PLoS ONE: adenovirusiniai Pristatymas apie EMX2 Genų slopina augimo į žmogaus skrandžio vėžio

Anotacija

Fonas

EMX2 yra žmogaus orthologue iš Drosophila
tuščias spiracles homeozinis genas genas, kuris buvo susijęs embriogenezės. Naujausi tyrimai rodo, galimą dalyvavimą EMX2 žmogaus vėžiui; Tačiau EMX2 vaidmuo kancerogenezėje reikia toliau tirti.

Rezultatai

Šiame tyrime mes pranešė, kad žemyn reguliavimas EMX2 išraiškos reikšmingai koreliavo su EMX2 promotoriaus hypermethylation skrandžio vėžio. Atkurti EMX2 išraišką, naudojant adenovirusinė tiekimo sistema skrandžio vėžio ląstelių linijų trūksta endogeninio EMX2 išraiška buvo slopinamas ląstelių proliferaciją ir WNT signalizacijos keliu tiek in vitro ir in skrandžio vėžio ksenotransplantavimo modelio in vivo. Be to, mes nustatėme, kad gydomi adenoviruso EMX2 ekspresijos vektorių gyvūnai turėjo žymiai geresnę išlikimo negu vartojant su tuščiu adenoviruso vektorių.

Išvada

Mūsų tyrimas rodo, kad EMX2 yra spėjamas navikas slopintuvas į žmogaus skrandžio vėžys. Adenoviruso-EMX2 gali turėti potencialas kaip naują genų terapijos, skirto pacientų, gydymo su skrandžio vėžio

nurodomoji:. Li J, Mo, M, Chen Z, Chen Z, Sheng Q, Mu yra H, ir kt. (2012) adenovirusiniai Pristatymas apie EMX2 Genų slopina augimo į žmogaus skrandžio vėžio. PLoS vieną iš 7 (9): e45970. Doi: 10,1371 /journal.pone.0045970

redaktorius: Masaru Katoh, Nacionalinis vėžio centras, Japonija

Įstojo: balandžio 13, 2012; Priimtas rugpjūčio 23, 2012 m Paskelbta rugsėjo 21, 2012

Visos teisės saugomos: © Li et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė lėšas iš nacionalinio raktas Pagrindinis mokslinių tyrimų ir plėtros (973) programos Kinijos (2011CB910800 ir 2012CB917304), Nacionalinis gamtos mokslų fondas Kinijoje (31.170.732), Gamtos mokslo fondas Zhejiang Province (Y2101329), o Docentas Mokslas fondas Zhejiang Province (2010-BSH-031). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra ketvirtoji dažniausia vėžio ir antra dažniausia vėžio mirčių pasaulyje [1], [2], [3]. Nors jo visame pasaulyje sergamumas sumažėjo, sergamumas vis dar išlieka aukštas Azijos šalių [2], [4], [5]. Dauguma skrandžio vėžiu sergančių pacientų diagnozuojama ne stadijose [6]. Nepaisant pagerėjimo gydymo strategijas [7], [8], 5 metų išgyvenamumas pacientams, sergantiems išplitusiu skrandžio vėžiu, kuriems buvo įprastas gydymo išlieka mažesnė nei 30% [4]. Todėl alternatyvūs metodai skubiai reikia.

genų terapija, įskaitant virusinės ir ne virusinės genų pristatymo sistemą, yra perspektyvi požiūris vėžio [9] gydymą. Tarp visų šiuo metu turima sistema, rekombinantinis adenoviruso (AD) vektoriai yra ypač perspektyvus. Ad vektorių privalumai apima gebėjimą gaminti aukštos titrai, gebėjimą užkrėsti efektyviai dalijant ir ne dalijant ląstelių, genomo stabilumą ir žemą DNR integracijos į priimančiosios genomo [9], [10]. Buvo pranešta, kad restauracija genų Taikant šį metodą per sukelia naviko regresiją ir indukuoja apoptozę vivo
nepaveikiant normalius audinius [11], [12], [13].

