Identificação de assinaturas proteoma séricos de câncer gástrico localmente avançado e metastático: um estudo piloto

Identificação de assinaturas proteoma séricos de câncer gástrico localmente avançado e metastático: um estudo piloto da arte abstracta
Fundo
O câncer gástrico é um dos tipo de câncer mais comum e mortal, em todo o mundo. O desenvolvimento assintomática inicial e outros sintomas não específicos resultar em diagnóstico na fase avançada, com mau prognóstico. No entanto, não clinicamente biomarcadores úteis estão disponíveis para esta malignidade, e endoscopia gastrointestinal invasiva continua a ser a única opção confiável no momento. Deste modo, existe uma necessidade para a descoberta de ferramenta de diagnóstico e /ou prognóstico não invasiva clinicamente útil como uma alternativa (ou complementar) para ferramentas de diagnóstico actuais. Aqui nós teve como objetivo procurar proteínas séricas característicos de câncer gástrico local e invasiva
Métodos
amostras de sangue pré-tratamento foram coletadas de pacientes com adenocarcinoma gástrico diagnosticado no estágio diferente da doença:. 35 pacientes com câncer localmente avançado e 18 pacientes com câncer metastático; 50 doadores saudáveis ​​também foram incluídos como grupo de controle. A fração-baixo peso molecular de proteoma do soro (ou seja, peptidoma endógena) foi perfilado pela espectrometria de massa MALDI-TOF, e toda a componentes proteoma foram identificados e quantificados pela abordagem shotgun LC-MS /MS.
Resultados
assinaturas peptidoma multicomponentes foram revelados que permitiu boa discriminação entre controles saudáveis ​​e pacientes com câncer, bem como entre os pacientes com câncer localmente avançado e metastático. Além disso, uma abordagem de LC-MS /MS revelou 49 proteínas do soro com diferentes abundâncias entre dadores saudáveis ​​e de doentes com cancro (predominantemente proteínas associadas com a inflamação e resposta de fase aguda). Além disso, 19 proteínas do soro com diferentes abundâncias entre pacientes com câncer localmente avançado e metastático foram identificados (incluindo proteínas associadas com a citocina de resposta /quimiocinas e metabolismo de ácidos nucléicos). No entanto, nem peptidoma perfis nem espingarda proteômica abordagem permitiu detectar componentes do soro discriminar entre dois subgrupos de pacientes com doença local que seja desenvolvido ou não desenvolveram metástases durante o acompanhamento.
Conclusões
As diferenças moleculares entre localmente avançado e metastático câncer gástrico, bem como as diferenças mais óbvias entre indivíduos saudáveis ​​e pacientes com câncer, marcaram a reflexão ao nível do proteoma do soro. No entanto, não temos nenhuma evidência de que as características de pré-tratamento proteoma do soro poderia prever um risco de disseminação do câncer em pacientes tratados devido à doença local. No entanto, apresentou dados confirmou o potencial aplicabilidade de um biomarcador baseado em assinaturas proteoma do soro no diagnóstico de câncer gástrico.
Palavras-chave
O câncer de estômago O diagnóstico precoce Neoplasias Proteomics Biológica marcadores fundo
O câncer gástrico é o quarto tipo de câncer mais comum eo segunda principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. Esse tipo de câncer especialmente aflige as populações do leste da Ásia, Europa Oriental e partes da América Central e do Sul, ea taxa de morbidade é duas vezes maior para homens do que para as mulheres [1]. O tumor está associado com sintomas inespecíficos ou desenvolvimento ainda assintomática em seus estágios iniciais, que muitas vezes resulta em diagnóstico em estágios avançados. Estágio do câncer gástrico correlaciona fortemente com mau prognóstico. De acordo com o relatório do National Cancer Data Base, a taxa de sobrevida em 5 anos para IA fase foi de 78% e caiu substancialmente em cada fase para cerca de 7% para pacientes diagnosticados com doença em estágio IIIB ou estágio IV [2]. Assim, o diagnóstico precoce do câncer gástrico pode aumentar radicalmente a eficácia do tratamento e melhorar o prognóstico para esta doença fatal. Actualmente, a ferramenta de diagnóstico mais eficiente para a detecção de cancro gástrico permanece uma endoscopia gastrointestinal, no entanto, esta técnica invasiva não é adequado para o rastreio em larga escala. Infelizmente, não há biomarcadores não invasivos alternativos disponíveis, pois os marcadores de tumor gastrointestinal comumente usados ​​como CEA, CA 19-9 ou CA 72-4 são insuficientes para o diagnóstico precoce de cancro este, devido à sua baixa sensibilidade e especificidade (20-30 %) [3-5]. Maioria dos casos de câncer gástrico (acima de 90%) são classificados como adenocarcinomas. Mais recentemente quatro subtipos moleculares de adenocarcinoma gástrico foram distinguidos com base no perfil genômico entregues graças ao projeto Cancer Genome Atlas [6]. No entanto, o conhecimento sobre a heterogeneidade molecular e biologia desse tipo de câncer, incluindo o seu desenvolvimento e mecanismos de progressão, continua a ser bastante limitado ainda. Por isso, uma necessidade urgente de identificação de biomarcadores clinicamente relevantes refere-se não só o diagnóstico precoce, mas também o prognóstico e predição dos resultados do tratamento.
