CHD5 žemyn reguliuojama per promotoriaus hypermethylation skrandžio cancer

CHD5 žemyn reguliuojama per promotoriaus hypermethylation skrandžio vėžio
tezės
Background pervežimas Nonhistone chromosomų baltymų kartu su Histonas vaidina svarbų vaidmenį replikacijos ir remonto DNR ir genų ekspresijos reguliavimo. Šių baltymų reguliavimą gali prisidėti prie daugelio ligų, tokių kaip vėžys įvairovei. Kaip nonhistone chromosomų baltymų, chromodomain helikazė DNR surišantis baltymas 5 (CHD5) neseniai buvo įvardyta kaip romano auglio slopinamojo geno (GTG) produkto, skatinant p19 INK4a parsisiųsti ir P16 ARF transkripciją
. Iš CHD5 inaktyvacijai buvo pasiektas dalinai genetinės ištrynimą, nes ji yra įsikūrusi 1p36, regionas dažnai ištrintas žmogaus navikų. Šiame tyrime mes siekiame ištirti CHD5 dalyvavimą skrandžio vėžys, antra labiausiai paplitusi vėžio visame pasaulyje.
Metodai
CHD5 ekspresiją skrandžio vėžio ląstelių skydelyje lėmė kiekybinio RT-PGR. Iš CHD5 metilinimas buvo įvertintas metilinimo specifinis PGR ir bisulfito genomo sekos. Iš CHD5 poveikis augimui skrandžio vėžio ląsteles, buvo išbandyti kolonija formavimo metodu.
Rezultatai
CHD5 išraiška buvo žemyn reguliuojama visi skrandžio vėžio ląstelių linijų naudojamas (100%, 7/7) ir žymiai atkurta po farmakologinis demetilinimu. Metilinimo CHD5 promotoriaus buvo aptikta visi iš septynių skrandžio vėžio ląstelių linijų ir pirminius skrandžio karcinoma audinių tirtų (73%, 11/15). Galiausiai, negimdinis išraiška CHD5 skrandžio vėžio ląstelių atvedė į didelę augimo slopinimą.
Išvada
CHD5 buvo GTG epigenetically žemyn reguliuoja skrandžio vėžio.
Faktai
Visi eukariotinių organizmų sukūrė įmantrius būdus pakuočių DNR į chromatino per dinaminės sąveikos įvairiose DNR susijusių baltymų. Tokioje pakuotėje yra ne tik svarbus genetinės informacijos su aukštos ištikimybės ir sąžiningumo, bet ir genetinės informacijos perdavimo iš DNR į RNR sandariai kontroliuojamu būdu saugoti. Baltymai, kurie jungiasi prie DNR suformuoti chromatiną yra tradiciškai suskirstyta į dvi pagrindines klases: Histonas ir nonhistone chromosomų baltymų. Histonas esame labai konservatyvios DNR surišančių baltymų grupė, ir jų įvairių potransliacinis modifikacijos sudaro "Histonas kodą", padedanti nustatyti DNR arba chromatino remodeling pakuotę. Histono kodas inicijuojamas, prižiūrimi ir aiškinama daugiausia nonhistone chromosomų baltymų [1-4]. Pavyzdžiui, lizino likučius acetilinimo ant Histonas uodegas pagal Histonas acetyltransferases (skrybėlės) neutralizuoja savo krūvį ir sumažina Histonas su DNR pažiūras, todėl DNR prieinama transkripcijos veiksnių inicijuoti genų transkripciją. Priešingai, šių likučių pagal Histonas deacetilazių (HDACs) deacetilinant atstato šį trauka ir gali atsiimti DNR nuo transkripcijos mašinų [5]. Be to, acetilinimo, fosforilinimo bei metilinimo iš Histonas uodegos yra svarbu, kad dinaminio asociacijos DNR su transkripcijos mašinos ir kitos chromosomų baltymų [6-8]. Nonhistone chromosomų baltymai vaidina svarbų vaidmenį į Histonas kodas aiškinimo formuojant chromatino rekonstruoti kompleksus. Abu Histonas ir nonhistone chromosomų baltymai yra svarbūs genų ekspresiją, DNR replikacijos ir DNR reparacijos reglamentą. Į saviraiškos ir veiklos šių baltymų deregulations gali sukelti ligų, tokių kaip vėžys [9-13] įvairovė plėtrai.
