PLoS ONE: аденовируса Поставка Emx2 генов подавляет рост в человека рака желудка

Абстрактный

Фон
<р> EMX2 является человек ортолог из дрозофил
пустой дыхальцами гомеобоксного гена, который был замешан в эмбриогенезе. Недавние исследования предполагают возможную причастность Emx2 в злокачественных опухолях человека; Тем не менее, роль Emx2 в канцерогенезе требует дальнейшего изучения.

Результаты

В этом исследовании мы сообщали, что понижающая регуляция экспрессии Emx2 значимо коррелировали с EMX2 гиперметилированием промотора при раке желудка. Восстановление Emx2 выражения с использованием системы доставки аденовируса в желудочном линиях раковых клеток, не имеющих эндогенную экспрессию Emx2 привело к торможению пролиферации клеток и Wnt сигнального пути, как в пробирке и в желудочном ксенотрансплантата рака модели в естественных условиях. Кроме того, мы обнаружили, что у животных, обработанных с аденовирусной вектора экспрессии EMX2 имели значительно лучшую выживаемость, чем у пациентов, получавших с пустым вектором аденовируса.

Заключение
<р> Наше исследование показывает, что EMX2 является предполагаемый подавитель опухоль человеческий рак желудка. Аденовирусная-EMX2 может иметь потенциал в качестве нового генной терапии для лечения пациентов с раком желудка
<р> Цитирование:. Li J, Mo M, Z Chen, Chen Z, Шэн Q, Mu H, и др. (2012) аденовируса Поставка Emx2 генов подавляет рост в человека рака желудка. PLoS ONE 7 (9): e45970. DOI: 10.1371 /journal.pone.0045970
<р> Редактор: Масару Като, Национальный центр рака, Япония
<р> Поступило: 13 апреля 2012; Принято: 23 августа 2012 года; Опубликовано: 21 сентября 2012
<р> Copyright: © Li и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа была поддержана за счет средств программы национальных ключевых фундаментальных исследований и развития (973) Китая (2011CB910800 и 2012CB917304), Национальный фонд естественных наук Китая (31170732), то фонд естественных наук провинции Чжэцзян (Y2101329) и Постдокторское Наука Фонд провинции Чжэцзян (2010-BSH-031). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка является четвертым наиболее распространенным видом рака и второй наиболее распространенной причиной смертности от онкологических заболеваний в мире [1], [2], [3]. Хотя его глобальная заболеваемость снизилась заболеваемость по-прежнему остается на высоком уровне в азиатских странах [2], [4], [5]. Большинство больных раком желудка диагностируется на поздних стадиях [6]. Несмотря на улучшение стратегий лечения [7], [8], 5-летняя выживаемость больных с распространенным раком желудка, которые получали традиционной терапии остается менее 30% [4]. Поэтому срочно необходимы альтернативные подходы.

Генная терапия, в том числе вирусных и невирусных системы доставки генов, является перспективным подходом к лечению рака [9]. Среди всех имеющихся в настоящее время системы, рекомбинантного аденовируса (Ad) векторы являются особенно многообещающими. Преимущества векторов Ad включают в себя способность производить высокие титры, способность инфицировать эффективно деления и не делящихся клеток, стабильность генома, а также низкий уровень интеграции ДНК в геном хозяина [9], [10]. Было сообщено, что восстановление генов через этот подход приводит к регрессии опухоли и индуцирует апоптоз В естественных условиях
, не затрагивая здоровые ткани [11], [12], [13].
<Р> EMX2, человек ортолог из дрозофил
гена гомеобоксного пустые дыхальца (СЭМ), принадлежит к семейству генов гомеобоксных, которая кодирует транскрипционные регуляторные белки (Homeoprotein) существенные для многих аспектов роста и дифференцировки [14]. EMX2 играет жизненно важную роль в головном мозге [15] и развития скелета [16]. Мыши, несущие гомозиготные мутации Emx2 демонстрируют снижение драматическое размер хвостового медиальной областях, в том числе затылочной коре и гиппокампе [17], [18], [19]. Возмущение выражения Emx2 может изменить скорость пролиферации взрослых нервных стволовых клеток [20]. EMX2 также управляет воспроизведением млекопитающего путем регулирования пролиферации клеток эндометрия без влияния дифференциации [21].

