CHD5 er nedregulert gjennom promoter hypermethylation i mage cancer

CHD5 er nedregulert gjennom promoter hypermethylation i magekreft
Abstract
Bakgrunn
Nonhistone kromosom proteiner i konsert med histoner spiller viktige roller i replikering og reparasjon av DNA og i reguleringen av genekspresjon. Dereguleringen av disse proteinene kan bidra til utvikling av en rekke sykdommer så som kreft. Som et nonhistone kromosom protein, har chromodomain helicase DNA-bindende protein 5 (CHD5) nylig blitt identifisert som et produkt av en roman tumor suppressor genet (TSG), fremme transkripsjon av p19 ink4a Hotell og p16 ARF
. Inaktivering av CHD5 ble oppnådd blant annet gjennom genetisk sletting siden det ligger i 1p36, en region ofte slettet i humane tumorer. I denne studien ønsker vi å studere involvering av CHD5 i magekreft, den nest vanligste kreftformen i verden.
Metoder
CHD5 uttrykk i et panel av mage kreft celler ble bestemt ved kvantitativ RT-PCR. Den metylering av CHD5 ble evaluert ved metylering spesifikk PCR og bisulfitt genom sekvensering. Effekten av CHD5 på vekst av magekreftceller ble testet av kolonidannelse analysen.
Resultater
CHD5 uttrykk ble nedregulert i alt av magekreft cellelinjer brukes (100%, 7/7) og betydelig restaurert etter farmakologisk demetylering. Metylering av CHD5 promoteren ble påvist i alle syv gastrisk kreft-cellelinjer, og i de fleste primære gastrisk karsinom vev undersøkes (73%, 11/15). Til slutt, ektopisk uttrykk for CHD5 i magekreftceller har ført til en betydelig veksthemming.
Konklusjon
CHD5 var en TSG epigenetiske nedregulert i magekreft.
Bakgrunn
Alle eukaryote organismer har utviklet forseggjort måter av emballasje DNA i kromatin gjennom den dynamiske interaksjoner av forskjellige DNA-assosierte proteiner. En slik innpakning er ikke bare viktig for lagring av genetisk informasjon med høy nøyaktighet og integritet, men også overføring av genetisk informasjon fra DNA til RNA på en kontrollert måte. Proteiner som binder seg til DNA for å danne kromatin er tradisjonelt delt inn i to generelle klasser: histoner og nonhistone kromosom proteiner. Histoner er en gruppe av høyt konserverte DNA bindende proteiner og deres ulike posttranslasjonelle modifikasjoner utgjør 'histone koden "som styrer pakking av DNA eller kromatin remodeling. Den histone kode er initiert, vedlikeholdes og tolket i stor grad av nonhistone kromosomale proteiner [1-4]. For eksempel acetylering av lysinresidier på histone tails av histon acetyltransferases (HATS) nøytraliserer deres ansvar og reduserer affinitet av histoner med DNA, noe som gjør DNA tilgjengelig for transkripsjonsfaktorer for å initiere gentranskripsjon. Motsatt deacetyleringen av disse restene av histon deacetylases (HDACs) gjenoppretter denne affinitet og kan ta ut DNA fra transkripsjonen maskiner [5]. I tillegg til acetylering, fosforylering og metylering av histone haler er viktig for dynamisk forening av DNA med transcriptional maskiner og andre kromosomavvik proteiner [6-8]. Nonhistone kromosom proteiner spiller viktige roller i tolkningen av histon-kode ved å danne kromatin remodeling komplekser. Begge histoner og nonhistone kromosom proteiner er viktig for regulering av genekspresjon, DNA replikasjon og DNA reparasjon. De dereguleringer i ekspresjon og aktivitet av disse proteiner kan føre til utvikling av en rekke sykdommer så som kreft [9-13].