Neseniai atliktą tyrimą, chromodomain helikazė DNR surišantis baltymas 5 (CHD5) buvo nustatyta kaip romanas navikas slopintuvas genų (GTG) pagal neuroblastoma [14]. CHD5 priklauso SWI2 /SNF2 susijusių ATPases superfamily viena pagrindinių grupės nonhistone chromosomų baltymų. CHD5 koduoja unikalios funkcinių sričių, sudarytas iš dviejų N-galinių chromodomains, po to SWI2 /SNF2-kaip ATPazės /helikazės domeno ir DNR surišantis domenas [14]. Reguliuojant chromatino struktūrą, CHD5 gali skatinti p19 išraišką ARF, kad funkcijos stabilizuoti p53, naviko slopintuvas inaktyvuotų daugiau nei pusė žmogaus vėžio [15]. CHD5 yra nuo genų lokusas (1p36.31) ištrynė maždaug 35% nuo neuroblastoma [16]. CHD5 anksčiau buvo manoma, kad būti konkrečiai išreikštas nervų sistemą, tačiau jos vaidmuo vėžio kituose audiniuose pradeda ryškėti [17]. CHD5 genas buvo nustatyta gerokai ištrintas glioma [18]. Be geną, CHD5 gali būti slopinamas kitų mechanizmų. Kai kuriose neuroblastoma atvejais, yra įrodymų, kad CHD5 išraiška epigenetically numalšino promotoriaus hypermethylation [19], nors šis pastebėjimas nebuvo patvirtintas kitą tyrimą [20]. Neseniai, buvo nustatyta, kad CHD5 promotorius turi būti metilinti mažų pogrupių krūties (4,4%), storosios žarnos (10%), kiaušidžių (15%) ir glioma (17%) navikų [17, 20], o tai rodo Epigenetiniai nutildymo iš CHD5 metilinimo gali žaisti dalinį vaidmenį tumorigenezei šių audinių. Čia mes nustatėme, kad, priešingai nei kitų rūšių vėžį iki šiol pranešta, CHD5 buvo dažnai hypermethylated skrandžio vėžiu (73% navikų ir 100% ląstelių linijų). Negimdinis išraiška CHD5 skrandžio vėžio ląstelių lėmė didelį augimo slopinimo. Tai ryškus koreliacija su epigenetinio slopinimo CHD5 ir skrandžio vėžio siūlo anksčiau nežinomų ryšį tarp šio GTG ir skrandžio Tumorigenesis.
Metodai
audinių kultūroje ir RNR /DNR ekstrakcija
Visi skrandžio vėžio ląstelių linijų (AGS, Kato III MKN28, MKN45, SNU1, SNU16 ir NVI-N87) buvo gauti iš Riken Gene banko (Tsukuba, Ibaraki, Japonija) ir American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Visų vėžio ląstelių linijos buvo nustatytas nuo karcinoma skrandžio epitelinių ląstelių. Nebent konkrečiai nurodyta, ląstelės buvo auginamos RPMI 1640 terpės (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), papildytoje su 10% vaisiaus galvijų serumo, 37 ° C temperatūroje su 5% CO 2, ir 95% drėgnumo. Dėl farmakologinio demetilinant, ląstelės buvo gydomi 5 mkm 5-aza-2'-deoksicitidino (AZA) (Sigma, St Louis, MO, JAV) tris dienas iš eilės [21]. Aza buvo papildytas kas 24 valandas. Ekvivalentiškas kiekis transporto priemonės (DMSO) buvo naudojamas kaip kontrolės. Pirminių audinių, įprasti skrandžio audiniai buvo apibrėžiamas kaip ne-uždegimo ir ne-navikų audiniuose. Visi skrandžio karcinomos audiniai yra adenokarcinoma audiniai. Iš viso RNR ir genomo DNR buvo išskirta naudojant Trizol reagento (Invitrogen) pagal gamintojo nurodymus.