Недавние исследования предполагают возможное участие Emx2 в злокачественных опухолях человека [22], [23], [24], [25]. Например, EMX2 была продемонстрирована как подавитель опухоли при раке легкого, а низкая экспрессия EMX2 связано со снижением общей выживаемости и выживаемости без рецидивов у больных с аденокарциномы легких [22], [23]. Также сообщается, что экспрессия EMX2 обильна в нормальном эндометрии у женщин после менопаузы, но отсутствует или снижается в опухолях эндометрия, а также уровни Emx2 отрицательно коррелирует с распространением [24], [25]. Кроме того, EMX2 может регулировать туморогенез через Wnt сигнального пути, критический путь регуляции определения судьбы клеток, тканей и развитие онкогенеза [26], [27], [28]. EMX2 обнаруживается как прямое репрессора выражения Wnt1, и отбрасывая вниз гена Emx2 индуцирует эктопическую экспрессию Wnt1 в развивающемся телэнцефалоне и корковой дисплазии [29]. Эпигенетическое глушителей выражения Emx2 может иметь важное значение для аномальным активации сигнализации Wnt при раке легких, и как следствие, пролиферации и метастазирования [22]. Тем не менее, функция Emx2 во время онкогенеза и соответствующего механизма еще необходимо дополнительно выяснены. В этом исследовании мы сообщаем Emx2 как мнимого супрессоров опухоли при раке желудка человека. Продемонстрирована Emx2 понижающей регуляции и его корреляции со статусом метилирования промоторной области гена в развитии рака желудка. Мы также показали, что восстановление Emx2 с использованием аденовирусной системы доставки ингибирует клеточную пролиферацию и передачу сигналов Wnt в пробирке
, и приводит к лучшей выживаемости желудка модели ксенотрансплантата рака В естественных условиях
. Наши данные убедительно свидетельствуют терапевтический потенциал использования Ad-Emx2 в качестве генной терапии для будущего лечения пациентов с раком желудка.

Материалы и методы

Этика Заявление

Это исследование был одобрен этическим комитетом Суаньву больницы, медицинского университета капитала в Пекине. Письменное информированное согласие одобрено комитетом по этике, была получена для каждого пациента до сбора ткани образца.

Культура клеток, 5-аза-2'-дезоксицитидин (DAC) /трихостатин A (TSA) Лечение и Образцы тканей
<р> желудка человека раковых клеток линии (AZ521, АГС и MKN28) были получены из Китайского центра для коллекции типовых культур (Ухань, Китай). Клеточные линии культивировали в модифицированной среде Дульбекко Игла, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, пенициллином и стрептомицином, при 37 ° C в увлажненной инкубаторе с 5% CO <суб> 2. Анализировать восстановление гена EMX2, клетки обрабатывали 4 мкМ DAC или 300 нМ ТСА (Sigma, St. Louis, США) в течение 4-х дней, с заменой свежей среды, содержащей ту же дозу DAC или TSA каждый день. Контрольные клетки культивировали свежей средой, содержащей ДМСО. Клетки собирают, следовательно, для ДНК /РНК извлечения.
<Р> В общей сложности 20 фиксированных формалином погруженных в парафин тканей блоков (10 желудочного рака тканей и 10 соседних нормальных тканей), а также суммарную РНК из 15 образцов желудочного дисплазия и 20 рака желудка хирургические образцы были получены из Xuanwu больницы, медицинского университета капитала в Пекине. Общую РНК и геномную ДНК, выделенную из взрослого человека нормальных тканей желудка были приобретены у Biochain (Hayward, Калифорния, США).

конструктов
ДНК <р> Topflash /Fopflash репортеры, содержащие дикого типа и мутантных TCF /LEF сайты связывания, соответственно, были любезно предоставлены доктором Yeguang Чен (университет Цинхуа, Пекин, Китай). Мутант CTNNB1 (S45Y) конструкт кДНК также любезно предоставленные доктором Yeguang Чен (Университет Цинхуа, Пекин, Китай). Рекомбинантные аденовирусные векторы, экспрессирующие Emx2 и вектор управления были приобретены у Vector Biolabs (Vector Biolabs, Burlingame, CA, USA).