EMX2, žmogaus ortologą Drosophila
tuščios spiracles (AVS) homeozinis genas genas, priklauso homeozinis genas genų šeimos, kuri koduoja transkripcijos reguliavimo baltymų (Homeoprotein) pagrindinė daugelį aspektų augimo ir diferenciacijos [14]. EMX2 vaidina svarbų vaidmenį smegenų [15] ir skeleto vystymąsi [16] metu. Pelės slėpimas homozigotiniai EMX2 mutacijas eksponuoti dramatišką dydis sumažinti uodegos-vidurinė srityse, įskaitant pakaušio žievės ir hipokampo [17], [18], [19]. Pasipiktinimas EMX2 išraiškos gali pakeisti platinimo norma suaugusiems neuroninių kamieninių ląstelių [20]. EMX2 taip pat kontroliuoja žinduolių reprodukcijai, reguliuojant endometriumo ląstelių proliferaciją be vykdomai diferenciaciją [21].

Neseniai atlikti tyrimai rodo, galimą dalyvavimą EMX2 žmogaus vėžiui [22], [23], [24], [25]. Pavyzdžiui, EMX2 buvo įrodytas kaip naviko slopintuvas plaučių vėžiu, ir mažai EMX2 išraiška yra susijęs su sumažėjusiu bendras išgyvenamumas ir pasikartojimo Išgyvenamumas be ligos pacientams, sergantiems plaučių adenokarcinomos [22], [23]. Jis taip pat pranešė, kad EMX2 išraiška yra gausu normalus gimdos gleivinės moterų po menopauzės, tačiau nėra arba mažinamas endometriumo navikų ir EMX2 lygiai neigiamai koreliuoja su platinimu [24], [25]. Be to, EMX2 gali reguliuoti tumorigenezei per WNT signalinio kelio, kritinis kelias reguliuoti ląstelės likimas ryžtą, audinių vystymąsi ir tumorigenezei [26], [27], [28]. EMX2 randamas kaip tiesioginis slopinančioje iš Wnt1 išraiškos ir beldžiasi į apačią ir EMX2 geno skatina negimdinis išraišką Wnt1 besivystančiame Smegenų pūslė ir žievės displazija [29]. Epigenetinius triukšmo slopinimo iš EMX2 išraiška gali būti svarbi nukrypusiu nuo normos aktyvavimo WNT signalizacijos plaučių vėžio, ir dėl to platinimo ir metastazių [22]. Tačiau EMX2 funkcija Tumorigenesis ir atitinkamo mechanizmo metu vis dar reikia papildomai išaiškintas. Šiame tyrime mes pranešime EMX2 kaip spėjamą naviko slopintuvas į žmogaus skrandžio vėžio. Mes įrodyti EMX2 downregulation ir jos ryšį su metilinimo statuso geno promotoriaus regione skrandžio vėžio. Mes taip pat rodo, kad restauracija EMX2 naudojant adenoviruso tiekimo sistema slopina ląstelių proliferaciją ir WNT signalizacijos in vitro
ir rezultatai geresni išlikimui skrandžio vėžio ksenotransplantavimo modelio vivo
. Mūsų duomenys aiškiai rodo, gydomasis potencialas naudojant ad EMX2 kaip genų terapija ateityje gydant pacientus su skrandžio vėžiu.

Medžiagos ir metodai

Etika pareiškimas

Šis tyrimas buvo patvirtintas etikos komiteto Xuanwu ligoninė, sostinės medicinos universiteto Pekine. Rašytinis sutikimas etikos komitetas pritarė, buvo gautas kiekvienam pacientui prieš audinių mėginio paėmimo.

Mobilusis Kultūra, 5-aza-2'-dezoksicitidino (VPK) /trichostatin A (TSA) gydymas ir audinių mėginiai

Žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas (AZ521, AGS ir MKN28) buvo gauti iš Kinijos centro tipas kultūros kolekcija (Wuhan, Kinija). Ląstelių linijos buvo auginamos Dulbecco modifikuota Eagle terpėje, papildytoje 10% vaisiaus galvijų serumo, penicilinui, ir streptomicino 37 ° C temperatūroje drėgnoje inkubatoriuje su 5% CO _{2. Analizuoti atkūrimą EMX2 geno, ląstelės buvo gydomi 4 pm DAC arba 300 nM TSA (Sigma, St. Louis, JAV) per 4 dienas, su pakeitimo šviežia terpe, turinčių tą pačią dozę DAC arba TSA kasdien. Kontrolės ląstelės buvo auginamos su šviežia terpė su DMSO. Ląstelės todėl buvo paruošta DNR /RNR gavyba.}

20 formalinu fiksuotos parafino įterptųjų audinių blokelių (10 skrandžio vėžiu audinių ir 10 gretimų normalių audinių), iš viso, taip pat viso RNR iš 15 skrandžio displazija mėginių ir 20 skrandžio vėžiu chirurginiai mėginiai buvo imami iš Xuanwu ligoninė, sostinės medicinos universiteto Pekine. Iš viso RNR ir DNR genomo išgauti iš žmogaus suaugusių normalios skrandžio audinių buvo įsigytas iš Biochain (Hayward, CA, JAV).

