Achtergrond
EMX2 is een menselijke ortholoog van de Drosophila Resultaten In deze studie hebben we gemeld dat de down-regulatie van EMX2 expressie was significant gecorreleerd met de EK MX2 promotor hypermethylering bij maagkanker. Herstellen EMX2 expressie middels een adenovirus afgiftesysteem bij maagkanker cellijnen ontbreekt EMX2 endogene expressie leidde tot remming van celproliferatie en Wnt signaling pathway zowel in vitro als in een maagkanker xenograft model in vivo. Daarnaast hebben we vastgesteld dat dieren behandeld met de adenovirale expressievector EMX2 hadden significant betere overleving dan behandeld met lege adenovirale vector. Onze studie suggereert dat EMX2 is potentieel tumor suppressor in menselijke maagkanker. De adenovirale-EMX2 kan potentieel als nieuwe gentherapie voor de behandeling van patiënten met maagkanker hebben Citation:. Li J, M Mo, Chen Z, Chen Z, Q Sheng, Mu H, et al. (2012) Adenovirale Levering van de EMX2 Gene onderdrukt groei in Human maagkanker. PLoS ONE 7 (9): e45970. doi: 10.1371 /journal.pone.0045970 Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan Ontvangen: 13 april 2012; Aanvaard: 23 augustus 2012; Gepubliceerd: 21 september 2012 Copyright: © Li et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd Financiering:. Dit werk werd ondersteund door fondsen van de National Key Basic Research and Development (973) Program van China (2011CB910800 en 2012CB917304), de National Natural Science Foundation of China (31.170.732), de Natural Science Foundation van de provincie Zhejiang (Y2101329), en de Postdoctorale Science Stichting van de provincie Zhejiang (2010-BSH-031). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan Introductie Maagkanker is de vierde meest voorkomende vorm van kanker en de tweede meest voorkomende oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen in de wereld [1], [2], [3]. Hoewel de wereldwijde incidentie is gedaald, het aantal gevallen nog steeds hoog in de Aziatische landen [2], [4], [5]. De meeste van maagkanker patiënten worden gediagnosticeerd in gevorderde stadia [6]. Ondanks verbetering behandelingsstrategieën [7], [8], 5-jaars overleving van patiënten met gevorderde maagkanker die conventionele therapieën ontvangen nog steeds minder dan 30% [4]. Derhalve zijn alternatieve benaderingen dringend nodig. Gentherapie, waaronder virale en niet-virale gen-afgiftesysteem is een veelbelovende benadering voor kankerbehandeling [9]. Van alle momenteel beschikbare systeem, recombinant adenovirus (Ad) vectoren zijn bijzonder veelbelovend. De voordelen van Ad vectoren omvatten het vermogen om hoge titers te produceren vermogen tot infectie efficiënt delende en niet-delende cellen, genoom stabiliteit en lage niveaus van DNA integratie in het gastheergenoom [9], [10]. Vermeld is dat het herstel van genen die met deze aanpak leidt tot tumorregressie en induceert apoptose In vivo EMX2, het menselijk ortholoog van de Drosophila Recente studies suggereren mogelijke betrokkenheid van de EK MX2 in menselijke kankers [22], [23], [24], [25]. Zo heeft EMX2 aangetoond als tumor suppressor in longkanker en lage EMX2 expressie is geassocieerd met een verminderde totale overleving en ziektevrije overleving bij patiënten met longadenocarcinomen [22], [23]. Het is ook gemeld dat EMX2 expressie overvloedig aanwezig in normaal endometrium van vrouwen na de menopauze, maar afwezig of verlaagd baarmoederslijmvliestumoren en EMX2 niveaus zijn