Kiekybinis realiu laiku RT-PGR
atvirkštinės transkripcijos reakcija buvo atliekama naudojant 1 mikrogramų visos RNR su atvirkštinės transkripcijos sistemos (PROMEGA, Madison , WI, JAV). MRNR ekspresijos lygiai CHD5 lėmė kiekybinio realaus laiko PGR SYBR Žalioji magistras Mix Kit (Applied Biosystems Foster City, Kalifornija, JAV). Gliceraldehido-3-phosohate dehidrogenazės (GAPDH) buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės RNR vientisumą. Gruntai naudojami CHD5 RT-PGR buvo CHD5-F 5'-AGTTCCGTGTGAGGATGAAC ir CHD5-R. 5'-TCAAGGCTGACGTGTTCAAG
Metilinimas specifinis PGR (JEP)
metilinimo statuso CHD5 lėmė JEP naudojant vandenilio sulfatu keistas Genomo DNR kaip šabloną. Genomo DNR buvo bisulfito gydomi Zymo DNR modifikacija Kit (Zymo tyrimų, Orange, CA, JAV) pagal numatyto protokolo. MSP buvo atlikta 40 ciklų su atkaitinimo temperatūra 62 ° C, kaip buvo aprašyta anksčiau [22]. Metilinimas-specifinius pradmenis buvo: CHD5M-F 5'-GTTCGGGGTTTAGCGTTTTC (nuo -525 iki -506 palyginti su transkripcijos starto vietoje) ir CHD5M-R 5'-GAAACTTAACGAACCCGAACG (nuo -438 iki -418), o unmethylation konkrečių pradmenys buvo: CHD5U-F 5'-GGGTTTGGGGTTTAGTGTTTTT ir CHD5U-R 5'-TCAAAACTTAACAAACCCAAACA. Visi gruntai anksčiau buvo patvirtinta ne stiprintuvo jokio unbisulfited DNR
bisulfite genomo iššifravimas (BGS)
bisulfite gydytų DNR buvo papildyta naudojant BGS pradmenis, CHD5-BF:. 5'-GTTGTAAATTAGATTTATAGTTTT (nuo -724 iki -701) ir CHD5-BR: 5'-GCAAATTAAAAAACTAATCCTAAA (nuo -324 iki -301). PGR produktai buvo išvalytas su ILLUSTRA GFX ™ PGR ir gelio juostos valymo rinkinys (GE Healthcare "gyvenimo mokslas, Uppsala, Švedija) ir klonuotas į pCR4-TOPO vektoriaus sekos (Invitrogen). Bent 6 kolonijos buvo atsitiktinai parinkti plazmidžių gavybos ir sekos analizei.
Statyba CHD5 plazmidės
CHD5 išraiška plazmidės buvo apskaičiuota klonavimas pilnametražis CHD5 atviras skaitymo rėmelis į žinduolių išraiška vektoriaus pcDNA3.1. CHD5 atviras skaitymo rėmelis sustiprino įprasto skrandžio kDNR naudojant aukštos ištikimybės PFU DNR polimerazės (Invitrogen) ir klonuotas į pcDNR-TOPO4 (Invitrogen). Po sekos patvirtinimo, įdėklas buvo subklonuotas į pcDNA3.1 su restrikcijos fermentais Hind III ir Xba I.
kolonija formavimas tyrimas
laikinai perkeltų AGS ląsteles su tuščiu pcDNA3.1 ar pcDNA3.1-CHD5 buvo naudojami monosluoksnio kolonija formavimas tyrimas. Ląstelės buvo auginamos per naktį 12 šulinėlių plokštelės (1,0 × 10 5 /gerai) ir perkeltų su pcDNA3.1 arba CHD5 ekspresija vektoriaus naudojant lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen). po 48 valandų, transfectants buvo pakartotinai padengtą tris kartus ir kultivuojamos 10-15 dienų visiškai RPMI1640 terpę, turinčią G418 (400 mikrogramų /ml). Išlikę kolonijos buvo tamsintas su gencijonų Violetinė po buvo skaičiuojami metanolis burna ir kolonijos viršija tam tikrą dydį (≥ 50 kameros). Eksperimentai buvo pakartoti tris kartus.