DNR konstruoja

Topflash /Fopflash žurnalistai, kurių sudėtyje yra laukinio tipo ir mutantas TCF /LEF jungimosi vietų atitinkamai dr Yeguang Chen (Tsinghua universitetas, Pekinas, Kinija) buvo maloniai numatytas. Mutantas CTNNB1 (S45Y) kDNR konstruktas taip pat buvo maloniai pateikė dr Yeguang Chen (Tsinghua universitetas, Pekinas, Kinija). Rekombinaciniai adenoviruso vektoriai išreiškiantys EMX2 ir kontrolės vektorių buvo perkamos nuo ligos sukėlėjus pernešančių Biolabs (Vector Biolabs, Burlingame, CA, JAV).

Metilinimas konkrečių PGR (JEP) ir bisulfite Sekos (BS) Europos

bisulfito konvertavimo iš audinių ir ląstelių buvo atlikta be DNR gryninimo sąlyga EZ DNR Metilinimas tiesioginės komplektas (Zymo, Oranžinė, CA, JAV). Į FFPE audiniai buvo pirmasis de paraffinized į ksileno (Sigma) ir rehidratuoti rūšiavo etanolio, prieš bisulfito gydymo per Gamyba instrukcijas. JEP, modifikuotas DNR yra stiprinama naudojant MSP pradmenis (žemiau), kuri specialiai pripažinto Metilinti arba nedenatūruotą EMX2 promotorių sekos po bisulfito gydymą. PGR buvo paleisti į galutinio tūrio 20 įxL, kuriose yra 1 × MSP reakcijos buferio [30], 0,5 mkm kiekvieno pradmens ir 1 U Zymo Taq
™ DNR polimerazė (Zymo). PGR sąlyga buvo taip: 10 min, esant 95 ° C temperatūroje; 40 ciklai 30 s ne mažesnis nei 95 ° C, 30 s, esant 50 ° C ir 30 72 ° C; ir 7 minutės galutinis išplėtimas 72 ° C temperatūroje. BS, amplifikacija bisulfito-konvertuotų DNR buvo atliktas galutinis tūris 50 įxL, kuriame yra 1 mkm kiekvienas LST gruntą ir 2 U Zymo Taq
™ DNR polimerazė. PGR sąlyga buvo taip: 10 min, esant 95 ° C temperatūroje; 40 ciklai 30 s ne mažesnis nei 95 ° C, 40 s, esančio 55 ° C ir 1 min, esant 72 ° C; ir 7 minutės galutinis išplėtimas 72 ° C temperatūroje. PGR produktai buvo klonuotas į PMD-18T (Takara, Dalian, Kinija). Arba 5 arba 3 atsitiktinai atrinktų teigiami klonai iš kiekvienos grupės buvo sekos Šanchajaus Invitrogen (Šanchajus, Kinija). Gruntai buvo taip: Rīga,

JEP-M "(pirmyn): 5'-TAGTTTTTTGTTCGTTTCGCGTTTC-3"

JEP-M "(atgal): 5'-GAATTAAAATAAACGCCCCTACCGAC-3"

JEP-U (pirmyn): 5'-GTTTTTTGTTTGTTTTGTGTTTTGA-3 "

JEP-U (reversas): 5'-CCAAATTAAAATAAACACCCCTACCAAC-3"

LST-A (pirmyn): 5 " -GTTTGTAAATTTTTTTGGAAGGATTT-3 "

LST-A (reversas): 5'-AACAAAAAACTATCCTTAACCACCA-3"

LST-B (pirmyn): 5'-GGTTAGGGATTTTGTAGGGAT-3 "

LST-B (reversas): 5'-AAAATCACATAAACAACTTCCTCC-3 "

imunohistocheminis (IHC)