negatief gecorreleerd met proliferatie [24], [25]. Bovendien EMX2 kan het ontstaan van tumoren te reguleren door middel van Wnt signaleringsroute, een kritische route reguleren lot van de cel bepalen, de ontwikkeling van weefsel en het ontstaan van tumoren [26], [27], [28]. EMX2 wordt gevonden als een directe repressor van Wnt1 expressie en kloppen-down van EMX2 gen induceert ectopische expressie van Wnt1 in de ontwikkelingslanden telencephalon en corticale dysplasie [29]. Epigenetische van de EMX2 expressie kan belangrijk afwijkende activatie van de Wnt signalering bij longkanker, en daaropvolgende proliferatie en metastase [22] zijn. De functie van EMX2 tijdens tumorigenese en bijbehorende mechanisme moeten verder worden toegelicht. In deze studie rapporteren we EMX2 als potentieel tumor suppressor in menselijke maagkanker. We tonen de EMX2 downregulatie en zijn correlatie met methylatiestatus van het gen promotergebied bij maagkanker. We tonen ook aan dat het herstel van EMX2 gebruik van een adenovirale afgiftesysteem remt celproliferatie en Wnt-signalering In vitro Verklaring Ethiek Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van Xuanwu Hospital, Hoofdstad Medische Universiteit in Beijing. Een schriftelijke geïnformeerde toestemming door de ethische commissie goedgekeurd, werd verkregen voor elke patiënt voorafgaand aan weefselspecimen collectie. Human maagkanker cellijnen (AZ521, AGS en MKN28) werden verkregen uit China Center for Type Culture Collection (Wuhan, China). Cellijnen werden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium gesupplementeerd met 10% foetaal runderserum, penicilline en streptomycine bij 37 ° C in een vochtige incubator met 5% CO 2. Het herstel van EMX2 gen te analyseren, werden cellen behandeld met 4 uM DAC of 300 nM TSA (Sigma, St. Louis, USA) gedurende 4 dagen, met vervanging van vers medium met dezelfde dosis DAC of TSA dagelijks. Controle cellen werden gekweekt met vers medium met DMSO. Cellen werden geoogst bijgevolg voor DNA /RNA-extractie. Totaal 20 met formaline gefixeerde in paraffine ingebedde weefsels blokken (10 maagkanker weefsels en 10 aangrenzend normaal weefsel), en totaal RNA van 15 gastrische dysplasie monsters en 20 maagkanker chirurgische monsters werden verkregen van Xuanwu Hospital, Hoofdstad Medische Universiteit in Beijing. Totaal RNA en genomisch DNA geëxtraheerd uit humane volwassen normale gastrische weefsels werden verkregen van BIOCHAIN (Hayward, CA, USA). Topflash /Fopflash reporters die wildtype en mutante TCF /LEF bindingsplaatsen respectievelijk werden vriendelijk verschaft door Dr. Yeguang Chen (Tsinghua University, Beijing, China). Een mutant CTNNB1 (S45Y) cDNA construct werd ook vriendelijk verschaft door Dr. Yeguang Chen (Tsinghua University, Beijing, China). Recombinante adenovirus vectoren die EMX2 en de controlevector werden aangekocht bij Vector Biolabs (Vector Biolabs, Burlingame, CA, USA). de bisulfiet conversie van weefsels en cellen werden uitgevoerd zonder de vereiste voor DNA-zuivering met gebruik van EZ DNA methylatie-Direct Kit (Zymo, Orange, CA, USA). De FFPE weefsels werden eerst-de paraffinized in xyleen (Sigma) en gerehydrateerd in gegradeerde ethanol vóór bisulfiet behandeling volgens de instructies van fabrikant. Voor MSP, gemodificeerd DNA versterkt met behulp van MSP primers (zie hieronder) die speciaal ofwel de gemethyleerde of niet-gemethyleerde EMX2 promoter sequenties na bisulfiet behandeling