Proteômica clínica é uma abordagem importante para a descoberta de biomarcadores de câncer gástrico [7]. É geralmente aceite que proteoma sangue é uma promissora fonte de novos biomarcadores de cancro, incluindo este marcadores particularmente valiosos para a detecção precoce da doença e monitorização da resposta ao tratamento [8]. Massa baseada em perfis de espectrometria de uma fracção de baixo peso molecular do proteoma do soro, assim chamado peptidoma endógena, revelou multi-assinaturas de péptidos com potencial aplicabilidade em diagnóstico e classificação de diferentes tipos de cancro [9-13]. Alguns trabalhos foram publicados que explorou MALDI /profiling-base SELDI de petidome soro /plasma para o diagnóstico de câncer gástrico, que propôs assinaturas de peptídeos que permitiram discriminar os doadores saudáveis ​​e pacientes com câncer gástrico, ou assinaturas associadas com um curso de uma doença [ ,,,0],14-22]. Vários componentes de tais assinaturas foram ainda identificados como fragmentos de KNG1 [18], e APOC1 APOA2 [19], AEA [20], e TBB5 TYB4 [22] ou FIBA ​​[23, 24]. Mais recentemente, um painel de biomarcadores compostas por proteínas do soro pré-seleccionados com base no modelo do rato pré-clínica (afamin, clusterina, VDBP e haptoglobina) foi validado para discriminar entre doentes com cancro gástrico e paciente com doenças gástricas benignas [25]. No entanto, nenhuma das propostas assinaturas proteoma séricos de câncer gástrico tem sido amplamente aceito e aplicado na prática clínica ainda.
Aqui nós teve como objetivo caracterizar características proteoma de soro pré-tratamento associado com o risco de metástase do câncer gástrico. Foram realizados dois tipos de análises proteomic: (1) uma fracção de baixo peso molecular do proteoma soro foi perfilado pela espectrometria de massa MALDI-TOF, (2) foram identificados e quantificados por LC-MS /MS após digestão inteiros os componentes do proteoma com (a abordagem "proteômica shotgun") tripsina. Grupos de pacientes não tratados previamente com câncer gástrico localmente avançado e doença metastática foram inscritos a este estudo (um grupo combinado de indivíduos saudáveis ​​foi analisada como uma referência); tais proteomic análise abrangente foi realizada em um grupo de pacientes caucasianos com cancro gástrico para a primeira vez. assinatura proteoma do soro que diferenciou entre os pacientes com câncer localmente avançado e metastático foi detectado neste estudo piloto, ainda recursos específicos para pacientes com doença localmente avançada no momento do diagnóstico que metástases, eventualmente desenvolvidos não foram observadas nesse nível.