IHC buvo atliktas po įprastiniame protokole. Antikūnai, naudojami tyrimo metu pelės anti-žmogaus KI67 (1:100; BD, San Chosė, CA, USA) ir pelės anti-žmogaus EMX2 (1:500; Pierce, Rokfordas, IL, JAV), ir Alexa 594-konjuguoto ožkos anti-pelės vidurinio antikūnas (1:200; Invitrogen, Karlovi Varai, CA, JAV). Skaidrės taip pat buvo counterstained su hochest 33342 (Invitrogen). Zeiss "LSM 710 mikroskopas (Oberkochen, Vokietija) buvo nagrinėjama dažymą. Iš KI67 intensyvumas buvo įvertintas naudojant Image Pro ® Plus. EMX2 dažymo buvo ryškinamos su Histostain Plius DAB komplektas (platus spektras, Invitrogen) pagal Gamyba instrukcijas, counterstained hematoksilinu (Sigma) ir fotografavo naudojate Leica SCN400 skaidrių skaitytuvas (Leica, Vokietija).

liuciferazės Analizės

"Ląstelės po 5 × 10 ^{3 tankumą pat buvo pasėta į 24-duobučių lėkštelėse prieš transfekciją. Topflash arba Fopflash plazmidės buvo bendrai perkeltų su PRL-TK plazmidės. Po ląstelės buvo auginamos 18 valandas, liuciferazės aktyvumas buvo matuojamas Dual Glo liuciferazės prabavimo sistemos (PROMEGA, Madison, JAV). Tarp Firefly liuciferazės veikla (Topflash /Fopflash) ir renilla veiklos santykis buvo naudojamas TCF /LEF transkripcijos veikla.}

imunoblotas

Ir bendras baltymų (20 mikrogramų) ir citoplazmos ekstraktai (40 mikrogramų) buvo atliktas munoblotingu. Pirminiai antikūnai įtraukti anti-EMX2 (1:500; Pierce), anti-β-Actin (1:5000; Sigma "), anti-cikloniniai D1 (1:500; BD) ir anti-C-Myc (1:200; Santa Cruz biotechnologijos, CA, JAV).

neplatinimo Analizės

Mobilusis augimą lėmė CellTiter 96 Vandeninis neplatinimo Analizės Kit (Promega). Ląstelių linijų /gerai buvo padengtas į 96 duobučių kultūros plokščių su 5 × 10 ^{2 ląstelių skaičiaus. Po to, kai ląstelės buvo kultivuojamos dienų 0, 2, 3 ir 4, buvo pridėta į terpėje MTS sprendimai ir inkubuojami 1,5 h. Absorbcija esant 490 nm buvo matuojamas naudojant mikroplašu skaitytojo modelis 680 (Bio-Rad, Heraklis, CA, JAV).}

kolonija formavimas Analizės

Ląstelės (1 × 10 ^{3) užkrėstas su adenoviruso vektoriaus išreikšti EMX2 arba tuščio vektorius buvo pasėjamos trimis egzemplioriais į 100-mm patiekalų. Šviežią terpę buvo keičiama kas 3 dienas. Po kultūringas 3-4 savaites, ląstelės buvo fiksuojamas 4% paraformaldehido 10 min, nuplauti PBS, tamsintas su 0,1% violetinei 20 min ir fotografavo.}

RNR gavyba ir kiekybinė Realaus laiko atvirkštinės transkripcijos -PCR (AT-PGR)

RNR gavybos ir realaus laiko PGR buvo atliekama kaip aprašyta anksčiau [31]. Grunto sekas anksčiau buvo aprašyta [22].

