Abstrakt
Baggrund
EMX2 er en menneskelig ortholog af Drosophila Resultater I denne undersøgelse vi rapporterede, at nedregulering af EMX2 udtryk var signifikant korreleret med EMX2 promotor hypermethylering i mavekræft. Gendannelse EMX2 ekspression under anvendelse af et adenovirus-leveringssystem i gastriske cancercellelinier mangler endogen EMX2 ekspression førte til inhibering af celleproliferation og Wnt-signalvejen både in vitro og i en gastrisk cancer xenograft model in vivo. Desuden observerede vi, at dyr behandlet med den adenovirale EMX2 ekspressionsvektoren havde signifikant bedre overlevelse end dem behandlet med tom adenovirusvektor. Vores undersøgelse tyder på, at EMX2 er en formodet tumor suppressor i human gastrisk cancer. Den adenovirale-EMX2 kan have potentiale som en ny genterapi til behandling af patienter med gastrisk cancer Henvisning:. Li J, Mo M, Chen Z, Chen Z, Sheng Q, Mu H, et al. (2012) Adenoviral Leveringen af det EMX2 Gene blænder Vækst i Human Gastric Cancer. PLoS ONE 7 (9): e45970. doi: 10,1371 /journal.pone.0045970 Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan Modtaget: 13. april, 2012; Accepteret: August 23, 2012; Udgivet: 21 september, 2012 | Copyright: © Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af midler fra National Key Grundlæggende forskning og udvikling (973) Program Kina (2011CB910800 og 2012CB917304), National Natural Science Foundation of China (31.170.732), Natural Science Foundation i Zhejiang-provinsen (Y2101329), og postdoc Science Foundation of Zhejiang-provinsen (2010-BSH-031). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser Introduktion mavekræft er den fjerde mest almindelige kræftform og anden mest almindelige årsag til kræft dødsfald i verden [1], [2], [3]. Selv om dens globale forekomst er faldet, stadig høj i asiatiske lande forekomsten [2], [4], [5]. De fleste af mavecancerpatienter er diagnosticeret på fremskredne stadier [6]. Trods forbedringer i behandlingsstrategier [7], [8], 5-års overlevelse hos patienter med fremskreden mavekræft, som fik konventionel behandling forbliver mindre end 30% [4]. Derfor er et presserende behov for alternative tilgange. Genterapi, herunder virale og non-viral gen-delivery system, er en lovende metode til behandling af kræft [9]. Blandt alle aktuelt tilgængeligt system, rekombinant adenovirus (Ad) vektorer er særligt lovende. Fordelene ved Ad vektorer omfatter evnen til at producere høje titre, evne til at inficere dividere og ikke-delende celler effektivt, genom stabilitet, og lave niveauer af DNA-integration i værtsgenomet [9], [10]. Det er blevet rapporteret, at restaurering af gener gennem denne tilgang fører til tumorregression og inducerer apoptose in vivo EMX2, den humane ortolog af Drosophila Nylige undersøgelser tyder mulig inddragelse af EMX2 i humane kræftformer [22], [23], [24], [25]. For eksempel har EMX2 blevet påvist som en tumor suppressor i lungekræft, og lav EMX2 udtryk er forbundet med nedsat samlet overlevelse og tilbagefald overlevelse hos patienter med lunge adenokarcinomer [22], [23]. Det er også rapporteret, at EMX2 ekspression er rigeligt i normal endometrium af postmenopausale kvinder, men fraværende eller reduceret i endometriske tumorer, og EMX2 niveauer er negativt korreleret med proliferation [24], [25]. Endvidere kan EMX2 regulere tumorigenese gennem Wnt signalvej, en kritisk pathway reguleringen af cellernes skæbne bestemmelse, vævsudvikling og tumorigenese [26], [27], [28]. EMX2 findes som en direkte repressor af Wnt1 udtryk, og banke ned af EMX2 gen inducerer ektopisk udtryk for Wnt1 i udviklingslandene