Linfangiogênese no câncer gástrico regulada através de Akt /mTOR-VEGF C-eixo /VEGF-D

Linfangiogênese no câncer gástrico regulada através Akt eixo /mTOR-VEGF-C /VEGF-D da arte abstracta
Fundo
Linfangiogênese desempenha um papel importante na metástase e recorrência de câncer gástrico. Não há relato ainda incidindo sobre a modulação da via VEGF e lymphangiogenesis de câncer gástrico, visando Akt /mTOR. Este estudo tem como objetivo demonstrar a relação entre Akt /mTOR e VEGF-C /D no câncer gástrico.
Métodos
Foram coletadas cirurgicamente ressecados espécimes de adenocarcinoma gástrico de 55 consentido pacientes. coloração imuno-histoquímica da P-Akt, p-mTOR, VEGF-C, VEGF-D foram realizadas e marcado por dois patologistas independentes. Os resultados foram apresentados como intensidade de coloração e taxa de células coloração positiva. Também medimos densidade de vasos linfáticos (LVD) por D2-40 coloração. Diferentes doses de P-Akt inibidor LY294002 (12,5 uM, 25 uM, 50 uM) e inibidor de p-mTOR Rapamicina (25 nM, 50 nM, 100 nM) foram dadas a linha celular de cancro gástrico SGC-7901 in vitro. A taxa de inibição do crescimento celular foi testado por MTT às 24 h, 48 h e 72 h, respectivamente e expressão de proteínas de Akt, P-Akt, mTOR, p-mTOR, VEGF-C e VEGF-D foram analisados ​​por Western blot.

resultados As taxas de coloração positiva de p-Akt, p-mTOR, VEGF-C e VEGF-D em 55 amostras clínicas de câncer gástrico foram 74,54%, 85,45%, 72,73% e 58,18%. P-Akt e p-mTOR foram positivamente correlacionados com o VEGF-C e VEGF-D (p < 0,01). O LVD aumentou com tendência incremental da intensidade de coloração da P-Akt, p-mTOR, o VEGF-C e VEGF-D. LY294002 ou rapamicina suprimiu significativamente o crescimento de células SGC-7901 e a taxa de inibição foi dependente da dose e tempo (p < 0,001). Além disso, a expressão da proteína de p-Akt e p-mTOR foram positivamente correlacionada com a de VEGF-C e VEGF-D (p < 0,05).

Conclusões O nível de DBT em amostras de cancro gástrico foi significativamente maior do que a do tecido gástrico normal e foi positivamente correlacionada com a P-Akt, p-mTOR, o VEGF-C e VEGF-D. A inibição da P-Akt e p-mTOR, in vitro, de células de tumor diminuiu de VEGF-C e VEGF-D significativamente. Portanto, concluímos que lymphangiogenesis de câncer gástrico pode estar relacionado com Akt mTOR-VEGF-C eixo //VEGF-D.
Palavras-chave
Linfangiogênese gástrica câncer de Akt /mTOR VEGF fundo
O câncer gástrico é um dos a maioria das neoplasias malignas comuns em todo o mundo [1-3]. estratégias de tratamento comum para o câncer gástrico incluem cirurgia, radioterapia, quimioterapia e terapia-alvo [4,5]. falhas de tratamento incluem metástases e recidiva após a operação. As principais vias metastáticos de câncer gástrico são invasão direta, metástase vascular, metástases linfáticas e enterocoelia metástase [3]. Entre aqueles, metástase linfática é um critério cada vez mais importante no julgamento do prognóstico do carcinoma gástrico e lymphangiogenesis é reconhecido como um preditor significativo para o prognóstico de pacientes com câncer gástrico [1,2]. Além disso, acredita-se que a metástase do cancro de estômago linfático ser um evento anterior em comparação com metástases vascular, acontecendo mesmo no cancro gástrico fase inicial [3,4]. Portanto, a União Internacional contra o Câncer levou a taxa de linfangiogênese ea quantidade de metástases do nó de linfa para o estadiamento do câncer gástrico em avaliar o prognóstico [2,5]. Além disso, mesmo se linfadenectomia e quimioterapia intraperitoneal foram realizadas durante linfonodo progressão negativa, ela também trouxe o efeito positivo na melhoria da taxa de sobrevivência de 5 anos de câncer gástrico [5].