Métodos
Características dos grupos de pacientes
Cinquenta e três pacientes com adenocarcinoma gástrico comprovada por biópsia não previamente tratados foram qualificados para este estudo: 35 pacientes com câncer localmente avançado, incluindo 16 pacientes com metástases desenvolvidas durante o tratamento ou acompanhamento e 19 pacientes com sem metástase detectada durante o follow-up, e 18 pacientes com câncer metastático. O último grupo consistiu de quatro pacientes com disseminação distante único órgão e 14 pacientes com disseminação para vários órgãos; órgãos envolvidos incluídos peritônio (13 casos), fígado (oito casos), pulmão (três casos), outros locais (oito casos). Em geral, os critérios de inclusão envolveu: estado Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) desempenho de 0-2, idade 20-85 anos, o nível de creatinina no soro < 1,5 mg /dl, o nível de soro bilirrubina < 2,0 mg /dl, uma contagem de granulócitos > 1500 células /uL e uma contagem de plaquetas > 100.000 células /ml, enquanto que os critérios de exclusão: envolvidas malignidade anterior, cirurgia prévia, radioterapia ou quimioterapia. O estadiamento pré-tratamento baseado no exame físico, esophagogastroscopy com biópsias, CT do exame abdômen e no peito por raio-X ou tomografia computadorizada. Cinquenta doadores livres da doença por sexo e da mesma idade foram incluídos como grupo de controle. Todos os participantes do estudo eram caucasianos (~ 65% homens), com idade na faixa de 34-74 anos. A Tabela 1 apresenta informações mais detalhadas sobre grupos analisados. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética apropriado, e todas as pessoas que estavam a tomar parte neste estudo forneceu consentimento informado indicando a sua participation.Table consciente e voluntária 1 Características dos grupos de doadores incluídos no estudo
grupo /parâmetro

controle saudáveis ​​
os pacientes com câncer (todos os casos)
pacientes com câncer localmente avançado
os doentes com cancro metastático
Sem propagação

Espalhe
Número (n)
50
53
19
16
18
Sexo (M /F)
30/20
37/16
12/7
13/3
12/6
Idade (anos)
28-60 (mediana 50)
34-74 (mediana 59)
36-70 (mediana 59)
34-73 (mediana 58)
35-74 (mediana 60)
localização do tumor
terço superior
- 15 (28%) Sims 3 (16%)
6 (37%)
6 (33%)
Oriente terceira
- 31 (59%)
13 (68%)
9 (57%)
9 (50%)
Lower terceiro
- 7 (13%) Sims 3 (16%)
1 (6%)
3 (17%)
grau histológico
G1-G2
- 16 (30%)
10 (53%) Sims 3 (19%) Sims 3 ( 17%)
G3
- 29 (55%)
8 (42%)
11 (69%)
10 (56%)
não especificado
-
8 (15%)
1 (5%) Página 2 (12%)
5 (27%)
tumor primário
CT1-T3 Restaurant -
50 (94%)
19 (100%)
16 (100%)
15 (83%)
CT4
- 3 (6%)
0 (0%)
0 (0%) Sims 3 (17%)
Linfonodo
cN0
- 20 (38%)
13 (68%)
5 (31%)
2 (11%)
CN1-N3
- 33 (62%)
6 (32%)
11 (69%)
16 (89%)
Metástase (inicial)
CM0
- 35 (66%)
19 (100%)
16 (100%)
0 (0%)
Cm1
- 18 (34%)
0 (0%)
0 (0%)
18 (100%)
Grupo de pacientes com câncer localmente avançado no momento do diagnóstico foram ainda divididos em subgrupos, onde quer sem spread (controle) ou câncer de divulgação /disseminação consecutiva (metástase) foi detectado
Preparação de amostras de soro sanguíneo
pré-tratamento foi coletado em um tubo de 5 ml Vacutainer (Becton-Dickinson), incubadas durante 30 min à temperatura ambiente para permitir a coagulação e, em seguida, centrifugada a 1000 g durante 10 min
para remover o coágulo. O soro foi dividido em alíquotas e armazenado a -70 ° C até à sua utilização
Profiling da fracção de peso molecular baixo do proteoma soro
Antes de análise, amostras foram diluídas 1:. 5 com o tampão contendo 20% de acetonitrilo (ACN) e bicarbonato de amónio 25 mM, e depois filtrou-se por centrifugação através de unidades Amicon Ultra (50 kDa de corte) para remover as proteínas abundantes de alto peso molecular, particularmente a albumina. Imediatamente antes da análise, amostras foram dessalinizadas e concentradas por carregamento para microcolunas ZipTip C18 (Merck), e em seguida eluiu-se com 1 ul de solução de matriz (solução saturada de alfa-ciano-4-hidroxi-cinâmico ácido em 30% de ACN /H 2O e 0,1% de TFA) directamente sobre a placa 800 um AnchorChip ™ (Bruker Daltonics). A análise foi realizada usando um espectrómetro de massa MALDI-TOF