telencephalon og kortikal dysplasi [29]. Epigenetisk inaktivering af EMX2 ekspression kan være vigtigt for afvigende aktivering af Wnt signalering i lungecancer og deraf følgende proliferation og metastase [22]. Men funktionen af EMX2 under tumorigenese og tilsvarende mekanisme stadig brug for at blive yderligere belyst. I denne undersøgelse rapporterer vi EMX2 som en formodet tumorsuppressor i human gastrisk cancer. Vi demonstrerer EMX2 nedregulering og dets overensstemmelse med methylering status af genet promotor-regionen i mavekræft. Vi viser også, at restaurering af EMX2 hjælp en adenoviral leveringssystem hæmmer celledeling og Wnt signalering in vitro Etik Statement Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité af Xuanwu Hospital, Capital Medical University i Beijing. Et skriftligt informeret samtykke godkendt af den etiske komité, blev opnået for hver patient forud for væv prøvetagning. Humane gastriske cancer cellelinjer (AZ521, AGS og MKN28) blev opnået fra Kina center for Type Culture Collection (Wuhan, Kina). Cellelinjer blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium tilsat 10% føtalt bovint serum, penicillin og streptomycin ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO 2. For at analysere restaurering af EMX2 genet, blev celler behandlet med 4 pM DAC eller 300 nM TSA (Sigma, St. Louis, USA) i 4 dage, med udskiftning af frisk medium indeholdende den samme dosis af DAC eller TSA hverdag. Kontrolceller blev dyrket med frisk medium indeholdende DMSO. Cellerne blev derfor høstes til DNA /RNA-ekstraktion. I alt 20 formalinfikserede paraffinindlejrede væv blokke (10 mavekræft væv og 10 tilstødende normale væv), samt total RNA fra 15 gastriske dysplasi prøver og 20 gastrisk kræft kirurgiske prøver blev opnået fra Xuanwu Hospital, Capital Medical University i Beijing. Total RNA og genomisk DNA ekstraheret fra voksne humane normale gastriske væv blev indkøbt fra Biochain (Hayward, CA, USA). Topflash /Fopflash reportere indeholdende vildtype og mutant TCF /LEF bindingssteder henholdsvis blev venligst leveret af Dr. Yeguang Chen (Tsinghua University, Beijing, Kina). En mutant CTNNB1 (S45Y) cDNA konstruktionen blev også venligt leveret af Dr. Yeguang Chen (Tsinghua University, Beijing, Kina). Rekombinante adenovirusvektorer udtrykker EMX2 og kontrolvektoren blev indkøbt fra Vector Biolabs (Vector Biolabs, Burlingame, CA, USA). den omdannelse med bisulfit fra væv og celler blev udført uden forudsætningen for DNA oprensning ved anvendelse EZ DNA-methylering-Direct Kit (Zymo, Orange, CA, USA). De FFPE væv blev første de-paraffinized i xylen (Sigma) og rehydreret i graduerede ethanol, før behandling med bisulfit pr producentens instruktioner. For MSP, er modificeret DNA forstærkes ved hjælp af MSP primere (anført nedenfor), som specielt anerkendte enten methylerede eller umethylerede EMX2 promotorsekvenserne efter bisulfitbehandling. PCR blev kørt i et endeligt volumen på 20 pi indeholdende 1 × MSP reaktionspuffer [30], 0,5 pM af hver primer og 1 U Zymo Taq MSP-M (fremad): 5'TAGTTTTTTGTTCGTTTCGCGTTTC-3 ' MSP-M (tilbage): 5'GAATTAAAATAAACGCCCCTACCGAC-3' MSP-U (frem): 5'-GTTTTTTGTTTGTTTTGTGTTTTGA-3 ' MSP-U (tilbage): 5'-CCAAATTAAAATAAACACCCCTACCAAC-3' BS-A (fremad): 5 ' -GTTTGTAAATTTTTTTGGAAGGATTT-3 ' BS-A (tilbage): 5'-AACAAAAAACTATCCTTAACCACCA-3' BS-B (frem): 5'-GGTTAGGGATTTTGTAGGGAT-3 ' BS-B (tilbage): 5'-AAAATCACATAAACAACTTCCTCC-3 ' Immunhistokemi (IHC) IHC blev udført efter standard-protokol. Antistoffer anvendt i undersøgelsen omfattede muse-anti-humant Ki67 (1:100, BD, San Jose, CA, USA) og muse-anti-humant EMX2 (1:500; Pierce, Rockford, IL, USA), og