Rezultatai
Dauno-reguliavimo CHD5 išraiškos skrandžio vėžio ląstelių linijų
iš CHD5 išraiška skrandžio vėžio ląstelių linijų buvo nustatomas pagal kiekybinės RT-PGR. Nors CHD5 buvo labai išreikštas įprastais skrandžio audinių, jos išraiška buvo žemyn reguliuojama visose 7 skrandžio vėžio ląstelių linijų (AGS, Kato III, MKN28, MKN45 ir NVI-N87 SNU1 ir SNU16) (1 pav.). 1 pav CHD5 yra žemyn reguliuojama skrandžio vėžio ląstelių linijas. Iš CHD5 išraiška skrandžio vėžio ląstelių linijų buvo nustatomas pagal RT-PGR. GAPDH buvo naudojamas normalizuoti CHD5 išraiška. Normalioji skrandžio audinio (skrandžio) buvo naudojamas kaip nuoroda. Rezultatai kiekybinių realaus laiko AT-PGR buvo parodyta viršutiniame skydelyje ir tradicinių RT-PGR rezultatas buvo parodyta apatiniame skydelyje.
Rėmėjas hypermethylation iš CHD5 skrandžio vėžio ląstelių linijų ir pirminių skrandžio karcinoma audinių
Tipiškas CpG sala (CGI) buvo rastas aplink CHD5 egzono 1 taikant šiuos kriterijus: GC kiekis > 55% ObsCpG /ExpCpG > 0,65, o ilgis > 500 BP (2A pav.). Metilinimo statusas šio CGI skrandžio vėžio ląstelių buvo nustatomas pagal metilinimo specifinis PGR (MSP). Kaip parodyta Fig. 2B, visiškas arba dalinis metilinimas buvo aptiktas visas 7 skrandžio vėžio ląstelių linijų Mes išnagrinėjome. Pastovų su duomenimis apie skrandžio ląstelių linijose CHD5 promotorius taip pat buvo metilinti tirtų pirminis skrandžio karcinoma audinių dauguma (73%, 11/15) (pav. 2C). Svarbu tai, kad metilinimas iš CHD5 rengėjas buvo arba nenustatomas ar silpnai aptinkamas sveikų audinių, esančių prie tų pačių pacientų navikai ir skrandžio audinių sveikų. Be to, metilinimo CHD5 promotoriaus skrandžio vėžio ląstelių linijų ir skrandžio karcinoma audinių buvo patvirtinta bisulfito genomo sekos (BGS) (pav. 2D). Kartu paėmus, CHD5 buvo daugiausia nutildė skrandžio vėžio ir propaguotojas hypermethylation pasirodė pagrindinis mechanizmas CHD5 slopinimo į Tumorigenesis šio audinio. 2 pav CHD5 rengėjas yra hypermethylated skrandžio vėžio. A CHD5 turi tipišką CPG sala (CGI) aplink savo Exon 1. CGI buvo akceleracija iki GeneTool programą. Į BGS ir JEP gruntų pozicijos buvo nurodyta kaip strėlių. B, metilinimas statusas CHD5 promotoriaus skrandžio vėžio ląstelių buvo nustatomas pagal metilinimo konkretaus PGR. M: metilinimas; U: unmethylation. C, metilinimas statusas CHD5 promotoriaus pirminių skrandžio vėžio audiniuose buvo nustatomas pagal metilinimo konkretaus PGR kaip B. Normalus skrandžio audinių ir gretimų ne-navikų audiniuose, buvo naudojami kaip kontrolės. N1 ir N2 yra normalus skrandžio audiniai. T1 ir T2 rodo skrandžio karcinoma audinius, o A1 ir A2 atstovauti gretimų ne navikų audiniuose. Reprezentacinis rezultatai buvo parodyta. D metilinimo CHD5 promotoriaus skrandžio vėžio ląstelių linijų ir pirminių skrandžio karcinoma audiniuose buvo patvirtinta BGS. Kiekvienas ratas rodo vienas CpG svetainė ir apskritimai užpildyti juodos spalvos atstovauja denatūruotas CpG svetainėse. Vienas eilė ratą sudaro vieną koloniją.