I en nyere undersøkelse, ble chromodomain helikase DNA-bindende protein 5 (CHD5) identifisert som en roman tumor suppressor gen (TSG) i neuroblastom [14]. CHD5 tilhører en superfamily av SWI2 /SNF2-relaterte ATPaser, en stor gruppe av nonhistone kromosomale proteiner. CHD5 koder for en unik kombinasjon av funksjonelle domener som består av to N-terminale chromodomains, etterfulgt av en SWI2 /SNF2 lignende ATPase /helikase domene og et DNA-bindende domene [14]. Ved å regulere kromatinstruktur kan CHD5 fremme ekspresjon av p19 ARF som fungerer for å stabilisere p53 tumor suppressor inaktivert i mer enn halvparten av humane cancere [15]. CHD5 er til stede ved et gen locus (1p36.31) slettet i omtrent 35% av neuroblastom [16]. CHD5 ble tidligere antatt å være spesifikt uttrykkes i nervesystemet, men dens rolle i kreft i andre vev begynner å dukke opp [17]. CHD5 genet ble funnet signifikant slettet i glioma [18]. Bortsett fra genet sletting, kan CHD5 undertrykkes ved andre mekanismer. I noen tilfeller av nevroblastom, er det bevis på at CHD5 uttrykket epigenetiske trykkes av promoter hypermethylation [19], selv om dette ikke er observasjonen ble bekreftet av en annen studie [20]. Nylig har CHD5 promoteren blitt funnet å være metylert i små delmengder av bryst (4,4%), tykktarm (10%), eggstokk (15%) og gliom (17%) tumorer [17, 20], som tyder på epigenetisk stanse av CHD5 ved metylering kan spille en rolle delvis i tumorgenese i disse vevene. Her har vi funnet at, i motsetning til andre former for kreft som er rapportert hittil, CHD5 var ofte hypermethylated i magekreft (73% av tumorer og 100% cellelinjer). Ektopisk uttrykk for CHD5 i magekreftceller ført til en betydelig veksthemming. Dette slående korrelasjon av epigenetisk undertrykkelse av CHD5 og magekreft antyder en tidligere ukjent sammenheng mellom dette TSG og mage tumorigenesis.
Metoder
Tissue kultur og RNA /ekstraksjon DNA
Alle mage kreft cellelinjer (AGS, Kato III, MKN28, MKN45, SNU1, SNU16 og NCI-N87) ble hentet fra Riken Genbank (Tsukuba, Ibaraki, Japan) og American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Alle kreftcellelinjer ble etablert fra Kreftsvulster av mage epitelceller. Mindre dette er spesielt angitt, ble cellene dyrket i RPMI 1640 medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C med 5% CO 2, og 95% fuktighet. For farmakologiske demetylering, ble cellene behandlet med 5 mikrometer 5-aza-2'-deoxycytidine (AZA) (Sigma, St. Louis, MO, USA) i tre dager på rad [21]. Aza var etterfylles hver 24. time. En ekvivalent konsentrasjon av bærer (DMSO) ble anvendt som kontroll. For de primære vev, ble de normale gastriske vev definert som ikke-betennelse og ikke-tumorvev. Alle magekarsinom vev er adenokarsinom vev. Total RNA og genomisk DNA ble ekstrahert ved bruk av Trizol reagens (Invitrogen) i overensstemmelse med produsentens instruksjoner.
Kvantitativ sanntids RT-PCR
revers transkripsjonsreaksjon ble utført ved anvendelse av 1 pg av total RNA med Reverse Transcription System (Promega, Madison , WI, USA). De mRNA uttrykk nivåer av CHD5 ble bestemt av kvantitativ real-time RT-PCR SYBR Grønn Master Mix Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Glyseraldehyd-3-phosohate dehydrogenase (GAPDH) ble anvendt som en intern kontroll RNA integritet. Primere som brukes til CHD5 RT-PCR ble CHD5-F: 5'-AGTTCCGTGTGAGGATGAAC og CHD5-R. Metylering spesifikk PCR (MSP) 5'-TCAAGGCTGACGTGTTCAAG
Metylering statusen CHD5 ble bestemt ved MSP hjelp bisulfat endret genomisk DNA som templat. Genomisk DNA var sulfitt behandlet med Zymo DNA Modification Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA) i henhold til protokollen gitt. MSP ble utført i 40 sykluser med glødetemperaturen ved 62 ° C, som tidligere beskrevet [22]. Metylering spesifikke primere var: CHD5M-F: 5'-GTTCGGGGTTTAGCGTTTTC (-525 til -506 i forhold til transkripsjon start stedet) og CHD5M-R: 5'-GAAACTTAACGAACCCGAACG (-438 til -418), og unmethylation spesifikke primere var: CHD5U-F: 5'-GGGTTTGGGGTTTAGTGTTTTT og CHD5U-R: 5'-TCAAAACTTAACAAACCCAAACA. Alle primere ble bekreftet tidligere for ikke å forsterke noen unbisulfited DNA
Bisulfite genomsekvensering (BGS)
Bisulfite behandlet DNA ble forsterket ved hjelp av BGS primere, CHD5-BF. 5'-GTTGTAAATTAGATTTATAGTTTT (-724 til -701) og CHD5-BR: 5'-GCAAATTAAAAAACTAATCCTAAA (-324 til -301). PCR-produktene ble renset med Illustra GFX ™ PCR og gel bandet rensing kit (GE Healthcare life science, Uppsala, Sverige) og klonet inn pCR4-TOPO vektor for sekvensering (Invitrogen). Minst 6 kolonier ble tilfeldig valgt for plasmid ekstraksjon og sekvensanalyse.