Gyvūnų Modelis ir adenovirusiniai Vektorius Pristatymas

Visi pelės eksperimentai buvo atliekami pagal konkrečias patogenais neužkrėstų sąlygas gyvūnų galimybe Tsinghua universiteto ir institucinių patvirtintas gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas Tsinghua universitete. Skrandžio vėžio ksenoimplantai buvo įkurta į 5 savaičių amžiaus Patelė BALB /c nuogas pelių. Trumpai, po to, kai kultivuojamos iki susiliejimo, MKN28 arba AGS ląstelės buvo trypisnized ir resuspenduojamos PBS (pH 7,4) ir tada sumaišyti 01:01 (v /v) su Matrigel (Lebhafter), esant 4 ° C iki įšvirkščiamas vienas pelę, kad bendras tūris iš 150 mikrol. Mišinys s.c švirkščiamas į dešinio krašto 16 pelių patelėms su 10 ^{7 ląstelės per pele (0 diena). 7 dieną, pelių vietos navikų svyravo nuo 50 iki 100 mm 2 gavo tiesioginį viduje navikinės injekcija 1 × 10 9 apnašų formavimo vienetų nurodytu adenovirus (praskiesto su PBS į bendro tūrio 100 pl). Navikas formavimas buvo stebimi iki 1½ mėnesius. Naviko dydis buvo matuojamas naudojant Slankmatis ir nustatoma dauginant 0,5 × plotis 2 × ilgio. Kaplan-Meier metodas buvo naudojamas įvertinti išgyvenimą iš dviejų grupių iš gydyto gyvūno. Pabaigus eksperimento, augliai iš kiekvienos gydymo buvo surinkti 10% formalinu, įterptų į parafino ir supjaustyti į 5-mikrometrai storio griežinėliais tolesniam Ki-67 aptikti. Citozolinių baltymai ir visos ląstelės lizato taip pat buvo paimti iš tų auglių už Vakarų analizė.}

Statistinė analizė

Visi duomenys buvo apskaičiuojamas reiškia ± standartinis nuokrypis. Skirtumai tarp grupių buvo palyginti su dvipusis Stjudento t-testą. P
vertė 0,05 ar mažiau buvo laikoma reikšminga.

Rezultatai

downregulation iš EMX2 žmogiškųjų skrandžio vėžys

Mes išnagrinėjome EMX2 išraišką devyni žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas, taip pat naviko ir suporuoti gretimuose normaliuose audiniuose iš dešimties skrandžio vėžiu sergančių pacientų (1 pav.) Naudojant realaus laiko RT-PGR, mes nustatėme, kad išraiška EMX2 buvo žymiai downregulated aštuoniose iš devynių ląstelių linijų išnagrinėjo, lyginant su įprastu skrandžio audinio (p < 0,01, 1A pav.) Kita vertus, vienas ląstelių linija AZ521 parodė panašų lygį EMX2 išraiška kaip ir įprastu valdikliu (1a pav.) Siekiant nustatyti EMX2 baltymų ekspresiją pacientų audinių mėginiai, imunohistocheminis (IHC) buvo atliktas ir IHC dažymo intensyvumas buvo įvertintas, vaizdo Pro ® Plus. Nustatyta, kad visi dešimt analizuojami mėginiai eksponuoti arba iš EMX2 išraiškos trūkumą ar sumažėjęs EMX2 išraiškos vėžio audiniuose, lyginant su jų įprastomis kolegomis (p < 0,01, 1B pav.) Nustatyti galimą vaidmenį EMX2 į patologinę progresavimo žmogaus skrandžio vėžio, mes analizuojami EMX2 išraišką naudojant bendrą RNR, kad gavome iš penkiolikos skrandžio displazija pavyzdžių ir dvidešimt skrandžio vėžio chirurginio pavyzdžius. Mes nustatėme, kad EMX2 išraiška buvo žymiai downregulated į displazija mėginių (p < 0,05). Ir beveik prarado vėžiu mėginių, palyginti su suaugusiųjų normalus skrandžio audinyje (1c pav), o tai rodo, kad EMX2 downregulation gali pasireikšti neinvaziniai ikivėžinių etape