Alexa 594-konjugeret ged anti-mus sekundært antistof (1:200; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Objektglas blev også modfarvet med hochest 33342 (Invitrogen). Zeiss LSM 710 konfokalt mikroskop (Oberkochen, Tyskland) blev anvendt til at undersøge farvningen. Intensiteten af Ki67 blev kvantificeret ved hjælp af billede Pro® Plus. EMX2 farvning blev visualiseret med Histostain Plus DAB kit (bredspektret, Invitrogen) ifølge producentens instruktioner, modfarvet med hematoxylin (Sigma), og fotograferet under anvendelse af et Leica SCN400 slide scanner (Leica, Tyskland). celler ved en densitet på 5 x 10 3 per brønd blev podet i plader med 24 brønde før transfektion. Topflash eller Fopflash plasmider blev cotransficeret med PRL-TK plasmid. Efter celler blev dyrket i 18 timer blev luciferaseaktivitet målt ved Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, Madison, USA). Forholdet mellem ildflueluciferaseaktivitet, (Topflash /Fopflash) og renilla aktivitet blev anvendt til TCF /LEF transskription aktivitet. Både den samlede protein (20 ug) og cytoplasma ekstrakter (40 pg) blev underkastet immunblotting. De primære antistoffer omfattede anti-EMX2 (1:500, Pierce), anti-β-Actin (1:5000, Sigma), anti-cyclin D1 (1:500, BD) og anti-c-myc (1:200; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA). proliferationsassav Cell vækst blev bestemt ved CellTiter 96 Vandig Proliferation Assay Kit (Promega). Cellelinierne blev udpladet i 96-brønds dyrkningsplader med antallet af 5 × 10 2 celler /brønd. Efter at cellerne var dyrket i dag 0, 2, 3 og 4 blev MTS opløsninger tilsat til mediet og inkuberet i 1,5 time. Absorbansen ved 490 nm blev målt under anvendelse mikropladelæser model 680 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Celler (1 x 10 3) inficeret med adenoviral vektor, der udtrykker EMX2 eller tom vektor blev podet tredobbelt i 100 mm skåle. Frisk medium blev ændret hver 3 dage. Efter dyrket i 3-4 uger, blev celler fikseret med 4% paraformaldehyd i 10 minutter, vasket med PBS, farvet med 0,1% krystalviolet i 20 minutter og fotograferet. RNA-ekstraktion og real-time RT-PCR blev udført som tidligere beskrevet [31]. Primersekvenserne blev beskrevet tidligere [22]. blev udført alle mus eksperimenter under specifikke patogenfrie forhold i dyr facilitet af Tsinghua University og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for Tsinghua University. Gastrisk cancer xenotransplantater blev etableret i 5 uger gamle BALB /c nøgne mus. Kort beskrevet efter dyrket til konfluens, MKN28 eller AGS celler blev trypisnized og resuspenderet i PBS (pH 7,4) og derefter blandet 01:01 (v /v) med matrigel (Kraftigt) ved 4 ° C for at injicere en mus i et samlet volumen på 150 pi. Blandingen blev s.c. injiceret i højre flanke på 16 hunmus med 10 7-celler per mus (dag 0). På dag 7 mus der bærer lokale tumorer varierede fra 50 til 100 mm 2 modtog en direkte intratumoral injektion af 1 x 10 9 plaque-dannende enheder af den angivne adenovirus (fortyndet med PBS i et samlet volumen på 100 pi). Tumoren blev overvåget i op til 1½ måned. Tumorstørrelse blev målt ved anvendelse skydelære og bestemmes ved at gange med 0,5 × bredde 2 x længde. Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til at estimere overlevelse i de to grupper af behandlede dyr. Ved afslutningen af forsøget blev tumorerne fra hver behandling opsamles i 10% pufret formalin, indlejret i paraffin og skåret i 5 um tykke skiver til yderligere Ki-67 detektion. Cytosoliske proteiner og hele cellelysat blev også udvundet fra disse tumorer til Western-analyse. Alle data blev beregnet som betyder ± standardafvigelser. Forskelle mellem grupper blev sammenlignet med en to-sidet t-test. En P nedregulering af EMX2 i Human Gastric Cancer Vi undersøgte EMX2 udtryk i ni humane gastriske cancercellelinjer samt tumor og parrede tilgrænsende normale væv fra ti patienter mavekræft (figur 1). Brug real time RT-PCR, fandt vi, at ekspressionen af EMX2 var signifikant nedreguleret i otte af de ni cellelinjer undersøgt i forhold til at det ved normal gastrisk væv (P < 0,01, figur 1A). På den anden side, en cellelinie AZ521 viste lignende niveau af EMX2 ekspression som i normal kontrol (figur 1A). For at detektere EMX2 proteinekspression i vævsprøver fra patienter, blev immunhistokemi (IHC) udføres, og intensiteten af IHC-farvning blev kvantificeret af Image Pro® Plus. Alle ti analyserede prøver blev fundet at udvise enten manglende EMX2 udtryk eller nedsat niveau af EMX2 udtryk i kræft væv i forhold til deres normale modstykker (P < 0,01, figur 1B). At etablere den mulige rolle af EMX2 i patologisk progression af human mavekræft, vi analyserede EMX2 udtryk ved hjælp af total RNA, som vi opnåede fra femten gastriske dysplasi prøver og tyve gastrisk kræft kirurgiske prøver. Vi fandt, at EMX2 ekspression blev signifikant nedreguleret i dysplasi prøver (P < 0,05). Og næsten tabt i tumor prøver sammenlignet med den i voksen normalt mavevæv (figur 1C), hvilket antyder, at EMX2 nedregulering kunne forekomme ved non-invasiv præcancer fase Korrektion mellem EMX2 Expression og dens promoter methylering status Vi undersøgte methylering status EMX2 promotor i ni gastrisk cancer cellelinjer og normal gastrisk væv. Regioner af CpG øer (CGI) blev identificeret med MethPrimer fra -800 til -470 og -55 til 459 i forhold til de forventede transcription start sites (+1) af EMX2 genet (figur 2A). Methylering status blev analyseret ved anvendelse af bisulfit sekventering (BS) (figur 2B) og methylering-specifik PCR (MSP) (figur 2C-2D). Vores BS og MSP Resultaterne viste, at EMX2 promotor i normale gastrisk væv og AZ521 celler var umethyleret, mens det i de andre otte cellelinjer undersøgte det var tæt methylerede (figur 2B-2C). Disse resultater er konsistente med de EMX2 ekspressionsniveauer i disse cellelinier: højt indhold af normalt væv og AZ521, men lav i de andre otte celle undersøgte linjer. En blanding af methyleret og umethyleret bånd blev fundet i flere cellelinjer, herunder MKN28, N87, og SNU16 indikerer delvis methylering. Endvidere fandt vi, at status for methylering af patienten vævsprøver afsløret af MSP er i overensstemmelse med EMX2 ekspressionsniveauer i disse prøver (figur 2D, fire af de ti par vævsprøver blev undersøgt på grund af manglende tilgængelighed af genomisk DNA fra de andre seks par ). Disse data tyder på, at nedregulering af EMX2 udtryk kan være et resultat af sin promotor hyper-methylering i mavekræft. For yderligere at undersøge sammenhængen mellem EMX2 udtryk og promotor methylering, vi behandlede MKN28 og AGS-cellelinjer med en methyltransferase inhibitor DAC og en histondeacetylaseinhibitor TSA. Cellelinie AZ521 blev anvendt som en negativ kontrol som dens promotorregion er umethyleret. Vi observerede, at unmethylation specifikt bånd blev signifikant forøget (figur 3A) med EMX2 ekspressionsniveauerne opregulerede tilsvarende (figur 3B) efter DAC behandling i både AGS og MKN28 celler, mens de i AZ521 celler forblev uændret (figur 3). Behandlingen af TSA havde minimale virkninger på både methylering status og EMX2 ekspressionsniveauer. Tilsammen vores resultater tyder stærkt på nedregulering af EMX2 udtryk var signifikant korreleret med