As duas formas estabelecidas de entrada de células tumorais para o sistema lymprhatic estão invasão de ductos linfáticos existentes e indução de lymphangiogenesis [3]. Esta última é considerada como a principal forma. Além disso, lymphangiogenesis desempenha um papel decisivo na metástase, recorrência e prognóstico no câncer gástrico precoce [4]. Assim, os estudos de lymphangiogenesis ter um impacto promissora no tratamento. VEGF-C e VEGF-D foram positivamente relacionada à metástase de tumores sólidos linfático, densidade de vasos linfáticos (LVD) e profundidade de invasão tumoral e recorrência de acordo com estudos anteriores [6-8]. Além disso, Akt /mTOR também está envolvido na regulação da linfangiogênese e metástase linfática [9-11]. Portanto, a relação entre Akt /mTOR e VEGF vias é digno de ser elucidado. Para o nosso conhecimento, não há nenhum relatório ainda incidindo sobre a modulação da via VEGF e linfangiogênese, visando Akt /mTOR no câncer gástrico. Neste estudo, pretendemos demonstrar a relação entre Akt /mTOR e VEGF-C /D no câncer gástrico.
Métodos
espécime clínicos
espécimes de adenocarcinoma gástrico ressecados cirúrgicos foram coletados de 55 pacientes com gástrica cancer de abril de 2011 a novembro de 2012. Todos eles receberam nenhuma radioterapia, quimioterapia ou imunoterapia antes da operação. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Primeira Affiliated Hospital da Universidade de Nanchang e todos os participantes deram consentimento informado por escrito.
Imunohistoquímica
Todas as amostras de tecido foram fixadas com formalina a 10%, rotineiramente incluídos em parafina, cortados em 4 mícrons de espessura como secções em série, desparafinados com xileno, re-hidratação com um gradiente de etanol e lavou-se com água destilada. A recuperação de antígenos foi realizada submergindo secções em tampão de recuperação antigénico (0,5 M de EDTA) e, em microondas durante 20 min. As secções foram então tratadas com uma solução de 3% de peróxido de hidrogénio. As amostras foram bloqueadas com soro de cabra normal a 5% e depois incubadas durante a noite a 4 ° C com o anticorpo primário: P-Akt (Ser473) (coelho, 1: 100, Cell Signaling Technology, EUA), p-mTOR (ser2448) ( coelho, 1: 200, Abcam, EUA), de VEGF-C (cabra, 1: 400, R & D, EUA), o VEGF-D (rato, 1:50, Santa Cruz, EUA) e D2-40 (rato, 1: 100, ZSGB-BIO, China). Em seguida, foi adicionado anticorpo secundário, e as amostras foram incubadas durante 30 min à temperatura ambiente e, em seguida desenvolvida com DAB. soro de cabra normal a 5% foi utilizado como controlo negativo, em vez do anticorpo primário. coloração imuno-histoquímica foi marcado por dois patologistas independentes. Os resultados foram apresentados na forma de intensidade de coloração (+ /++ /+++) e taxa de células coloração positiva.
Densidade de vasos linfáticos
acordo com critérios Masakau, coloração positiva D2-40 (células endoteliais simples ou celular aglomerados) foi marcado como sendo o navio microlymphatic positivo. A área rica-vascular na localização e tumor centro para-neoplásica foram definidas e 5 campos de "pontos quentes" foram aleatoriamente contados sob alta ampliação (× 400). A média foi contado como o LVD.
Célula de sobrevivência
três dosagens diferentes (12,5 mM, 25 mM, 50 mm) de Akt inibidor da activação de LY294002 (Sigma) ou inibidor da activação de mTOR (25 nM, 50 nM, 100 nM ) rapamicina (Sigma) foram dadas a linha de células de câncer gástrico SGC-7901. A taxa de inibição do crescimento celular foi testado por ensaio MTT às 24 h, 48 h e 72 h, respectivamente.