herkend. PCR werd uitgevoerd in een eindvolume van 20 ul bevattende 1 x MSP reactiebuffer [30], 0,5 pM van elke primer en 1 U van Zymo Taq DNA Polymerase MSP-M (vooruit): 5'TAGTTTTTTGTTCGTTTCGCGTTTC-3 ' MSP-M (achteruit): 5'GAATTAAAATAAACGCCCCTACCGAC-3' MSP-U (forward): 5'-GTTTTTTGTTTGTTTTGTGTTTTGA-3 ' MSP-U (achteruit): 5'-CCAAATTAAAATAAACACCCCTACCAAC-3' BS-A (vooruit): 5 ' -GTTTGTAAATTTTTTTGGAAGGATTT-3 ' BS-A (achteruit): 5'-AACAAAAAACTATCCTTAACCACCA-3' BS-B (forward): 5'-GGTTAGGGATTTTGTAGGGAT-3 ' BS-B (achteruit): 5'-AAAATCACATAAACAACTTCCTCC-3 ' Immunohistochemie (IHC) IHC werd uitgevoerd volgens standaard protocol. Antilichamen die in de studie werden muizen anti-humaan Ki67 (1:100, BD, San Jose, CA, USA) en muis anti-humaan EMX2 (1:500; Pierce, Rockford, IL, USA) en Alexa 594-geconjugeerde geit anti-muis secundair antilichaam (1:200, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Dia's werden ook tegengekleurd met hochest 33342 (Invitrogen). Zeiss LSM 710 confocale microscoop (Oberkochen, Duitsland) werd gebruikt voor de kleuring onderzocht. De intensiteit van Ki67 werd gekwantificeerd middels Image Pro® Plus. EMX2 kleuring werd gevisualiseerd met Histostain Plus DAB kit (breedspectrum Invitrogen) volgens de instructies van de fabrikant, tegengekleurd met hematoxyline (Sigma) en gefotografeerd met behulp van een Leica SCN400 diascanner (Leica, Duitsland). Cellen met een dichtheid van 5 x 10 3 per putje gezaaid in 24-well platen voor transfectie. Topflash of Fopflash plasmiden werden gecotransfecteerd met plasmide PRL-TK. Nadat de cellen werden gekweekt gedurende 18 uur, werd de luciferaseactiviteit gemeten met Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, Madison, USA). De verhouding tussen de vuurvlieg luciferase-activiteit (Topflash /Fopflash) en Renilla activiteit werd gebruikt voor de TCF /LEF transcriptie activiteit. Beide totaal eiwit (20 ug) en cytoplasma-extracten (40 ug) werden onderworpen aan immunoblotting. De primaire antilichamen opgenomen anti-EMX2 (1:500, Pierce), anti-β-actine (1:5000, Sigma), anti-cycline D1 (1:500, BD) en anti-c-Myc (1:200; santa Cruz Biotechnology, CA, USA). Proliferation Assay De celgroei werd bepaald met CellTiter 96 Aqueous Proliferation Assay Kit (Promega). De cellijnen werden uitgeplaat in 96-well kweekplaten met het aantal van 5 x 10 2 cellen /putje. Nadat de cellen werden gedurende dagen 0, 2, 3 en 4 werden de MTS oplossing aan het medium toegevoegd en gedurende 1,5 uur. De absorptie bij 490 nm werd gemeten met microplaat reader model 680 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Cellen (1 x 10 3) geïnfecteerd met adenovirale vector die EMX2 of lege vector werden gezaaid in drievoud in 100-mm gerechten. Vers medium werd elke 3 dagen vervangen. Na gekweekt gedurende 3-4 weken werden de cellen gefixeerd met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten, gewassen met PBS, gekleurd met 0,1% kristalviolet gedurende 20 min en gefotografeerd. RNA-extractie en real-time RT-PCR werden uitgevoerd zoals eerder beschreven [31]. De primer sequenties werden eerder beschreven [22]. Alle muizen experimenten werden uitgevoerd onder specifieke pathogeen-vrije omstandigheden in dierlijke faciliteit van de Tsinghua Universiteit en door de Institutional goedgekeurd Animal Care en gebruik Comite van de Tsinghua Universiteit. Maagkanker xenotransplantaten werden gevestigd in 5 weken oude vrouwelijke BALB /c naakt muizen. Kort na