Метилирование-специфической ПЦР (MSP) и бисульфит секвенирование (BS)
<р> бисульфита преобразование из тканей и клеток были выполнены без предварительного условия для очистки ДНК с использованием EZ метилирование ДНК-Direct Kit (Zymo, Orange, CA, USA). Ткани FFPE впервые были де-paraffinized в ксилоле (Sigma) и регидратации в градуированного этанола до бисульфита лечения в соответствии с инструкциями завода-изготовителя. Для МПВ, модифицированную ДНК амплифицируют с использованием праймеров MSP (перечислены ниже), которые специально признаны либо метилированных или неметилированные последовательности промотора EMX2 после бисульфита лечения. ПЦР проводили в конечном объеме 20 мкл, содержащем 1 × буфер MSP реакции [30], 0,5 мкМ каждого праймера и 1 ед Zymo <ЕМ> Taq-
™ ДНК-полимераза (Zymo). ПЦР состояние следующим образом: 10 мин при 95 ° C; 40 циклов 30 с при 95 ° С, 30 с при 50 ° С и 30 при температуре 72 ° С; и 7 мин окончательное удлинение при 72 ° С. Для БС, амплификации бисульфит-преобразованной ДНК проводили в конечном объеме 50 мкл, содержащем 1 мкМ каждого праймера и BS 2 Ед Zymo <ЕМ> Taq-
™ ДНК-полимераза. ПЦР состояние следующим образом: 10 мин при 95 ° C; 40 циклов 30 с при 95 ° С, 40 с при 55 ° С и 1 мин при 72 ° С; и 7 мин окончательное удлинение при 72 ° С. Продукты ПЦР были клонированы в PMD-18Т (Takara, Далянь, Китай). 5 или 3 случайно выбранных положительных клонов из каждой группы были секвенированы в Шанхай Invitrogen (Shanghai, China). Праймеры были следующими:
<р> MSP-M (вперед): 5'- TAGTTTTTTGTTCGTTTCGCGTTTC-3 '
<р> MSP-M (обратный): 5'- GAATTAAAATAAACGCCCCTACCGAC-3'
<р> MSP-U (вперед): 5'-GTTTTTTGTTTGTTTTGTGTTTTGA-3 '
<р> MSP-U (обратный): 5'-CCAAATTAAAATAAACACCCCTACCAAC-3'
<р> BS-A (вперед): 5 ' -GTTTGTAAATTTTTTTGGAAGGATTT-3 '
<р> BS-A (обратный): 5'-AACAAAAAACTATCCTTAACCACCA-3'
<р> BS-B (вперед): 5'-GGTTAGGGATTTTGTAGGGAT-3 '
<р> BS-B (обратный): 5'-AAAATCACATAAACAACTTCCTCC-3 '

Иммуногистохимия (IHC)
<р> IHC проводили в соответствии со стандартными протоколом. Антитела, используемые в исследовании, включали мыши против человеческого Ki67 (1:100; BD, Сан-Хосе, штат Калифорния, США) и мышь против человеческого EMX2 (1:500; Pierce, Rockford, IL, USA), и Alexa 594-конъюгированные антимышиного вторичное антитело (1:200, Invitrogen, Carlsbad, CA, США). Слайды были также контрастному hochest 33342 (Invitrogen). Цейсс LSM 710 конфокальной микроскопии (Оберкохен, Германия) использовали для изучения окрашивания. Интенсивность Ki67 была количественно с использованием изображения Pro® Plus. EMX2 окрашивание визуализируют с комплектом Histostain Плюс DAB (широкий спектр, Invitrogen), в соответствии с инструкциями завода-изготовителя, контрастному окрашиванию гематоксилином (Sigma), и фотографировали с помощью слайд-сканера Leica SCN400 (Leica, Германия).

анализа люциферазы
<р> Клетки при плотности 5 × 10 3 на лунку высевали в 24-луночные планшеты перед трансфекцией. Topflash или Fopflash плазмиды котрансфицируют с ПРЛ-TK плазмиды. После того, как клетки культивировали в течение 18 часов, активность люциферазы измеряли с помощью двойного Glo системы анализа люциферазы (Promega, Madison, USA). Соотношение между светлячка активности люциферазы (Topflash /Fopflash) и Renilla активности использовали для TCF /LEF транскрипционной активности.