Western blot
células SGC-7901 foram homogeneizados em tampão de lise RIPA (10 mM Tris-HCl, pH 7,4 , 150 mM de NaCl, 600 mM, NP-40, 1% de Triton X-100, 10% de glicerol, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM, fluoreto de sódio 1 mM, e ortovanadato de sódio 1 mM) e colocado em gelo durante 2 h. A concentração de proteína de cada amostra foi determinada pela Bio-Rad Protein Assay Kit (Bio-Rad, Laboratories, Hercules, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Os lisados ​​contendo 50 ug de proteína foram separadas por SDS-PAGE e depois transferidos para membranas de nitrocelulose. reacções não específicas foram bloqueadas durante 4 h com TBS-T (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 0,1% de Tween 20) contendo 5% leite seco não gordo. Em seguida, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com o anticorpo primário: Akt (rato, 1: 2000, Cell Signaling Technology, EUA), P-Akt (Ser473) (coelho, 1: 2000, Cell Signaling Technology, EUA), a mTOR ( coelho, 1: 1000, Cell Signaling Technology, EUA), p-mTOR (ser2448) (coelho, 1: 3000, Abcam, EUA), de VEGF-C (cabra, 1: 1000, R & D, EUA) e VEGF D (rato, 1: 500, Santa Cruz, EUA). Depois de ter sido lavada com TBS-T contendo leite em pó não gordo, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano. As manchas de proteína foram visualizadas por quimiluminescência utilizando ECL (Amersham). A análise estatística
amostras independentes de teste T entre dois grupos e análise de fator único de variância (ANOVA) para comparações múltiplas foram utilizados quando os dados em conformidade com a distribuição normal e homogeneidade de variância. Caso contrário, foram realizados testes de Mann-Whitney entre dois grupos e teste de Kruskal-Wallis entre multi-grupos. análise de Spearman foi utilizado para medir a correlação de medição e dados de contagem. As análises estatísticas foram realizadas por SPSS17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados da Expressão de P-Akt, p-mTOR, o VEGF-C e VEGF-D in situ
As colorações imuno-histoquímica da P-Akt, p-mTOR, o VEGF-C e VEGF-D em 55 amostras clínicas de cancro gástrico foram mostrado (Figura 1). A coloração positiva apresentada principalmente em citoplasma e alguns nuclear coradas em p-Akt e p-mTOR. As taxas de positividade de P-Akt, p-mTOR, o VEGF-C e VEGF-D foram 74,54%, 85,45%, 72,73% e 58,18% respectivamente. A quantificação da intensidade de coloração foi mostrado na Tabela 1. A Figura 1 A imuno-histoquímica a coloração de P-Akt, p-mTOR, o VEGF-C e VEGF-D na amostra de cancro gástrico (× 400). A: P-Akt, B: p-mTOR, C: VEGF-C, D: O VEGF-D, E: A correlação entre a P-Akt e p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D
Tabela 1. coloração imuno-histoquímica de p-Akt, p-mTOR, VEGF-C e VEGF-D em amostras de câncer gástrico
Intensidade (n)
taxa positiva (%)
-
+
++

p-Akt
14
29
12
74.54
p-mTOR
8
21
26
85.45
VEGF-C
15
22
18
72.73
VEGF-D
23
27
5
58.18
As correlações de P-Akt e p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D, P-mTOR e de VEGF-C /VEGF-D foram adicionalmente analisados. A expressão da P-Akt estava positivamente correlacionada com a P-mTOR (p = 0,001), o VEGF-C (p = 0,002) e VEGF-D (p = 0,009) (Figura 1E). Além disso, a p-mTOR também foi relacionada significativamente positivo para VEGF-C (p < 0,001). E VEGF-D (p = 0,003)
densidade de vasos linfáticos