gekweekt tot confluentie, MKN28 of AGS cellen trypisnized en geresuspendeerd in PBS (pH 7,4) en vervolgens gemengd 01:01 (v /v) met Matrigel (krachtige) bij 4 ° C een muis geïnjecteerd in een totaalvolume van 150 pl. Het mengsel werd s.c. geïnjecteerd in rechterflank van 16 vrouwelijke muizen met 10 7 cellen per muis (dag 0). Op dag 7, muizen die lokale tumoren varieerde 50-100 mm 2 kreeg een directe intratumorale injectie van 1 x 10 9 plaquevormende eenheden van de vermelde adenovirus (verdund met PBS in een totaal volume van 100 ui). De tumorvorming werd gedurende maximaal 1½ maanden. De tumorgrootte werd gemeten met klauw en bepaald door vermenigvuldiging met 0,5 x breedte 2 × lengte. De Kaplan-Meier-methode werd gebruikt om de overleving van de twee groepen van behandelde dieren schatten. Bij voltooiing van het experiment, de tumoren van elke behandeling werden in 10% gebufferde formaline, ingebed in paraffine en in 5 urn dikke plakken voor verdere Ki-67 detectie gesneden. Cytosolische eiwitten en hele cellysaat werden ook geëxtraheerd uit die tumoren voor Western-analyse. Alle gegevens werden berekend als gemiddelden ± standaarddeviaties. Verschillen tussen groepen werden vergeleken met t-test een tweezijdige student. Een P negatieve regulatie van de EK MX2 in Human MaagKanker We hebben gekeken naar EK MX2 meningsuiting in negen menselijke maagkanker cellijnen, evenals tumor en gekoppeld aangrenzend normaal weefsel van tien maagkankerpatienten (figuur 1). Met behulp van real time RT-PCR, vonden we dat expressie van EMX2 significant was downgereguleerd in acht van de negen onderzochte cellijnen in vergelijking met die in normaal maagweefsel (P < 0,01, figuur 1A). Anderzijds, een cellijn AZ521 vertoonden vergelijkbare niveau van expressie EMX2 als in normale controle (Figuur 1A). Om EK MX2 eiwitexpressie in patiënten weefselmonsters te detecteren, immunohistochemie (IHC) werd uitgevoerd en de intensiteit van IHC kleuring werd gekwantificeerd door Image Pro ® Plus. Alle tien geanalyseerde monsters bleken ofwel gebrek aan EMX2 expressie vertonen of verlaagde niveaus van EK MX2-expressie in kanker weefsels in vergelijking met hun normale tegenhangers (P < 0,01, Figuur 1B). Om de mogelijke rol van EK MX2 in pathologische progressie van menselijke maagkanker stellen, analyseerden we EMX2 expressie met behulp van totaal RNA dat wij van vijftien gastrische dysplasie en twintig monsters maagkanker chirurgische monsters. We vonden dat EMX2 expressie was significant neerwaarts gereguleerd in dysplasie monsters (P < 0,05). En bijna verloren in monsters van kanker vergeleken met die bij volwassen normale maag weefsel (figuur 1C), wat suggereert dat EMX2 downregulatie kunnen optreden tegen niet-invasieve voorstadia stadium Correctie tussen EMX2 Expression en zijn promotor-methylering Status We onderzocht methylatie status van de EMX2 promotor in negen maagkanker cellijnen en normale maag weefsel. Gebieden van CpG eilanden (CGI) geïdentificeerd met MethPrimer van -800 tot -470 en -55 tot 459 ten opzichte van de verwachte transcriptiestartplaatsen (1) van EMX2 gen (Figuur 2A). Methyleringsstatus werd geanalyseerd met bisulfiet sequencing (BS) (figuur 2B) en methylatie-specifieke PCR (MSP) (figuren 2C-2D). Onze BS en MSP resultaten toonden aan dat de EMX2 promotor in normaal maagweefsel en AZ521 cellen was gemethyleerd, terwijl in de andere acht onderzochte cellijnen werd dicht gemethyleerd (Figuren 2B-2C). Deze