UltrafleXtreme (Bruker Daltonics); o analisador trabalhou no modo linear, e íons positivos foram registrados no intervalo de massa entre 1000 e 12.000 Da. As amostras foram vistos em duplicado e para cada local dois espectros foram adquiridos. calibração de massa foi realizada após cada quatro amostras utilizando Proteína Calibração Padrão I (Bruker Daltonics). A randomização em bloco foi utilizado no registo de espectros para evitar um possível efeito lote. Em seguida os dados brutos foram exportados para TXT e os componentes espectrais foram pré-processados ​​usando bioinformática algoritmos criados no nosso grupo, que incluía o alinhamento, a detecção e remoção de perfis outlier por teste Q de Dixon (espectros individuais foram removidos a partir de cerca de 5% das amostras), média de repetições, técnicas de remoção de linha de base e a normalização da corrente total de iões. O alisamento espectros, colheita de pico, criação de faixas e análises estatísticas foram realizadas utilizando o software Spectrolyzer (versão 1.0.21.3590, MedicWave).
LC-MS /MS de análise do proteoma componentes séricos
As amostras de soro foram reduzidas com ditiotreitol 5 mM durante 5 min a 95 ° C, depois alquiladas com iodoacetamida 10 mM durante 20 min no escuro a temperatura ambiente, e depois digerida durante a noite a 37 ° C com tripsina (Promega). A análise foi realizada em Dionex UltiMate 3000 RSLC nanoLC Sistema ligado ao espectrômetro de massa Q Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific); Cada amostra foi analisada em separado. peptídeos trípticos (2,5 ug de péptidos) foram separados em coluna de fase reversa Acclaim PepMap RSLC nanoViper C18 (75 um x 25 cm, 2 uM de granulação), utilizando o gradiente de acetonitrilo (4-60%, em 0,1% de ácido fórmico) a 30 ° C e uma taxa de fluxo de 250 nL /min (de 230 min). O espectrómetro foi operando no modo de MS /MS dependente de dados com as verificações da pesquisa adquiridas a uma resolução de 70 mil a m /z 200 Da no modo de MS e 17500 a m /z 200 Da em modo de MS2, respectivamente. Os espectros foram registrados na faixa de varredura m /z 300-2000 no modo de iões positivos. de energia mais elevado de colisão de dissociação (HCD) fragmentação de iões foi realizada com energias de colisão normalizados definidos para 25. Identificação de proteínas foi realizada utilizando base de dados humana Swiss-Prot, com uma tolerância de precisão 10 ppm para massas peptídicas e 0,05 Da para massas fragmento de íon. A abundância de proteínas identificadas foram estimadas usando MaxQuant 1.4.1.1 software.
Estatística e bioinformática analisa
Para cada componente da massa MALDI perfis a comparação entre grupos de doadores foi realizada utilizando o teste t de Student após transformação logarítmica dos dados. classificadores multi-componentes foram construídos e testados com a abordagem baseada em SVM usando software Spectrolyzer (versão 1.0.21.3590, MedicWave). Significância das diferenças na abundância de proteínas quantificadas por LC-MS /MS foram avaliados utilizando o teste t ou o teste de Mann-Whitney, dependendo normalidade dos dados (tipo de distribuição foi estimada utilizando o teste de Shapiro-Wilk, o teste de Lilliefors e F teste para a homogeneidade das variâncias), e o teste Nemenyi para comparações de pares. Em geral, p = 0,05 foi selecionado como um limiar de significância estatística, exceto para profiling MALDI onde foi aplicada a correção de Bonferroni para múltiplos testes. O empírica proteômica Ontologia Base de Conhecimento (EPO-KB), que anota os valores registados m /z para conhecidos peptídeos /proteínas [26], foi utilizado para atribuir a identificação hipotética dos componentes espectrais (0,5% limite de precisão em massa foi permitido). Lista de genes correspondentes a proteínas identificadas foi anotado em termos GO usando gProfiler (http: //biit cs ut ee /gprofiler /...); o significado do termo sobre-representação foi avaliada usando o teste de distribuição hipergeométrica. A fim de visualizar relações funcionais entre proteínas identificadas genes correspondentes foram anotados no plug-in GeneMANIA Cytoscape para redes de interação via (http: //. Páginas genemania org /plugin /.)