EMX2 promotor hypermethylering i human gastrisk cancer. vi undersøgte dernæst betydningen af EMX2 på cellevækst af gastriske cancerceller. Væksten i AGS og MKN28 celler blev signifikant undertrykt ved infektion med adenovirus udtrykker EMX2 (Ad-EMX2) sammenlignet med en tom vektor kontrol (Ad-ctrl) (P < 0,001, figur 4A), mens væksten af AZ521 celler ikke blev påvirket (P > 0,05, figur 4A). Disse observationer blev også bekræftet ved kolonidannelse assayet (figur 4B). Vores resultater viser anti-spredning funktion af EMX2 i gastriske kræftceller Undertrykkelse af Wnt signalvejen af Adenovirus-leveret EMX2 Funktionen af EMX2 har været forbundet med Wnt signalvej.; derfor vi studerede sammenhængen mellem EMX2 og Wnt signalering i mavekræft. Vi brugte en Topflash /Fopflash reporter assay til måling af TCF /LEF-afhængig transskription aktivitet reguleret af kanoniske Wnt vej. Vi fandt, at TCF /LEF-afhængig transskription aktivitet blev signifikant inhiberet af Ad-EMX2 i AGS og MKN28 celler, der mangler endogen EMX2 ekspression (P < 0,05), men ikke i AZ521 celler, der udtrykker endogent EMX2 (P > 0,05, figur 5A). Konsekvent, proteinniveauer af cytosolisk β-catenin og kanoniske Wnt pathway downstream mål c-myc og cyclin D1 blev undertrykt i disse AGS og MKN28 celler inficeret med Ad-EMX2, men ikke i AZ521 celler (restaurering af EMX2 ekspression i disse cellelinier efter ad-EMX2 infektion blev bekræftet ved Western) (figur 5B). For yderligere at undersøge relevansen af Wnt vej nedregulering og spredning undertrykkelse af Ad-EMX2, vi transficeret og udtrykte stabiliseret β-catenin (S45Y mutation) i disse mavekræft celler inficeret med Ad-EMX2. Vi observerede, at over-udtrykkende β-catenin betydeligt svækket væksten undertrykkende virkning af Ad-EMX2 i begge AGS og MKN28 celler (P < 0,01), men ikke i AZ521 celler (figur 5C). Tilsammen disse resultater understøtter en vigtig rolle for EMX2 i undertrykkelse af Wnt vej i mavekræft. Vi etablerede MKN28 og AGS xenograftmodeller at udforske det terapeutiske potentiale af adenovirus-leveret EMX2 for mavekræft in vivo homeobox gener er blevet kendt for sin betydning i udviklingen i årtier, mens studiet af disse gener under onkogenese er stadig i sin vorden. Afvigende homeobox gen udtryk er blevet dokumenteret i forskellige kræftformer [32], [33], med angivelse af ændringer i hemeobox udtryk kan være vigtigt for onkogenese. Dette kan tilvejebringe en molekylær basis for potentielle kliniske anvendelser. Men flere grundlæggende spørgsmål stadig brug for at være fuldt op, herunder de molekylære mekanismer, der driver afvigende udtryk, og downstream mål og signalveje, der fremmer onkogenese. I denne undersøgelse, giver vi indblik i disse spørgsmål ved at undersøge EMX2 i human gastrisk cancer. Vores undersøgelse rapporteret et signifikant fald og tab af EMX2 ekspression i gastrisk cancer cellelinjer og primære tumorvæv, og viste, at nedregulering var signifikant korreleret med hyper-methylering af EMX2 promotoren, hvilket tyder epigenetisk inaktivering som en vigtig mekanisme til EMX2 dysregulation i human gastrisk cancer. Faktisk har epigenetisk modifikation blevet foreslået som en vigtig mekanisme er ansvarlig for homeobox gener nedregulering eller nedregulering i andre kræft vævstyper, hvor disse gener fungerer i tumor undertrykkelse [14], [32]. Desuden er vores observation af EMX2 dowregulation i ikke-invasiv gastrisk dysplasi understøtter en mulig vigtig rolle EMX2 i patologisk progression af human gastrisk cancer. En begrænsning ved vores undersøgelse er antallet af vævsprøver analyseret. Et større antal patientprøver skal