resultaten zijn consistent met de EMX2 expressieniveaus in deze cellijnen: hoog in normaal weefsel en AZ521, maar laag in de andere acht onderzochte cellijnen. Een mengsel van gemethyleerd en niet-gemethyleerd band werd gevonden in een aantal cellijnen waaronder MKN28, N87, en SNU16 aangeeft gedeeltelijke methylatie. Bovendien vonden we dat methylatie status van de patiënt weefselmonsters onthuld door MSP is met de EMX2 expressieniveaus in deze monsters (figuur 2D, vier van de tien paren weefselmonsters werden onderzocht door onbeschikbaarheid van genomisch DNA van de andere zes paren ). Deze gegevens suggereren dat de neerwaartse regulatie van EMX2 expressie resultaat van zijn promotor hyper-methylering bij maagkanker kan zijn. Om verder te onderzoeken de correlatie tussen EMX2 meningsuiting en het promoter methylatie, we behandeld MKN28 en AGS cellijnen met een methyltransferase-remmer DAC en een histondeacetylaseremmer TSA. Cellijn AZ521 werd gebruikt als een negatieve controle als promotergebied is gemethyleerd. We zagen dat de unmethylation specifieke band was significant verhoogd (Figuur 3A) met EMX2 expressieniveaus opgereguleerd dienovereenkomstig (figuur 3B) na behandeling in beide DAC AGS en MKN28 cellen, terwijl die in AZ521 cellen bleven onveranderd (figuur 3). De behandeling van TSA had minimale effecten op zowel methylatie status en EMX2 expressie niveaus. Bij elkaar genomen, onze resultaten suggereren sterk de down-regulatie van EMX2 expressie was significant gecorreleerd met de EMX2 promotor hypermethylering in menselijke maagkanker. Remming van celgroei door adenovirus-geleverde EK MX2 in vitro we vervolgens onderzochten de rol van EMX2 op celgroei van maagkanker cellen. De groei van AGS en MKN28 cellen werd significant onderdrukt na infectie met adenovirus EMX2 (Ad-EMX2) vergeleken met een lege vectorcontrole (Ad-ctrl) (P < 0,001, Figuur 4A), terwijl de groei van AZ521 cellen niet werd aangetast (P > 0,05, Figuur 4A). Deze waarnemingen werden bevestigd door kolonievorming assay (figuur 4B). Onze resultaten tonen aan de anti-proliferatie functie van de EK MX2 in maagkanker cellen Onderdrukking van de Wnt signaleringsroute door adenovirus-geleverde EMX2 De functie van EMX2 is gekoppeld aan Wnt signaleringsroute.; Daarom bestudeerden we de relatie tussen EMX2 en Wnt-signalering bij maagkanker. We gebruikten een Topflash /Fopflash reporter test om TCF /LEF-afhankelijke transcriptie activiteit gereguleerd door Wnt pathway meten. We vonden dat TCF /LEF-afhankelijke transcriptieactiviteit aanzienlijk werd geremd door Ad-EK MX2 in AGS en MKN28 cellen zonder endogene EMX2 expressie (P <0,05), maar niet in AZ521 cellen die endogeen EMX2 (P > 0,05, Figuur 5A). Consequent, eiwitniveaus cytosolisch β-catenine en Wnt route achter targets c-myc en cycline D1 onderdrukt deze AGS en MKN28 cellen geïnfecteerd met Ad-EMX2, maar niet in AZ521 cellen (herstel van EK MX2 expressie in deze cellijnen na ad-EMX2 infectie werd bevestigd door Western) (Figuur 5B). De relevantie van Wnt route verder te onderzoeken neerwaartse regulatie en proliferatie bestrijding door Ad-EMX2 wij getransfecteerd en tot expressie gestabiliseerd β-catenine (S45Y mutatie) in deze maagkanker cellen geïnfecteerd met Ad-EMX2. We vonden dat overexpressie van β-catenine de groeionderdrukking effect van Ad-EK MX2 aanzienlijk verzwakt in zowel AGS en MKN28 cellen (P < 0,01), maar niet in AZ521 cellen (Figuur 5C). Tezamen bieden deze