Iki-reguliavimo CHD5 išraiškos po AZA gydymo
toliau patvirtinti rengėjas CGI hypermethylation tarpininkaujant CHD5 nutildymo skrandžio vėžio ląstelių linijas, CHD5 posakių AGS ir Kato III prieš ir po demetilinimu reagentu buvo analizuojami Aza gydymas. Abu ląstelių linijas demonstruoja visišką metilinimas dėl CHD5 rengėjas. CHD5 raiška šių dviejų ląstelių linijų buvo žymiai padidėjo po Aza sukeltos demetilinant iš CHD5 promotoriaus (. 3A ir 3B pav), o tai rodo, kad CHD5 iš tiesų epigenetically nutildė skrandžio vėžio. 3 pav Farmakologinis demetilinimu reactivates CHD5 išraišką skrandžio vėžio ląstelių linijas. A, Santykinės CHD5 išraiškos prieš ir po to, kai Aza gydymas buvo nustatomas pagal RT-PGR kaip pav. 1. GAPDH buvo naudojamas normalizuoti šablono sumą. B, demetilinimas CHD5 promotoriaus AGS ląstelių po aza gydymo buvo patvirtinta BGS kaip pav. 2d.
Augimo slopinimas funkcija CHD5
navikas slopinimo turto CHD5 skrandžio vėžio ląstelių tyrė pelnas-of-funkcija strategiją. Visas atviras skaitymo rėmelis (ORF) dėl CHD5 buvo klonuotas į žinduolių išraiška vektoriaus pcDNA3.1. Negimdinio CHD5 išraiškos poveikis skrandžio vėžio ląstelių AGS augimo buvo nustatomas su monosluoksnio kolonija formavimo metodu. Priverstinis išraiška CHD5 į AGS ląstelių buvo patvirtinta RT-PCR (pav. 4A). Kolonijų, formuojant jas ant plokštelės ląstelių per išreiškiančias, iš CHD5 skaičius buvo žymiai sumažėjo (p
< 0,01) (pav 4B ir 4C.), Nurodant, kad CHD5 gali slopinti skrandžio vėžio ląstelių augimą. 4 pav CHD5 slopina augimą skrandžio vėžio ląstelių linijos AGS. Negimdinio CHD5 išraiškos poveikis naviko ląstelių augimas buvo tiriama pagal monosluoksniui kolonijos formavimo metodu. A, CHD5 išraiška AGS ląstelių po transfekciją buvo nustatomas pagal RT-PGR. Kolonijų suformuotų AGS ląstelių transfektuotose pcDNA3.1 (vektorių) arba pcDNA3.1-CHD5 (CHD5) nuotrauka buvo parodyta B C Kiekybinė analizė kolonijas numeriais rodomi kaip vertybių vidurkis ir standartinis nukrypimas. P
vertės apskaičiuotos naudojant Stjudento t testą. Žvaigždute rodo statistinį reikšmingo skirtumo (p
< 0,01).
Diskusijų
per pastaruosius kelerius metus, daugelis GTG buvo nustatyta, kad epigenetically inaktyvuota skrandžio vėžiu, rodo, kad epigenetinius triukšmo slopinimo ir GTG yra vienas pagrindinių molekulinių pokyčių skrandžio kancerogenezėje [22-25] procese. Šiame tyrime CHD5 buvo įvardytas kaip kitas potencialus GTG kurio epigenetinius inaktyvacijai gali prisidėti prie skrandžio kancerogenezėje. Jis buvo dažnai žemyn reguliuojama promotoriaus hypermethylation skrandžio vėžio ląstelių linijas. Negimdinis išraiška CHD5 lėmė augimo slopinimą skrandžio vėžio ląsteles, nurodant, kad CHD5 veikia kaip GTG epigenetically nutildė skrandžio vėžio.