coloração D2-40 foi usada para calcular a DBT para cancro gástrico (Figura 2A) e tecido gástrico normal de alinhamento (Figura 2B). De acordo com os resultados, D2-40 manchado principalmente no endotélio linfático na distribuição difusa ou em cluster. Fina parede do vaso linfático faltava camada basal. A maior DBT foi observado na borda do tumor com uma morfologia aglomerado denso semelhante. Além disso, D2-40 foi expressa na submucosa de tecido normal, com uma expressão fraca na camada de mucosa muscular ou bem. O LVD média de carcinoma gástrico e tecido normal eram 94,18 ± 23,31 vs 72,965 ± 21.569 /Número 5 campos de alta potência, P < 0,001. Figura 2 Imunohistoquímica coloração de D2-40 para LVD (× 400). A: tecido de câncer gástrico, B: Matched tecido normal, C: A correlação entre LVD e P-Akt /p-mTOR /VEGF-C /VEGF-D. . LVD = densidade de vasos linfáticos
LVD foram positivamente correlacionados com P-Akt, p-mTOR, o VEGF-C e a expressão de VEGF-D por análise de Spearman (p < 0,05). LVD com o aumento da tendência incremental da intensidade de coloração da P-Akt, p-mTOR, o VEGF-C e VEGF-D (Figura 2C).
Efeitos de LY294002 e rapamicina sobre o crescimento de células-7901 SCG
SGC-7901 As células foram cultivadas com três dosagens diferentes de LY294002, durante 24 h, 48 h e 72 h. De acordo com o ensaio de MTT, o crescimento celular SGC-7901 foi controlada e a taxa de inibição foi significativamente correlacionado com a dosagem LY294002 e tempo de acção (p < 0,001) (Figura 3A). Figura 3 Inibição da P-Akt e p-mTOR em células SGC-7901 por LY294002 e rapamicina. A: crescimento de células SGC-7901 com intervenção de diferentes pontos de tempo e doses de LY294002, B: o crescimento de células SGC-7901 com intervenção de diferentes pontos de tempo e doses de rapamicina, C: Efeito de LY294002 (50 uM) e rapamicina (100 nM ) em Akt /mTOR e de VEGF-C /D através de Western blot.
Além disso, as células também foram cultivadas com diferentes doses de rapamicina durante 24 h, 48 h e 72 h, respectivamente. A taxa de inibição da SGC-7901 também foi significativamente correlacionado com a dosagem, quer rapamicina ou tempo de acção (p < 0,001) (Figura 3B). Portanto, tanto o LY294002 e rapamicina pode inibir o crescimento de SGC-7901 em qualquer forma dependente do tempo ou dependente da dose.
Efeito de LY294002 na Akt /mTOR e de VEGF-C /-D
O nível de proteína de Akt, P-Akt, mTOR, p-mTOR, o VEGF-C e VEGF-D em SGC-7901 com LY294002 (50 uM) da inibição foram analisados ​​por Western blot. Entre eles, P-Akt, p-mTOR, o VEGF-C e VEGF-D foram diminuiu gradualmente com o tempo de LY294002 (Figura 3C) acção prolongamento. Houve uma diferença significativa quando comparado com o grupo sem LY294002 (p < 0,05). No entanto, não houve diferença estatística para Akt e mTOR (p > 0,05). Através da realização de uma análise relação variante dupla, P-Akt estava positivamente correlacionada com a P-mTOR /VEGF-C /VEGF-D (p < 0,05) e p-mTOR também foi relacionada positivamente com o VEGF-C /VEGF-D ( p. < 0,05)
efeito da rapamicina na via mTOR e de VEGF-C /-D
O nível de proteína de Akt, P-Akt, mTOR, p-mTOR, o VEGF-C e VEGF-D em SCG -7901 com rapamicina (100 nM) de inibição foram analisados ​​por Western blot. Entre eles, P-mTOR, o VEGF-C e a expressão de VEGF-D foram reduzidos com o tempo de rapamicina (Figura 3C) acção prolongamento. Houve uma diferença significativa quando comparado com o grupo sem rapamicina (p < 0,05). No entanto, não houve diferença estatística para Akt, P-Akt e mTOR (p > 0,05). Através da realização de uma análise relação variante dupla, p-mTOR foi positivamente correlacionada com o VEGF-C e VEGF-D (p < 0,05).