resultaten ondersteunen een belangrijke rol van het EK MX2 in onderdrukking van de Wnt-route bij maagkanker. Onderdrukking van maagkanker Groei door adenovirus-geleverde EK MX2 in vivo We vestigde de MKN28 en AGS xenograft modellen om het therapeutisch potentieel van adenovirus geleverde EMX2 voor maagkanker verkennen in vivo Discussie Homeobox genen zijn bekend om zijn belang in de ontwikkeling van tientallen jaren, terwijl de studie van deze genen tijdens oncogenese is nog in de kinderschoenen. Afwijkende homeobox gen uitdrukkingen zijn gedocumenteerd in diverse vormen van kanker [32], [33], met vermelding van de veranderingen van hemeobox uitdrukkingen belangrijk voor oncogenese zou kunnen zijn. Dit kan een moleculaire basis voor potentiële klinische toepassingen. Echter, een aantal fundamentele vragen moeten nog volledig worden aangepakt, met inbegrip van de moleculaire mechanismen die de afwijkende expressie te rijden, en downstream targets en signaalwegen die oncogenese te promoten. In dit onderzoek geven wij inzicht in de volgende vragen van onderzoeken EK MX2 in menselijke maagkanker. Ons onderzoek een significante afname en verlies van EMX2 expressie in maagkanker cellijnen en primaire tumorweefsels, en toonde aan dat de downregulatie was significant gecorreleerd met hyper-methylatie van de promoter EMX2 suggereert epigenetische als een belangrijk mechanisme voor EMX2 ontregeling in menselijke maagkanker. Inderdaad, epigenetische modificatie voorgesteld als een belangrijk mechanisme belast homeobox genen neerwaartse regulatie of inactivatie bij andere vormen van kanker weefsel, wanneer deze genen functioneren in tumorsuppressie [14], [32]. Bovendien onze waarneming van EK MX2 dowregulation in niet-invasieve gastrische dysplasie ondersteunt een mogelijke rol van EK MX2 in pathologische progressie van menselijke maagkanker. Een beperking van onze studie is het aantal weefselmonsters geanalyseerd. Een groter aantal patiënten monsters moeten worden onderzocht om de vondst van methylatie-silencing van het EK MX2 in maagkanker verder te valideren. Niettemin onze resultaten geven een eerste directe bewijs dit mechanisme bij maagkanker ondersteunen en identificeren EMX2 als een mogelijke nieuwe tumor suppressor bij maagkanker. Verder onderzochten wij belangrijke oncogene routes waarlangs EK MX2 functioneerde bij maagkanker , en vond dat Wnt signaleringsroute een belangrijke rol bemiddelen de EMX2 functie kunnen spelen. We geïllustreerd in proliferatie testen die hoge expressie van exogeen EMX2 aanzienlijk onderdrukte groei van maagkanker cellijnen ontbreekt endogene genexpressie (AGS en MKN28 cellen), in overeenstemming met eerdere berichten dat verschil in EMX2 expressie is negatief gecorreleerd met de proliferatie in andere vormen van kanker cellen [ ,,,0],24], [25]. We hebben ook aangetoond dat Wnt signaleringsroute dramatisch werd geremd door EMX2 In vivo Kopen en In vitro Tenslotte geven de resultaten aan mogelijkheden voor het gebruik EMX2 gentherapie voor de behandeling van maagkanker. Infectie van tumoren met Ad-EMX2 onderdrukt significant de proliferatie en vooral verbeterde totale overleving. Het is opmerkelijk dat het afgiftesysteem we voor de behandeling was recombinant adenovirus serotype 5 (Ad5), de meest gebruikte vector bij verschillende soorten kanker gentherapie [11], [12], [34], [35]. Vergeleken met adeno geassocieerde virale (AAV) en retrovirale systemen, adenovirale