de perda de CHD5 no câncer gástrico. expressão CHD5 é extremamente baixo em MKN28 e SNU16 (Fig. 1), contudo, o promotor de CHD5 foi apenas parcialmente metilados nestas duas linhas celulares (Fig. 2B), indicando que outros mecanismos podem ser responsáveis ​​para o silenciamento de CHD5 em alguns de linhas celulares de cancro gástrico.
Conclusão
CHD5 era frequentemente regulada através de hipermetilação do promotor em células cancerosas gástricas. A expressão ectópica de CHD5 levou a inibição do crescimento das células cancerosas gástricas, indicando que CHD5 funciona como um gene supressor de tumor epigenetically silenciada no câncer gástrico.
Declarações
Agradecimentos
Agradecemos Dr Hongchuan Jin (Biomedical Research Center, Sir Runrun Shaw Hospital, Universidade de Zhejiang), por sua inestimável aconselhamento e apoio técnico. O trabalho descrito neste trabalho foi parcialmente financiado por uma concessão do Conselho Bolsas de Investigação da Região Administrativa Especial de Hong Kong, China (Projeto No. CityU 160.508). Arquivos enviados originais
dos autores para imagens
Abaixo estão as links para arquivos submetidos originais dos autores das imagens. 'arquivo original para a figura 1 12929_2009_95_MOESM2_ESM.jpeg Autores' 12929_2009_95_MOESM1_ESM.jpeg Autores arquivo original para a figura 2 12929_2009_95_MOESM3_ESM.jpeg Autores 'arquivo original para a figura 3 12929_2009_95_MOESM4_ESM.jpeg Autores' arquivo original para a figura 4 Conflito de interesses
Os autores declaram que têm interesses conflitantes.

• O impacto prognóstico do receptor do fator de crescimento epidérmico em pacientes com cancro gástrico metastático
• -Roux en-y de desvio laparoscópica ajustável faixas gástrica como procedimento primário para o super-super-obesos (índice de massa corporal > 60 kg /m2)