Discussão
via de sinalização de Akt /mTOR é uma via intracelular importante, que responde a citocina de sinais, e está provado que têm um papel importante no crescimento celular, o metabolismo e a apoptose [12,13]. Akt /mTOR envolve em vários mecanismos patológicos de câncer colorretal, câncer gástrico, câncer de fígado, câncer de mama e câncer uterino etc. [12-14]. O nosso estudo anterior confirmou que a P-Akt envolvidos em angiogénese de adenocarcinoma gástrico e a activação de Akt pode contribuir para a angiogénese através de VEGF-A sobre-regulação [15]. Neste estudo, as taxas de coloração positiva de P-Akt e p-mTOR em 55 casos de cancro gástrico foram 74,54% e 85,45% respectivamente. Além disso, P-Akt estava positivamente correlacionada com a P-mTOR (p < 0,01). Este resultado foi consistente com estudos anteriores e confirmou o papel significativo da Akt /mTOR no câncer gástrico. O prognóstico clínico do cancro gástrico é também proposta para ser associado com Akt e via de VEGF. Por exemplo, Murakami et al.
Sugeriu que o prognóstico de pacientes com câncer gástrico, sem expressão P-Akt foi sempre melhor do que os p-Akt positivos, e as taxas de sobrevida em 5 anos foram 68% e 35% para os pacientes com T3 ou tumores estágio T4, respectivamente [16]. Além disso, a Akt gene que codifica PI3CA
de PI3K proteína montante foi associada com sobrevida livre de doença [17]. Além disso, Wang et al.
Indicou que VEGF-C, VEGF-D e LVD de câncer gástrico foram relacionados com o tamanho do tumor e sobrevida global de acordo com um estudo realizado em 123 casos [18,19]. A correlação entre o VEGF-C /LVD e prognóstico na diferenciação tumoral, estádio, metástase linfonodal e metástases à distância também foram confirmados [20]. Outro estudo sugeriu ainda usando a combinação de VEGF-C /D e CA 19-9 para prever a metástase de vasos linfáticos [21].
Dado que Akt /mTOR e de VEGF-C /-D desempenhar um papel vital na metástase linfática e prognóstico , nosso estudo tem como objetivo explorar a relação entre duas vias e promover ainda mais o mecanismo de lymphangiogenesis e metástase. De acordo com os resultados da coloração em
situ, P-Akt e p-mTOR foram positivamente correlacionados com o VEGF-C e VEGF-D (p < 0,01). Em termos de DBT, D2-40 nível de carcinoma gástrico e tecidos normais foram analisadas ao mesmo tempo. DBT em cancro gástrico foi quatro vezes maior do que a do tecido normal. Além disso, DBT foi significativamente correlacionado com a P-Akt, p-mTOR, o VEGF-C e VEGF-D (p < 0,05). Notavelmente, LVD, bem como VEGF-C /D foi obviamente mais baixa em pacientes com expressão negativa de P-Akt e p-mTOR que os positivos. Ele sugeriu que tanto Akt /mTOR e VEGF via envolvida na linfangiogênese e metástase de vasos linfáticos no câncer gástrico. Resultados semelhantes também foram confirmados por outros estudos. Yu et al.
Sugeriu que p-mTOR eram altamente consistentes com metástase ganglionar e poderia ser um preditor independente de metástase linfática e prognóstico do cancro gástrico [22]. Além disso, Onogawa et al.
Indicou que VEGF-C foi altamente correlacionada com metástases linfáticas de acordo com um estudo realizado em 140 casos de câncer gástrico precoce [23]. VEGF-C, bem como VEGF-D também foi considerado como um preditor de metástases linfáticas em doentes com cancro gástrico precoce [24]. No estudo, que confirmou ainda a relação de Akt /mTOR, o VEGF-C /D e LVD no cancro gástrico in situ
.