vectoren, zoals Ad5 duidelijk hebben veel voordelen. Bijvoorbeeld adenovirale vectoren brede tropisme waardoor efficiënte targeting in vele weefsels van belang, een groot laadvermogen en hoge transductie efficiëntie ten opzichte van AAV stelsel [10] en een niet-integrerende eigenschappen die anders het risico van willekeurige mutagenese van het genoom [induceren ,,,0],10], [36] [36], [37], [38]. Bovendien kunnen adenovirale vectoren worden ontworpen om kanker-selectieve oncolytische virussen [39], [40], [41], die kritisch zijn voor klinische toepassing van kanker gentherapie. Er zijn echter nog vele uitdagingen met adenovirale vectoren voor gentherapie bij patiënten leveren. Zo kunnen ze snel verloren uit cellen die snel na infectie verdelen. Andere factoren die de klinische toepassing van adenovirale afgifte omvatten verpakkingscapaciteit en gastheerbereik van adenovirale vectoren, het genexpressieprofiel en neiging tot immuunreacties, vooral van belang als herhaalde toediening nodig is [42], [43]. Niettemin onze In vivo studie van
lege siphonen homeobox gen dat is betrokken bij de embryogenese. Recente studies suggereren mogelijke betrokkenheid van de EK MX2 in menselijke kankers; Echter, de rol van de EK MX2 in carcinogenese moet verder worden onderzocht.
Conclusie
zonder dat de normale weefsels [11], [12], [13].
lege siphonen (eMS) homeobox gen behoort tot de homeobox genfamilie die transcriptionele regulerende eiwitten (Homeoprotein) essentieel is voor veel aspecten van groei en differentiatie [14] codeert. EMX2 speelt een belangrijke rol tijdens de hersenen [15] en de ontwikkeling van het skelet [16]. Muizen die homozygote EMX2 mutaties vertonen dramatisch verkleinen van staartvin-mediale gebieden, waaronder occipitale cortex en de hippocampus [17], [18], [19]. Verstoring van EMX2 expressie kan de verspreiding snelheid van volwassen neurale stamcellen [20] te wijzigen. EMX2 controleert ook zoogdieren reproductie door het aanpassen van endometriumproliferatie cel zonder het uitvoeren van differentiatie [21].
, en resulteert in een betere overleving van een maagkanker xenograft model In vivo
. Onze gegevens suggereren sterk de therapeutische mogelijkheden van het gebruik van de Ad-EMX2 als gentherapie voor de toekomstige behandeling van patiënten met maagkanker.
Materialen en methoden
Cell Culture, 5-aza-2'-deoxycytidine (DAC) /trichostatine A (TSA) behandeling, en tissue Monsters
DNA constructen
methylering-specifieke PCR (MSP) en bisulfietsequencing (BS)
™ (Zymo). PCR conditie was als volgt: 10 min bij 95 ° C; 40 cycli van 30 s bij 95 ° C, 30 s bij 50 ° C en 30 bij 72 ° C; en 7 minuten laatste verlenging bij 72 ° C. BS, amplificatie van bisulfiet-geconverteerde DNA werd uitgevoerd in een eindvolume van 50 ul bevattende 1 pM elk BS primer en 2 U van Zymo Taq DNA Polymerase
™. PCR conditie was als volgt: 10 min bij 95 ° C; 40 cycli van 30 s bij 95 ° C, 40 s bij 55 ° C en 1 minuut bij 72 ° C; en 7 minuten laatste verlenging bij 72 ° C. De PCR-producten werden gekloond in PMD-18T (Takara, Dalian, China). 5 of 3 willekeurig gekozen positieve klonen uit elke groep werd de sequentie in Shanghai Invitrogen (Shanghai, China). Primers waren als volgt:
Luciferase Assay
Immunoblottingtest
Kolonie Formatie Assay
RNA-extractie en kwantitatieve real-time reverse transcriptie -PCR (RT-PCR)
Animal Model en adenovirale vector Delivery
Statistische analyse
waarde van 0,05 of minder werd beschouwd als significant.