Konstruksjon av ekspresjonsplasmider CHD5
CHD5 ekspresjonsplasmid ble konstruert ved kloning av full-lengde CHD5 åpen leseramme inn i pattedyr-ekspresjonsvektor pcDNA3.1. Den CHD5 åpen leseramme ble forsterket fra normal mage cDNA ved hjelp av high fidelity PFU DNA polymerase (Invitrogen) og klonet inn pcDNA-TOPO4 (Invitrogen). Etter sekvensering validering, ble innsatsen subklonet inn pcDNA3.1 med restriksjonsenzymene Hind III og Xba I.
kolonidannelse assay
transient transfektert AGS celler med tom pcDNA3.1 eller pcDNA3.1-CHD5 ble anvendt for monolag kolonidannelse analysen. Celler ble dyrket over natten i en 12-brønns plate (1,0 x 10 5 /brønn) og transfekteres med pcDNA3.1 eller den CHD5-uttrykkende vektor ved å bruke lipofektamin ™ 2000 (Invitrogen). 48 timer senere ble transfektanter ble gjen sådd ut i triplikat og dyrket i 10-15 dager i fullstendig RPMI 1640 medium inneholdende G418 (400 ug /ml). Overlevende kolonier ble farget med Gentian Violet etter metanol fiksering og kolonier utover viss størrelse (≥ 50 celler) ble talt opp. Forsøkene ble gjentatt tre ganger.
Resultater
Nedregulering av CHD5 ekspresjon i magecancercellelinjer
ekspresjon av CHD5 i magecancercellelinjer ble bestemt ved kvantitativ RT-PCR. Mens CHD5 ble sterkt uttrykt i normal gastrisk vev, ble dens uttrykk nedregulert i alle 7 magecancercellelinjer (AGS, Kato III, MKN28, MKN45 og NCI-N87 SNU1 og SNU16) (fig. 1). Figur 1 CHD5 er nedregulert i mage kreft cellelinjer. Ekspresjonen av CHD5 i magecancercellelinjer ble bestemt ved RT-PCR. GAPDH ble anvendt for å normalisere CHD5 uttrykk. Den normale magevevet (magen) ble anvendt som referanse. Resultater av kvantitativ real-time RT-PCR ble vist i øvre panel og resultatet av konvensjonell RT-PCR ble vist i nedre panel.