LY294002, como um inibidor da activação de Akt, é confirmada com o efeito anti-tumoral e promoveu a apoptose de câncer gástrico in vitro e in vivo

[25]. A rapamicina conhecido como um inibidor da activação de mTOR é utilizado clinicamente para o seu efeito anti-tumoral e na imunomodulação [26]. Os resultados do nosso estudo ainda verificou que LY294002 e rapamicina pode inibir eficientemente o crescimento de células SGC-7901. Além disso, LY294002 a 50 uM) e Rapamicina a 100 nM tinha a taxa de inibição mais eficaz da (52,53 ± 3,19)% e (48,72 ± 3,06) em 24% de h. Quando o prolongamento de 72 horas, as taxas de inibição foram (68,76 ± 1,00)% e (68,50 ± 3,77)%, respectivamente. Em seguida, observou-se a influência da inibição da fosforilação de Akt e mTOR em factores linfáticos, o VEGF-C e VEGF-D. A alta concentração de LY294002 (50 uM) e rapamicina (100 nM) foram usados ​​para o estudo de intervenção. De acordo com os resultados, a rapamicina suprimiu a expressão de p-mTOR e LY294002 eficientemente inibiu a expressão de P-Akt, bem como p-mTOR. Note-se que ambos os inibidores podem inibir eficientemente a expressão do VEGF-C /-D. Além disso, a infra-regulação da P-Akt /p-mTOR mostrou uma elevada consistência com a de VEGF-C /-D. Portanto, foi proposto Akt /mTOR estar estreitamente relacionado com o VEGF-C /-D. Os resultados semelhantes também foram previamente relatados em outros modelos de tumor. Por exemplo, Zhang et al.
Diminuída do receptor de insulina por ARN gancho de cabelo curto em linhas celulares de cancro, LCC6 e T47D. A proliferação celular, angiogénese, linfangiogénese e metástases também foram inibidos devido à regulação negativa da P-Akt e inactivação do VEGF-D [27]. Além disso, a inibição do mTOR poderia suprimir a expressão de VEGF-C e efetivamente reduzir lymphangiogenesis no modelo do rato do cancro do pâncreas [11]. Em outro estudo, o VEGF-D foi degradada por Honokiol para inibir linf de xenoenxerto de cancro do pulmão [28]. IL-6 também poderia regular VEGF-C a nível mRNA através de via /sinalização mTOR Akt, que efetivamente diminuiu a linfangiogênese e metástase no carcinoma espinocelular oral [29].
Conclusão
O nível de LVD em amostras de câncer gástrico foi significativamente maior do que a do tecido gástrico normal e positivamente correlacionada com a coloração imuno-histoquímica da P-Akt, p-mTOR, o VEGF-C e VEGF-D. Com a inibição da P-Akt e p-mTOR in vitro, o VEGF-C e VEGF-D foram também diminuiu significativamente. Por isso, propomos que lymphangiogenesis de câncer gástrico pode ser eficientemente modulada através do eixo Akt /mTOR-VEGF-C /VEGF-D.
Notas
Hongxia Chen, Runnian Guan, Yupeng Lei e Jianyong Chen contribuíram igualmente para este trabalho .
Abreviatura
LVD:
densidade de vasos linfáticos
declarações
Reconhecimento
O estudo foi apoiado pelo financiamento do National Science Foundation Grants da China ( N ° 81160307); Jiangxi Science & Programa Pillar Tecnologia ea Fundação Ciência para Jovens Estudiosos da província de Jiangxi (No. 2007GQY1167); . Voyage Projeto da Província de Jiangxi Ciência e Tecnologia Associação
Competindo interesses
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes contribuições
dos autores
conceitos e desenho do estudo:. XZhou, HC; aquisição de dados: HC, RG, HC; Análise dos dados: YL, JC; Preparação do manuscrito: QG, RD, XZhang; revisão do manuscrito: XQ, HL, CC. Todos os autores ter participado suficientemente no estudo e aprovaram a versão final.

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