иммуноблоттинг
<р> И общий белок (20 мкг) и цитоплазмы экстракты (40 мкг) были подвергнуты иммуноблоттинга. Первичные антитела включены анти-EMX2 (1:500; Pierce), анти-β-актина (1:5000; Сигма), анти-циклин D1 (1:500; BD) и анти-с-Мус (1:200; Santa Cruz Biotechnology, штат Калифорния, США).

Анализ пролиферации
<р> роста клеток определяли с помощью Celltiter 96 водную Анализ пролиферации Kit (Promega). Линии клеток высевали в 96-луночные культуральные планшеты с числом 5 × 10 ^{2 клеток /лунку. После того, как клетки культивировали в течение нескольких дней 0, 2, 3 и 4, решения MTS были добавлены в среду и инкубировали в течение 1,5 ч. Поглощение при 490 нм измеряли с использованием микропланшет-ридера модели 680 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).}

Colony Формирование анализа
<р> Клетки (1 × 10 3) инфицированных с аденовирусной вектора, экспрессирующего EMX2 или пустым вектором, высевали в трех повторах в 100-мм чашках. Свежую среду меняли каждые 3 дня. После культивирования в течение 3-4 недель, клетки фиксировали 4% параформальдегидом в течение 10 мин, промывали PBS, окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетовым в течение 20 мин и фотографировали.

Экстракция РНК и количественная в реальном времени с обратной транскрипцией -PCR (RT-PCR)
<р> Выделение РНК и в режиме реального времени RT-PCR проводили, как описано ранее [31]. Последовательности праймеров были описаны ранее [22].

Animal Model и аденовирусный вектор Доставка
<р> Все эксперименты были проведены мышей под конкретного патогена условиях в виварии Университета Цинхуа и утвержден институциональной Уход за животными и использование комитета университета Цинхуа. Желудочный ксенотрансплантаты рака были установлены в 5-недельных самок BALB /C голых мышей. Если коротко, то после того, как культивируют до слияния, MKN28 или AGS клетки trypisnized и повторно суспендируют в PBS (рН 7,4), а затем смешивают 1:01 (об /об) с Матригель (Энергичный) при 4 ° С, чтобы впрыснуть одну мышь в общем объеме 150 мкл. Смесь s.c впрыскивается в правый фланг 16 самок мышей с 10 7 клеток на мышь (день 0). На 7-й день мышей с местным опухоли колебалась от 50 до 100 мм 2 получил прямое интра-опухолевую инъекцию 1 × 10 9 бляшкообразующих единиц указанного аденовируса (разведенного PBS в общем объеме 100 мкл). Формирование опухоли наблюдали в течение до 1 ½ месяцев. Размер опухоли измеряли, используя штангенциркуль и определяется путем умножения на 0,5 × ширина 2 × длина. Метод Каплана-Мейера использовали для оценки выживаемости двух групп подопытных животных. При завершении эксперимента, опухоли от каждой обработки собирают в 10% забуференном формалине, заливали в парафин и разрезают на 5-мкм срезах для дальнейшего обнаружения Ki-67. Цитозольные белки и весь клеточный лизат были также извлечены из этих опухолей для Вестерн-анализа.

Статистический анализ
<р> Все данные были рассчитаны средние значения ± стандартные отклонения. Различия между группами по сравнению с Т-тест Двусторонний студента. A P значение 0,05
или менее считалось значимым.

Результаты

Подавление Emx2 в рака желудка человека
<р> Мы исследовали экспрессию Emx2 в девять желудка линий раковых клеток человека, а также опухоли и спаренные соседние нормальные ткани из десяти рака желудка пациентов (рисунок 1). Использование в режиме реального времени RT-PCR, мы обнаружили, что экспрессия Emx2 была значительно подавлена ​​в восьми из девяти клеточных линий исследовали по сравнению с, что в нормальной ткани желудка (P < 0,01, 1А). С другой стороны, одна линия клеток AZ521 показал аналогичный уровень экспрессии EMX2, что и в нормальном контроле (фиг.1А). Для того чтобы обнаружить EMX2 экспрессию белка в образцах пациента ткани, иммуногистохимии (IHC) была выполнена, и интенсивность окрашивания IHC количественно оценивали с помощью изображения Pro® Plus. Обнаружено, что все десять образцов анализировали выставляться либо отсутствие экспрессии Emx2 или снижение уровня экспрессии Emx2 в опухолевых тканях по сравнению с их нормальными аналогами (P < 0,01, Фигура 1В). Для того, чтобы установить возможную роль Emx2 в патологической прогрессии рака желудка человека, мы проанализировали Emx2 выражение, используя тотальную РНК, что полученные нами из пятнадцати образцов желудочного дисплазии и рака желудка двадцати хирургических образцов. Мы обнаружили, что экспрессия EMX2 была значительно подавлена ​​в образцах дисплазии (P &ЛТ; 0,05). И почти потеряли в образцах рака по сравнению с, что в ткани взрослого нормального желудка (рис 1C), предполагая, что EMX2 понижающей регуляции может происходить при неинвазивной предраковое стадии