Resultaten
. Een week na inoculatie muizen die lokale tumoren van 50 tot 100 mm 2 ontvingen een directe intratumorale injectie van 1 x 10 9 plaquevormende eenheden van de aangegeven adenovirus. Groei van tumoren in Ad-EMX2 geïnfecteerde muizen waren beduidend langzamer dan die in de controle groep (P < 0,05, figuur 6A liet twee panelen). Na afronding van het experiment tumormassa in Ad-EMX2 geïnfecteerde muizen ook aanzienlijk lager dan die in de controle groep (P < 0,05 voor MKN28 tumor, P < 0,01 voor AGS tumor, figuur 6A rechter paneel). Kleuring intensiteit van een proliferatieve marker Ki67 van de tumor specimens bij oplevering van het experiment toonde aan dat de levering van Ad-EMX2 aanzienlijk verminderd de Ki-67 kleuring (P < 0,01, figuur 6B), wat suggereert celproliferatie remming in tumoren. Bovendien overleving van de Ad-geïnfecteerde EMX2 was significant beter dan die van de controlegroep (p = 0,014, figuur 6C). In overeenstemming met onze In vitro
analyse, cytosolische β-catenine en Wnt pathway downstream targets c-myc en cycline D1 werden ook neerwaarts gereguleerd in Ad-EMX2 geïnfecteerde MKN28 en AGS tumoren (herstel van het EK MX2-expressie in deze in vivo tumoren werd bevestigd door Western) (figuur 6D). Bij elkaar genomen, onze resultaten tonen een therapeutisch potentieel van adenovirus-geleverde EMX2 voor de behandeling van maagkanker.
, die verder bewijs dat Wnt signaleringsroute de functie van EMX2 kan bemiddelen bij kanker, zoals eerder voorgesteld [22 ].
Ad-EMX2 infectie suggereert dat EMX2 gentherapie potentieel een klinische anti-tumor therapeutische strategie voor de behandeling van maagkanker in de toekomst kan hebben.
Dieet en voeding beïnvloeden het microbioom in het colonslijmvlies
Kinderen zijn immuun voorbereid op SARS-CoV-2
Waarom COVID-19-patiënten meer pathogene bacteriën in hun neus hebben
Onderzoek toont aan dat darmparasieten de ernst van COVID-19 verminderen
Wetenschappers extraheren volledig menselijk genoom uit duizenden jaren oude "kauwgom"
Thiopurines kunnen helpen bij het stoppen van virale replicatie bij menselijke coronavirussen
Lekkende darm en ruimtevlucht - het mechanisme onthuld
Een nieuwe studie naar de effecten van gesimuleerde microzwaartekracht, de toestand waarmee astronauten in de ruimte worden geconfronteerd, interfereert met de epitheliale barrière van de darm, en het
Wetenschappers ontwikkelen 3D-geprinte pil die bacteriën in de darmen bemonstert
Het darmmicrobioom bestaat uit biljoenen levende microben, en meer dan duizend soorten bacteriën. Het is bekend dat de darm een belangrijke rol speelt in de gezondheid van het lichaam. Een team van
Menselijk microbioom snijdt mucosale glycanen af,
SARS-CoV-2-infectie beïnvloeden Een internationaal team van onderzoekers heeft een studie uitgevoerd waaruit blijkt dat verschillen in het menselijke microbioom het vermogen van het ernstige acute res