Arrangøren hypermethylation av CHD5 i magekreft cellelinjer og primære magekarsinom vev, En typisk CpG Island (CGI) ble funnet rundt CHD5 exon 1 ved hjelp av følgende kriterier: GC innhold > 55%, ObsCpG /ExpCpG > 0,65 og lengde > 500 bp (fig 2A.). Metyleringen status for denne CGI i magekreftcellene ble bestemt ved metylering spesifikk PCR (MSP). Som vist på fig. 2B, full eller delvis metylering ble påvist i alle 7 mage kreft cellelinjer vi undersøkte. I overensstemmelse med dataene på gastriske cellelinjer, ble CHD5 promoteren også metylert i de fleste primære gastrisk karsinom vev som ble testet (73%, 11/15) (Fig. 2C). Viktigere, metylering av CHD5 arrangøren var enten uoppdaget eller svakt synlig i normalt vev som grenser til svulster i de samme pasientene og i mage vev av normale individer. Videre metylering av CHD5 promoter i magecancercellelinjer og gastrisk karsinom vev ble bekreftet ved sekvensering bisulfitt genomet (BGS) (fig. 2D). Til sammen ble CHD5 hovedsakelig brakt til taushet i magekreft og formidler hypermethylation syntes å være den viktigste mekanismen for CHD5 stanse i tumorigenesis av dette vevet. Figur 2 CHD5 promoteren hypermethylated i magekreft. A, CHD5 har en typisk CpG island (CGI) rundt sin ekson 1. CGI ble plottet av GeneTool program. Posisjonene til BGS og MSP primere ble angitt som piler. B, Metyleringen status av CHD5 promoter i magekreftcellene ble bestemt ved metylering spesifikk PCR. M: metylering; U: unmethylation. C, Metyleringen status av CHD5 promoter i primærmagekreft vev ble bestemt ved metylering spesifikk PCR som i B. Normal gastrisk vev og tilstøtende ikke-tumorvev ble anvendt som kontroller. N1 og N2 er normale gastrisk vev. T1 og T2 angir gastrisk karsinom vev mens A1 og A2 representerer tilstøtende ikke-tumorvev. Representert resultatene ble vist. D, metylering av CHD5 promoter i mage kreft cellelinjer og primære magekarsinom vev ble bekreftet av BGS. Hver sirkel indikerer en CpG stedet og sirkler fylt i svart representerer metylert CpG nettsteder. En rad med sirkler representerer en enkelt koloni.
Oppregulering av CHD5 uttrykk etter Aza behandling
For ytterligere å bekrefte promoter CGI hypermethylation-mediert CHD5 stanse i mage kreft cellelinjer, CHD5 uttrykk i AGS og Kato III før og etter demetylering reagent Aza behandling ble analysert. Begge cellelinjer utvise fullstendig metylering av CHD5 promoter. CHD5 ekspresjon i disse to cellelinjer ble signifikant økt etter Aza-indusert demetylering av CHD5 promoter (fig. 3A og 3B), og viste at CHD5 er faktisk epigenetiske dempet i magekreft. Figur 3 Farmakologisk demetylering reactivates CHD5 uttrykk i mage kreft cellelinjer. A, Relative CHD5 uttrykk før og etter Aza behandling ble bestemt ved RT-PCR som i fig. 1. GAPDH ble anvendt for å normalisere mal mengde. B, Demetylering av CHD5 promoter i AGS celler etter behandling Aza ble bekreftet ved BGS som i fig. 2D.
Vekst hemmende funksjon av CHD5
svulst undertrykkelse eiendom CHD5 i magekreftceller ble undersøkt av en gevinst-of-funksjon strategi. Fullstendig åpen leseramme (ORF) av CHD5 ble klonet i pattedyr-ekspresjonsvektoren pcDNA3.1. Effekten av ektopisk ekspresjon CHD5 på veksten av magekreftceller AGS ble bestemt med monolag kolonidannelse assay. Den tvungne ekspresjon av CHD5 i AGS-celler ble bekreftet ved RT-PCR (fig. 4A). Antallet kolonier dannet på platen ved hjelp av celler som over-uttrykker CHD5 ble signifikant redusert (p
< 0,01) (figur 4B og 4C.), Noe som indikerer at CHD5 kan undertrykke veksten av magekreftceller. Figur 4 CHD5 hemmer veksten av magekreft cellelinje AGS. Effekten av ektopisk CHD5 ekspresjon på tumorcellevekst ble undersøkt ved den monolaget kolonidannelse assay. A, CHD5 ekspresjon i AGS-celler etter transfeksjon ble bestemt ved RT-PCR. Fotografiet av kolonier dannet av AGS celler transfektert med pcDNA3.1 (vektor) eller pcDNA3.1-CHD5 (CHD5) ble vist i B. C, kvantitative analyser av koloni tall er vist som verdier av gjennomsnitt ± standardavvik. P
verdier ble beregnet ved hjelp av t-test. Stjernen indikerer statistisk signifikant forskjell (p
< 0,01).
Diskusjon
I løpet av de siste årene, har mange TSGs blitt funnet å være epigenetiske inaktivert i magekreft, noe som indikerer at epigenetisk stanse av TSGs er en av store molekylære endringer i prosessen av mave karsinogenese [22-25]. I denne studien ble CHD5 identifisert som en annen potensiell TSG som epigenetisk inaktivering kan bidra til magekreftutvikling. Det ble ofte nedregulert gjennom promoter hypermethylation i mage kreft cellelinjer. Ektopisk ekspresjon av CHD5 førte til vekst inhibisjon av mage kreft celler, noe som indikerer at CHD5 fungerer som en TSG epigenetiske stilnet i magekreft.