undersøges for yderligere at validere konstateringen af methylering-dæmpning af EMX2 i mavekræft. Ikke desto mindre er vores resultater giver en første direkte beviser til støtte for denne mekanisme i mavekræft og identificere EMX2 som en formodet roman tumor suppressor i mavekræft. Derudover undersøgte vi vigtige onkogene veje, hvorigennem EMX2 fungerede i gastrisk kræft , og fandt, at Wnt signalvejen kan spille en nøglerolle medierer EMX2 funktion. Vi illustreret i proliferationsassays at høj ekspression af eksogen EMX2 betydeligt undertrykt vækst af gastrisk kræft cellelinjer mangler endogene genekspression (AGS og MKN28 celler), i overensstemmelse med tidligere rapporter om, at forskellen i EMX2 udtryk er negativt korreleret med proliferation i andre cancer celletyper [ ,,,0],24], [25]. Vi viste også, at Wnt signalvejen dramatisk blev hæmmet af EMX2 in vivo Endelig vore resultater indikerer potentialet for anvendelse EMX2 genterapi til behandling af gastrisk cancer. Infektion af tumorer med Ad-EMX2 signifikant undertrykte proliferation og endnu vigtigere, forbedret samlet overlevelse. Det er bemærkelsesværdigt, at leveringssystemet vi bruges til behandling var rekombinant adenovirus serotype 5 (Ad5), det hyppigst anvendte vektor i flere typer af cancer genterapi [11], [12], [34], [35]. Sammenlignet med adeno-associeret viral (AAV) og retrovirale afgivelsessystemer, adenovirale vektorer, såsom Ad5, klart har mange fordele. For eksempel, adenovirusvektorer har bred tropisme tillader effektiv målretning på mange væv af interesse, en stor nyttelast kapacitet og høj transduktion effektivitet i forhold til AAV-systemet [10] og også en ikke-integrerende egenskaber, der ellers fremkalde risiko for tilfældig mutagenese af genomet [ ,,,0],10], [36] [36], [37], [38]. Desuden kan adenovirusvektorer blive manipuleret til kræft-selektive onkolytiske virus [39], [40], [41], som er afgørende for den kliniske anvendelse af kræft genterapi. Men der er stadig mange udfordringer ved brugen adenovirale vektorer til at levere genterapier hos patienter. For eksempel kan de hurtigt tabt fra celler, der deler sig hurtigt efter infektion. Andre faktorer, der påvirker klinisk anvendelse af adenoviral levering omfatter emballeringskapacitet og værtsområde af adenovirale vektorer, deres genekspressionsprofil og tendens til at fremkalde immunreaktioner, særligt vigtigt, hvis der er behov gentagen administration [42], [43]. Alligevel vores in vivo
tom Spirakler homeobox gen der er blevet impliceret i embryogenese. Nylige undersøgelser tyder på mulig inddragelse af EMX2 i humane kræftformer; Men rolle EMX2 i carcinogenese behov for yderligere udforskning.
Konklusion
uden at påvirke normale væv [11], [12], [13].
tomme Spirakler (EMS) homeobox-genet, hører til homeobox-genfamilien, der koder for transskriptionelle regulatoriske proteiner (Homeoprotein) er vigtigt for mange aspekter af vækst og differentiering [14]. EMX2 spiller en afgørende rolle under hjernens [15] og skelet udvikling [16]. Mus huser homozygote EMX2 mutationer udviser dramatisk størrelse reduktion af caudale-mediale områder, herunder occipital cortex og hippocampus [17], [18], [19]. Forstyrrelse af EMX2 ekspression kan ændre proliferationshastigheden af voksne neurale stamceller [20]. EMX2 styrer også pattedyr reproduktion ved at justere endometrial proliferation uden at påvirke differentiering [21].
, og resulterer i en bedre overlevelse af en gastrisk cancer xenograftmodel in vivo
. Vores data tyder på det terapeutiske potentiale for at bruge Ad-EMX2 som genterapi for fremtidig behandling af patienter med mavekræft.