Коррекция между Emx2 Expression и его метилирования промоторов статус

Мы исследовали статус метилирования промотора Emx2 в девяти желудочных линий раковых клеток и нормальной ткани желудка. Регионы CpG островов (CGI) были идентифицированы с MethPrimer от -800 до -470 и от -55 до 459 относительно ожидаемых сайтов инициации транскрипции (+1) гена Emx2 (рис 2А). статус метилирования анализируют с использованием бисульфита секвенирование (BS) (рис 2B) и специфической в ​​отношении метилирования ПЦР (МПВ) (Рисунки 2C-2D). Наша БС и результаты MSP, показали, что промотор EMX2 в нормальной ткани и клетки AZ521 желудочную неметилированная, в то время как в других восьми линий клеток исследовали его плотно метилированный (фигуры 2B-2C). Эти результаты согласуются с уровнями экспрессии EMX2 в этих клеточных линиях: высокие в нормальной ткани и AZ521, но низко в остальных восьми исследованных клеточных линий. Смесь денатурированного и неметилированной полосы были найдены в нескольких клеточных линиях, включая MKN28, N87 и SNU16 с указанием частичного метилирования. Кроме того, мы обнаружили, что статус метилирования образцов пациентов ткани, выявленных МПВ согласуется с уровнями экспрессии EMX2 в этих образцах (рис 2D, были исследованы четыре из десяти пар образцов ткани из-за отсутствия геномной ДНК из других шести пар ). Эти данные свидетельствуют о том, что подавление экспрессии Emx2 может быть результатом его промоутер гипер-метилирования при раке желудка.
<Р> Для дальнейшего исследования корреляции между экспрессией Emx2 и метилирования промотора, мы пролечили клеточные линии MKN28 и AGS с ингибитор метилтрансферазы DAC и ингибитор TSA гистондеацетилазы. Линия клеток AZ521 был использован в качестве отрицательного контроля в качестве промоторной области неметилирован. Мы наблюдали, что unmethylation удельная полоса была значительно увеличена (рис 3А) с уровнями экспрессии EMX2 активируемых соответственно (рис 3B) при обработке DAC в обоих AGS и клеток MKN28, тогда как в клетках AZ521 остались неизменными (рисунок 3). Лечение АСП имели минимальное воздействие на оба статуса метилирования и Emx2 уровней экспрессии. Взятые вместе, наши результаты убедительно свидетельствуют о понижающей регуляции экспрессии Emx2 значимо коррелировали с EMX2 гиперметилированием промотора в развитии рака желудка человека.

ингибирования роста клеток аденовирусом поставляемом Emx2 в пробирке
<р> Далее мы рассмотрели роль Emx2 на рост клеток желудка раковых клеток. Рост AGS и MKN28 клеток была значительно подавлена ​​при инфицировании аденовирус, экспрессирующий EMX2 (Ad-EMX2) по сравнению с пустым управлением вектором (Ad-Ctrl) (P &ЛТ; 0,001, рис 4, а), тогда как рост AZ521 клеток не была затронута (P > 0,05, рис 4А). Эти наблюдения были также подтверждены колониеобразования анализа (фиг.4В). Наши результаты демонстрируют функцию анти-пролиферативную Emx2 в желудочном раковых клеток