Promoter hypermethylation av CHD5 i kreft er blitt observert i andre krefttyper [17, 20]. Imidlertid var forekomsten av CHD5 promoter metylering i magecancercellelinjer og tumorer funnet i denne studie for å være relativt høy, sammenlignet med hyppigheten av CHD5 metylering i andre kreftformer (som regel under 20%) [17, 20]. Selvfølgelig bør flere prøver brukes for å bekrefte dette resultatet med de samme primerne MSP i de følgende studier. Likevel tyder våre funn at CHD5 inaktivering kan være mediert av ulike mekanismer i ulike vev. Mens CHD5 inaktiveres gjennom kopiantall abnormitet i ulike kreft [15, 16], komparativ genomisk hybridisering (CGH) indikerte at 1p36, den CHD5 inneholder genet locus, ikke er betydelig ubalanse i mage kreft [26]. I stedet, som vist i denne studien, synes CHD5 å bli brakt til taushet hovedsakelig av arrangøren hypermethylation i magekreft.
Det er økende bevis for at hypermethylation av TSG arrangøren representerer en av de store molekylære endringer i kreftutvikling. Den høye forekomsten av CHD5 promoter hypermethylation i magekreft kan utforskes ikke bare som et magekreftdiagnose, men også prognose anslag. For å oppnå dette, er det viktig å karakterisere CHD5 promoteren metylering i forbindelse med kliniske egenskaper, slik som alder, kjønn, H. pylori-infeksjon, tumor karakter, Lauren klassifisering og differensiering. Gitt at den høye heterogenitet av primære magekarsinom vev, analyser metylering med høyere oppløsning som kvantitativ metylering spesifikk analyse ved hjelp sequenom eller Taqman real-time PCR vil være nyttig å vurdere om CHD5 promoter metylering er nyttig for tidlig diagnose av kreft mage og prognose prediksjon.
Selv om arrangøren metylering ofte inaktiverer CHD5 i mage kreft cellelinjer, kan vi ikke utelukke tilstedeværelse av andre mekanismer for tapet funksjon CHD5 i magekreft. CHD5 uttrykk er ekstremt lav i MKN28 og SNU16 (Fig. 1), men arrangøren av CHD5 var bare delvis metylert i disse to cellelinjer (Fig. 2B), noe som indikerer at andre mekanismer kan være ansvarlig for å stanse all CHD5 i noen av magekreft cellelinjer.
Konklusjon
CHD5 var ofte nedregulert gjennom promoter hypermethylation i magekreftceller. Ektopisk uttrykk for CHD5 ført til veksthemming av magekreftceller, noe som indikerer at CHD5 fungerer som en tumor suppressor gen epigenetiske forstummet i magekreft.
Erklæringer
Takk
Vi takker Dr Hongchuan Jin (Biomedical Research Center, Sir Run Run Shaw Hospital, Zhejiang University) for hans uvurderlige råd og teknisk støtte. Arbeidet er beskrevet i denne artikkelen ble delvis støttet av en bevilgning fra Stipend Council of Hong Kong Special Administrative Region, Kina (prosjekt nr CityU 160508).
Forfatternes opprinnelige innsendte filer for Images Nedenfor er de linker til forfatternes originale innsendte filer for bilder. 12929_2009_95_MOESM1_ESM.jpeg Forfatteroriginalfilen for figur 1 12929_2009_95_MOESM2_ESM.jpeg Forfatteroriginalfilen for figur 2 12929_2009_95_MOESM3_ESM.jpeg Forfatteroriginalfilen for figur 3 12929_2009_95_MOESM4_ESM.jpeg Forfatteroriginalfilen for figur 4 Konkurrerende interesser
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende interesser.

• Den prognostiske virkningen av epidermal vekstfaktor-reseptor hos pasienter med metastatisk kreft i mage
• Laparoskopisk justerbar bøyle Roux-en-y gastrisk bypass som en primær prosedyre for super-super-overvektige (kroppsmasseindeks > 60 kg /m2)