Resultados da missa. perfis do peptidoma endógena do soro (a fracção de peso molecular baixo do proteoma do soro) foram caracterizadas por espectrometria MALDI-TOF em todo o grupo de 53 pacientes com cancro gástrico e 50 dadores saudáveis ​​correspondentes. Esta análise permitiu avaliar grau geral de diferenças e semelhanças entre subgrupos de indivíduos analisados. Em geral, 255 componentes espectrais (íons de peptídeos) foram distinguidos na faixa de massa analisados ​​(Fig. 1a), e abundâncias de 101 componentes revelou variação estatisticamente significativa entre os grupos comparados (após a correção de Bonferroni contra os testes de múltipla). A Tabela 2 apresenta o número de componentes peptidoma soro que diferenciaram os grupos específicos de doadores. Foram observadas as grandes diferenças na abundância de componentes do soro específicos entre pacientes com câncer e doadores saudáveis ​​(cerca de 39% de componentes registrados deleitava diferenças estatisticamente significativas). Também foram observadas grandes diferenças entre os pacientes com câncer localmente avançado (todos os casos) e pacientes com câncer metastático (cerca de 9% de componentes registrados deleitava diferenças estatisticamente significativas); este é digno de nota que um número semelhante de componentes diferenciadores foram observados quando os pacientes com câncer metastático foram comparados com ambos os subgrupos com doença local separadamente (isto é, grupo onde foi detectado disseminação à distância do câncer durante o seguimento e grupo sem evidência de doença). Coerentemente, classificadores bom desempenho poderia ser construído com base em características de peptidoma soro que separados compararam grupos de doadores saudáveis ​​e pacientes com câncer localmente avançado ou metastático (a medida AUC para o classificador baseado em SVM foi acima de 90% em cada caso). Em contraste marcante, não houve diferença estatisticamente significativa quando dois subgrupos de pacientes com câncer localmente avançado (que metástases durante o acompanhamento desenvolvido ou não desenvolvido) foram comparados (a AUC do classificador baseado em SVM foi abaixo de 50%). Figura 1b apresenta exemplos de componentes peptidoma soro com significativamente diferentes abundâncias entre os grupos comparados. Isso é notável que entre petidome componentes que diferenciam ambos os controles saudáveis ​​de pacientes com câncer e pacientes com câncer localmente avançado de pacientes com doença metastática havia vários componentes que supostamente correspondiam a fragmentos de fibrinopeptide A (FIBA). Estes componentes incluídos com m /valor registado z 1088,7, 5903,5 e 5916,6 Da significativamente reprimidos no soro de pacientes com câncer, e os componentes 1469.9 e 1626,0 Da, com abundâncias acentuadamente mais elevados no soro de pacientes com doença metastática do que em pacientes com câncer localmente avançado (ver Fig . 1b; arquivo adicionais 1: Tabela S1). Concluiu-se que as diferenças moleculares entre cancro gástrico localmente avançado e metastático (bem como as diferenças entre indivíduos saudáveis ​​e doentes com cancro gástrico em geral) tem reflexão ao nível do peptidoma soro. No entanto, as características de peptidoma de soro pré-tratamento pode ser aplicado improvável para o prognóstico da doença se espalhar durante /depois do tratamento. FIG. 1 Perfil de peptidoma soro endógena de pacientes com câncer gástrico. um espectro médio de massa na gama de 1000-10,000 Da. b Exemplos de componentes peptidoma soro, que abundâncias eram diferentes entre as amostras de controles saudáveis ​​e diferentes grupos de pacientes com câncer de estômago. Boxplots
mostrar mínimo, quartil inferior, mediano, quartil superior, valores máximos e valores atípicos; asteriscos
marcadas diferenças significativas (p < 0,05 com a correção de Bonferroni)
Tabela 2 Números de componentes peptidoma soro com abundâncias diferentes entre os grupos de comparação de indivíduos
Grupos /diferenças
vs. Controle câncer (todos os casos)