Подавление Wnt сигнального пути аденовирусом доставляемого EMX2
<р> Функция Emx2 была связана с Wnt сигнального пути. Поэтому мы изучили взаимосвязь между Emx2 и передачи сигналов Wnt при раке желудка. Мы использовали репортер анализа Topflash /Fopflash для измерения TCF /LEF-зависимой транскрипции активность регулируется каноническому Wnt пути. Мы обнаружили, что TCF /LEF-зависимой транскрипции активность была значительно ингибировалась Ad-EMX2 в AGS и MKN28 клетках, не имеющих эндогенную экспрессию EMX2 (P ≪ 0,05), но не в AZ521 клетках, экспрессирующих эндогенный EMX2 (P &GТ; 0,05, рис 5А). Последовательно, уровни белка цитозольного -катенина и канонического Wnt пути нижестоящих мишеней с-Мус и циклин D1 были подавлены в этих AGS и клеток MKN28 инфицированных Ad-Emx2, но не в AZ521 клетках (восстановление экспрессии Emx2 в этих клеточных линиях после того, как Ad-EMX2 инфекция была подтверждена с помощью Вестерн) (фиг.5В). Для дальнейшего изучения актуальности Wnt пути вниз регулирования и подавления пролиферации Ad-Emx2, мы трансфецировали и выразили стабилизированный -катенин (S45Y мутации) в этих клеток рака желудка, инфицированных Ad-Emx2. Мы наблюдали, что сверхэкспресирующим -катенином значительно ослабляется эффект подавления роста Ad-EMX2 в обоих AGS и клеток MKN28 (P &ЛТ; 0,01), но не в клетках AZ521 (5С). В совокупности эти результаты подтверждают важную роль Emx2 в подавлении Wnt пути при раке желудка.

Подавление роста рака желудка с помощью аденовируса поставляется Emx2 в естественных условиях

Мы создали MKN28 и AGS ксенотрансплантата модели для изучения терапевтический потенциал аденовирусной доставлен Emx2 для рака желудка в естественных условиях
. Через одну неделю после инокуляции мышей, несущих локальные опухоли в пределах от 50 до 100 мм ^{2 получил прямое внутриопухолевой инъекцию 1 × 10 9 бляшкообразующих единиц указанного аденовируса. Рост опухолей в Ad-Emx2 инфицированных мышей были значительно медленнее, чем в контрольной группе (P < 0,05, 6А оставили две панели). При завершении эксперимента опухолевой массы в Ad-EMX2 инфицированных мышей также значительно меньше, чем в контрольной группе (Р &ЛТ; 0,05 для опухоли MKN28, P &ЛТ; 0,01 опухолевыми клетками AGS, 6А правая панель). Окрашивание Интенсивность пролиферативного маркера Ki67 опухолевых образцов при завершении эксперимента показали, что поставка Ad-Emx2 значительно уменьшил Ki-67 окрашивания (P &лт; 0,01, рис 6В), указывая ингибирование пролиферации клеток в опухолях. Кроме того, выживаемость Ad-EMX2 инфицированной группе была значительно выше, чем у контрольной группы (P = 0,014, 6С). В соответствии с нашим в пробирке
анализ, цитозольного β-катенина и канонические Wnt тропинка нижестоящие мишени с-Мус и циклин D1 также подавляются в Ad-Emx2 инфицированных MKN28 и AGS опухолей (восстановление экспрессии Emx2 в них в естественных условиях опухолей также была подтверждена с помощью Вестерн) (рис 6D). Взятые вместе, наши результаты демонстрируют терапевтический потенциал аденовирусной доставлен Emx2 для лечения рака желудка.}