Materialer og metoder
Cell Culture, 5-aza-2'-deoxycytidin (DAC) /Trichostatin A (TSA) Behandling, og Vævsprøver
DNA-konstruktioner
Methylering-specifik PCR (MSP) og bisulfit sekventering (BS)
™ DNA Polymerase (Zymo). PCR tilstand var som følger: 10 minutter ved 95 ° C; 40 cykler af 30 sekunder ved 95 ° C, 30 sekunder ved 50 ° C og 30 ved 72 ° C; og 7 min endelig udvidelse ved 72 ° C. For BS, amplifikation af bisulfit-konverterede DNA blev udført i et slutvolumen på 50 pi indeholdende 1 uM hver BS primer og 2 U af Zymo Taq
™ DNA Polymerase. PCR tilstand var som følger: 10 minutter ved 95 ° C; 40 cykler af 30 sekunder ved 95 ° C, 40 s ved 55 ° C og 1 min ved 72 ° C; og 7 min endelig udvidelse ved 72 ° C. PCR-produkterne blev klonet ind PMD-18T (Takara, Dalian, Kina). Enten 5 eller 3 tilfældigt udvalgte positive kloner fra hver gruppe blev sekventeret i Shanghai Invitrogen (Shanghai, Kina). Primere var som følger:
Luciferase Assay
Immunoblotting
kolonidannelse Assay Salg
RNA-ekstraktion og kvantitativ real-time Reverse Transcription -PCR (RT-PCR)
Animal Model og adenovirusvektoren Delivery
Statistisk analyse
værdi på 0,05 eller derunder blev anset for at være betydelig.
Resultater
Hæmning af cellevækst ved Adenovirus-leveret EMX2 in vitro
Undertrykkelse af mavekræft Vækst af Adenovirus-leveret EMX2 in vivo
. En uge efter podning, mus bærende lokale tumorer i området fra 50 til 100 mm 2 modtog en direkte intratumoral injektion af 1 x 10 9 plakdannende enheder af det angivne adenovirus. Væksten af tumorer i Ad-EMX2 inficerede mus var signifikant langsommere end i kontrol gruppen (P < 0,05, figur 6A forlod to paneler). Ved afslutningen af forsøget tumormasse i Ad-EMX2 inficerede mus også signifikant mindre end den, kontrolgruppen (P < 0,05 for MKN28 tumor, P < 0,01 for AGS tumor, figur 6A højre panel). Farvningsintensitet af en proliferativ Ki67 af tumorprøver ved afslutningen af forsøget viste, at levering af Ad-EMX2 signifikant mindsket Ki-67-farvning (P < 0,01, figur 6B), hvilket tyder på celleproliferation inhibering i tumorer. Desuden overlevelse Ad-EMX2 inficeret gruppe var signifikant bedre end for kontrolgruppen (P = 0,014, figur 6C). I overensstemmelse med vores in vitro
analyse, cytosolisk β-catenin og kanoniske Wnt pathway downstream mål c-myc og cyklin D1 blev også nedreguleret i Ad-EMX2 inficerede MKN28 og AGS tumorer (restaurering af EMX2 udtryk i disse in vivo tumorer blev også bekræftet ved Western) (figur 6D). Tilsammen vores resultater viser en terapeutisk potentiale adenovirus-leveret EMX2 at behandle mavekræft.
Diskussion
in vitro
, hvilket giver yderligere beviser for, at Wnt signalvejen kan mægle funktion EMX2 i kræft som tidligere foreslået [22 ].
studie af Ad-EMX2 infektion antyder, at EMX2 genterapi kan have potentiale til at blive en klinisk anti-tumor terapeutisk strategi til behandling af gastrisk cancer i fremtiden.
Oprettelse af et fysisk og genetisk kort over Cannabis sativa
Sådan styrkes dit immunsystem til at bekæmpe coronavirus
Mikrober kunne forudsige fatale følger hos ventilerede COVID-19-patienter
Apoptose er en vigtig formidler af patogenese i infektion med coronavirus fra dyr
Mælkesyrebakterier og tarmbakterier bidrager til sundhedsmæssige fordele ved rug,
Oral sex kan udløse bakteriel vaginose
Forskere udvinder komplet menneskeligt genom fra et tusindvis af år gammelt "tyggegummi"
Det ser ud til at tyggegummi ikke er en ny trend! Forskere har fundet tyggegummi, der er 5, 700 år gammel, og det har givet spor om gammelt DNA. En undersøgelse med resultaterne blev offentliggjort i
Plast findes nu almindeligt i afføring hos mennesker
Næsten otte milliarder tons plast finder hvert år vej til havene. Denne enorme mængde plast skyller enten i land eller nedbrydes i små stykker, der er mindre end 5 millimeter i diameter og kaldes mikr
Forskere manipulerer bakteriearter i tarmen ved hjælp af kost
Forskere fra Stanford University School of Medicine har vist, at ved at manipulere diæt i en musemodel, det er muligt at favorisere engraftment af en specifik bakteriestam frem for andre.