localmente avançado vs. câncer metastático
local /sem spread vs. câncer metastático
local /disseminação vs. câncer metastático
local /sem spread contra o câncer /disseminação local
n
50 vs. 53
35 vs. 18
19 vs. 18
16 vs. 18
19 vs . 16
p < 0,05
182
88
74
75
11
FDR
7%
14%
17%
17%
100%
p < 0.05 /Bonferroni
101
23
11
16
0
AUC (SVM)
0,94
0,91
0,92
0,97
0,48
são mostrados os números de diferenciar os componentes que atingiu o limite de significância estatística p = 0,05 (com estimativa de FDR correspondente) ou limiar reforçada com a correção de Bonferroni, e o poder do classificador SVM construídos de componentes peptidoma (caracterizada pelo valor AUC)
no segundo passo, seleccionado de 12 amostras de dadores saudáveis ​​e dez pacientes de cancro cada subgrupo para garantir idade semelhante (medianas cerca de 56 anos) e proporção de sexos (cerca de 80% do sexo masculino) em subgrupos comparados. Estas amostras foram utilizadas para as análises baseadas na abordagem espingarda LC-MS /MS. Em geral, cerca de 450 proteínas foram identificadas em amostras de soro analisadas. Os níveis de 234 proteínas no soro foram quantificados em amostras recolhidas a partir de cada um dos 42 indivíduos, dos quais 129 proteínas únicas de soro não relacionadas com imunoglobulinas (105 imunoglobulinas e proteínas relacionadas com Ig, assim como as proteínas putativas não caracterizadas, foram excluídos de análises); dados completos são apresentados no arquivo adicional 1: Tabela S2. Havia 49 proteínas séricas com abundâncias diferentes entre os doadores saudáveis ​​e pacientes com câncer gástrico (valor de p < 0,05; valor FDR estimado = 13%): 41 proteínas foram regulada, enquanto oito proteínas foram reprimidos no sangue de pacientes com câncer (proteínas listadas na Tabela 3;. Os exemplos na Fig 2). Isto é digno de nota que padrões similares de regulação positiva ou infra-regulação de proteínas séricas relacionada ao câncer foi observada em todos lá subgrupos de pacientes com câncer (apesar de menor tamanho dos grupos analisados ​​pode reduzir a significância estatística das diferenças, ver arquivo adicionais 1: Tabela S3). Além disso, havia 19 proteínas séricas com abundâncias diferentes entre os pacientes com câncer localmente avançado e metastático (valor de p < 0,05; valor FDR estimado = 34%): três proteínas foram regulados positivamente, enquanto 16 proteínas foram reprimidos no sangue de pacientes com doença metastática. Isto é digno de nota que a abundância de proteína C-reativa e angiogenin geralmente regulada em amostras de cancros aumentou ainda mais em amostras metastáticos, enquanto abundâncias de anidrase carbônica 1 geralmente reprimidos em amostras de câncer diminuiu ainda mais em amostras metastáticos (Tabela 3). Além disso, os padrões de diferenças entre amostras de pacientes com câncer metastático e todos os pacientes com doença local foram retidos quando dois subgrupos menores de pacientes com câncer localmente avançado foram pairwise comparação com câncer metastático (ver arquivo adicionais 1: Tabela S4). Por outro lado, a abundância de apenas uma proteína (antitrombina-3) apresentaram diferença estatisticamente significativa quando ambos os subgrupos de pacientes com câncer localmente avançado foram comparados (abundância desta proteína foi o mais elevado no grupo de pacientes com doença local que não se espalham durante acompanhamento). Concluiu-se que a assinatura multi-proteína poderia ser identificado para a classificação de amostras de soro de pré-tratamento de pacientes com câncer gástrico, que sofria de qualquer doença localmente avançado ou metastático. No entanto, as características do proteoma do soro não conseguia distinguir os pacientes com doença local que se espalham durante o acompanhamento após as proteínas do soro treatment.Table 3 Diferenciar
nome Protein
Protein nome completo
do gene
Controle /câncer
/metastático
Rácio
valor de p local
Rácio
valor de p

A1AG1
glicoproteína alfa-1-ácido 1

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