Rėmėjas hypermethylation iš CHD5 į vėžio buvo pastebėtas kitų vėžio [17, 20]. Tačiau CHD5 promotoriaus metilinimo skrandžio vėžio ląstelių linijų ir navikų dažnis buvo nustatyta, šiame tyrime galima santykinai dideli, palyginti su CHD5 metilinimo kitose vėžio (paprastai sudaro mažiau nei 20%) [17, 20] dažnį. Žinoma, daugiau mėginiai turi būti naudojamas patvirtinti šį rezultatą su tais pačiais MSP praimeriai į šiuos tyrimus. Vis dėlto, mūsų išvada rodo, kad CHD5 inaktyvacija gali būti susijęs su įvairių mechanizmų skirtingų audinių. Kadangi CHD5 yra inaktyvuotas per kopijų skaičiumi sutrikimo įvairių vėžio [15, 16], lyginamoji genomo hibridizacijos (CGH) nurodė, kad 1p36, The CHD5 turinčių genų lokusas yra žymiai subalansuotas skrandžio vėžio [26]. Vietoj to, kaip parodyta šiame tyrime CHD5 atrodo nutildyti daugiausia iki promotoriaus hypermethylation skrandžio vėžio.
Daugėja įrodymų, kad hypermethylation TSG rengėjas yra vienas iš pagrindinių molekulinių pokyčių vėžio vystymąsi. Aukšto dažnis CHD5 promotoriaus hypermethylation skrandžio vėžys gali būti ištirta ne tik kaip skrandžio vėžio diagnozę, bet ir prognozavimas prognozavimas. Siekiant šio tikslo, svarbu apibūdinti CHD5 promotorių metilinimas kartu su klinikinių charakteristikų, tokių kaip amžius, lytis, H. pylori infekcija, naviko laipsnio, Lauren klasifikavimo ir diferenciacijos. Atsižvelgiant į tai, kad aukštos heterogeniškumas pirminių skrandžio karcinoma audinių, metilinimas analizuoja su didesne skiriamąja geba, pavyzdžiui, kiekybinis metilinimo specifinę analizę, naudojant sequenom arba TaqMan realiojo laiko PGR bus naudinga įvertinti, ar CHD5 rengėjas metilinimas yra naudinga pradžioje skrandžio vėžio nustatymo ir prognozavimo prognozavimas.
Nors rengėjas metilinimas dažnai išjungia CHD5 skrandžio vėžio ląstelių linijas, mes negalime atmesti kitų mechanizmų buvimą už nuostolius funkciją CHD5 skrandžio vėžio. CHD5 išraiška yra labai mažai MKN28 ir SNU16 (1 pav.), Tačiau CHD5 rengėjas buvo tik iš dalies metilo šių dviejų ląstelių linijas (2b pav.) Rodo, kad kiti mechanizmai gali būti atsakingas už CHD5 nuslopinami kai kuriose skrandžio vėžio ląstelių linijas.
Išvada
CHD5 buvo dažnai žemyn reguliuojama promotoriaus hypermethylation skrandžio vėžio ląsteles. Negimdinis išraiška CHD5 lėmė augimo slopinimo skrandžio vėžio ląsteles, nurodant, kad CHD5 veikia kaip naviko slopinamojo geno epigenetically nutildė skrandžio vėžio.
Deklaracijas
Padėka
dėkojame dr Hongchuan Jin (Biomedicininių tyrimų centras, seras Runrun Šou ligoninė, Zhejiang universiteto) už savo neįkainojamą konsultacijas ir techninę paramą. Aprašyta šiame dokumente darbas buvo iš dalies remiama dotacijos iš mokslinių tyrimų stipendijų tarybos Honkongo specialusis administracinis regionas, Kinija (projektas Nr CityU 160508).
Autorių originalios pateikti failai vaizdų
Žemiau yra nuorodos į autorių originalių pateiktų failų vaizdų. 12929_2009_95_MOESM1_ESM.jpeg Autorių originalus failas 1 pav 12929_2009_95_MOESM2_ESM.jpeg Autorių originalaus failo 2 pav 12929_2009_95_MOESM3_ESM.jpeg Autorių originalios 3 pav 12929_2009_95_MOESM4_ESM.jpeg Autorių originalaus failo 4 pav konkuruojančių interesų Viesbutis The autoriai deklaruoja, kad jie neturi konkuruojančius interesus.

• Prognostinę poveikis epidermio augimo faktoriaus receptoriaus pacientams, sergantiems skrandžio vėžiui
• Laparoskopinė reguliuojamas surištas Roux-en-Y skrandžio šuntavimo kaip pagrindinis procedūra super super nutukę (KMI > 60 kg /m2)