Обсуждение
<р> гены Гомеобоксные были хорошо известны его значение в развитии на протяжении десятилетий, в то время как исследование эти гены во время онкогенеза все еще находится в зачаточном состоянии. Аберрантных выражения гена гомеобоксный были зарегистрированы в различных онкологических заболеваний [32], [33], с указанием изменений hemeobox выражений может иметь важное значение для онкогенеза. Это может обеспечить молекулярную основу для потенциальных клинических применений. Тем не менее, несколько фундаментальных вопросов все еще должны быть полностью решены, в том числе и молекулярные механизмы, которые управляют аберрантную экспрессии и вниз по течению цели и сигнальных путей, которые способствуют онкогенеза. В данном исследовании мы предлагаем взглянуть на эти вопросы, исследуя Emx2 в развитии рака желудка человека.
<Р> Наше исследование показало значительное снижение и потерю экспрессии Emx2 в желудочном линиях раковых клеток и первичных опухолевых тканях, и показал, что понижающей была достоверно коррелировали с гипер-метилирования промотора Emx2, предлагая эпигенетическую глушителей в качестве важного механизма для Emx2 дизрегуляцией при раке желудка человека. В самом деле, эпигенетическое модификация была предложена в качестве ключевого механизма, ответственного за гомеобоксных генов понижающей или глушителей в других типах тканей рака, где эти гены функционируют в супрессии опухолей [14], [32]. Более того, наше наблюдение Emx2 dowregulation в неинвазивной желудочной дисплазии поддерживает возможную важную роль Emx2 в патологической прогрессии рака желудка человека. Одним из ограничений нашего исследования является количество образцов тканей анализируемых. Большее количество образцов пациентов необходимо изучить для дальнейшей проверки нахождение метилирования-молчанию Emx2 при раке желудка. Тем не менее, наши результаты дают первое прямое доказательство, чтобы поддержать этот механизм в развитии рака желудка и идентифицировать Emx2 как мнимого романа супрессоров опухоли при раке желудка.
<Р> Кроме того, мы исследовали важные онкогенные пути, через которые EMX2 функционировали при раке желудка , и обнаружили, что сигнальный путь Wnt может играть ключевую роль посредническую функцию Emx2. Мы показано в анализах пролиферации, что высокий уровень экспрессии экзогенной EMX2 значительно подавлена ​​рост желудочных линий раковых клеток, не имеющих экспрессию эндогенного гена (AGS и MKN28 клетки), в соответствии с предыдущими сообщениями, что разница в экспрессии EMX2 отрицательно коррелирует с распространением в других типах клеток рака [ ,,,0],24], [25]. Мы также показали, что Wnt сигнальный путь был значительно тормозится Emx2 в естественных условиях
и в пробирке
, обеспечивая новые доказательства, что сигнальный путь Wnt может опосредовать функцию Emx2 рака, как предполагалось ранее [22 ].
<р> Наконец, наши результаты показывают потенциал использования EMX2 генной терапии для лечения рака желудка. Заражение опухолей с Ad-Emx2 значительно подавлена ​​пролиферацию и что еще более важно, улучшение общей выживаемости. Следует отметить, что система доставки мы использовали для лечения рекомбинантный аденовирус серотипа 5 (Ad5), наиболее часто используемым вектором в нескольких типах генной терапии рака [11], [12], [34], [35]. По сравнению с аденоассоциированного Viral (AAV) и ретровирусных системах доставки, аденовирусные векторы, такие как Ad5, очевидно, имеют много преимуществ. Например, аденовирусные векторы имеют широкий тропизм, позволяющий эффективно нацеливание на многих тканях, представляющих интерес, большой грузоподъемности и высокой трансдукции эффективности по отношению к системе AAV [10], а также неинтегрирующих характеристики, которые в противном случае вызвать риск случайного мутагенеза генома [ ,,,0],10], [36] [36], [37], [38]. Кроме того, аденовирусные векторы могут быть сконструированы для рака селективного онколитических вирусов [39], [40], [41], которые имеют решающее значение для клинического применения генной терапии рака. Тем не менее, есть еще много проблем использования аденовирусных векторов для доставки генной терапии у пациентов. Например, они могут быть быстро потеряли из клеток, которые делятся быстро после заражения. Другие факторы, влияющие на клиническое применение аденовирусного поставки включают в себя емкость упаковки и круг хозяев аденовирусных векторов, их генный профиль экспрессии и тенденцию вызывать иммунные реакции, что особенно важно, если повторное введение требуется [42], [43]. Тем не менее, наш В естественных условиях
исследование Ad-Emx2 инфекции позволяет предположить, что ген EMX2 терапия может иметь потенциал, чтобы стать клинический противоопухолевый терапевтической стратегией для лечения рака желудка в будущем.

• PLoS ONE: Дифференциальная экспрессия фосфолипазы С Эпсилон 1 связан с хронический атрофический гастрит и Желудо…
• PLoS ONE: Сайленсинг XB130 связан как с прогнозом и химиочувствительность Желудочный Cancer