korekcija tarp EMX2 raiškos ir jos Rėmėjas metilinimas statusas

Mes išnagrinėjome metilinimo statusą EMX2 promotoriaus devyniose skrandžio vėžio ląstelių linijų ir normalus skrandžio audinio. Regionai CpG salos (CGI) buvo tapatinama su MethPrimer nuo -800 iki -470 ir -55 iki 459, palyginti su numatomų transkripcija starto vietų (+1) nuo EMX2 geno (2A pav.) Metilinimas statusas buvo analizuojami naudojant bisulfite sekos (BS) (2b pav) ir metilinimas būdingus PGR (JEP) (Skaičiai 2C-2d). Mūsų BS MSP rezultatai parodė, kad EMX2 rengėjas normaliomis skrandžio audinių ir AZ521 ląstelių buvo nemetilintas, o kitų aštuonių ląstelių linijų išnagrinėjo buvo tankiai denatūruotas (duomenys 2B-2c). Šie rezultatai sutampa su EMX2 ekspresijos lygį šių ląstelių linijų: yra daug normalių audinių ir AZ521, tačiau mažai kitų aštuonių ląstelių linijų tirtų. Iš denatūruotą ir nedenatūruotu juostos mišinys rasti keletą ląstelių linijas, įskaitant MKN28, N87 ir SNU16 nurodant dalinį metilinimas. Be to, mes nustatėme, kad metilinimas statusas pacientų audinių mėginiai atskleistos JEP yra suderinamas su EMX2 ekspresijos lygį tose mėginių (pav 2D, buvo išnagrinėtos keturios iš dešimties porų audinių mėginių dėl nepasiekiamumo genomo DNR iš kitų šešių porų ). Šie duomenys rodo, kad downregulation iš EMX2 išraiška gali būti jos promotoriaus hiper-metilinimo skrandžio vėžio rezultatas.

Jei toliau tirti tarp EMX2 išraiškos ir promotoriaus metilinimo koreliacija, mes traktuojami MKN28 ir AGS ląstelių linijas su metiltransferazė inhibitorius VPK ir histono deacetilazės inhibitorius TSA. Ląstelių linija AZ521 buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė savo promotoriaus regione nemetilintas. Mes pastebėjo, kad unmethylation specifinė grupė buvo gerokai padidėjo (3a paveikslas) su EMX2 ekspresijos lygį aktyvinama atitinkamai (3B pav) Po VPK gydymo abiem AGS ir MKN28 ląstelių, o tie, AZ521 ląstelių nepakito (3 paveikslas). Iš TSA gydymas turėjo minimalų poveikį tiek metilinimo statuso ir EMX2 ekspresijos lygį. Kartu paėmus, mūsų rezultatai aiškiai rodo, žemyn-reguliavimas EMX2 išraiškos reikšmingai koreliavo su EMX2 promotoriaus hypermethylation į žmogaus skrandžio vėžio.

slopina ląstelės augimas Adenovirus pristatytas EMX2 in vitro

mes šalia išnagrinėjo EMX2 vaidmenį ląstelių augimą skrandžio vėžio ląsteles. Iš AGS ir MKN28 ląstelių augimas buvo reikšmingai slopino nuo infekcijos adenovirusinė išreikšti EMX2 (Ad-EMX2), palyginti su tuščiu vektoriaus valdymo (AD-Ctrl) (p < 0,001, 4a paveikslas), tuo tarpu AZ521 ląstelių augimas neturi įtakos (p > 0,05, 4A pav). Šios pastabos taip pat buvo patvirtinta kolonija formavimosi tyrime (4b paveikslas). Mūsų rezultatai rodo, anti-platinimo funkciją EMX2 skrandžio vėžio ląstelių

slopinimas WNT signalinio kelio iki Adenovirus pristatytas EMX2

iš EMX2 funkcija buvo susijęs su WNT signalizacijos keliu.; Todėl mes studijavo tarp EMX2 ir WNT signalizacijos santykius skrandžio vėžio. Mes naudojamas Topflash /Fopflash reporterio testą matuoti TCF /LEF priklausomas transkripcijos veiklą reglamentuoja kanoninės WNT keliu. Mes nustatėme, kad TCF /LEF priklauso nuo transkripcijos veikla buvo smarkiai slopino Ad-EMX2 į AGS ir MKN28 ląstelių trūksta endogeninio EMX2 išraišką (p < 0,05), bet ne AZ521 ląstelių išreiškė endogeninio EMX2 (p > 0,05, 5A pav.) Nuosekliai, baltymų lygiai citozoliniame beta-kateninai ir kanoninės WNT kelio tolesniems taikiniai C-myc ir cikloniniai D1 buvo slopinamas šių AGS ir MKN28 ląstelių užsikrėtusių Ad-EMX2, bet ne AZ521 ląstelių (restauravimas EMX2 išraiškos šių ląstelių linijas po ad EMX2 infekcija buvo patvirtinta Vakarų) (5b pav.) Toliau nagrinėti WNT aktualumą kelias žemyn reguliavimo ir platinimo slopinimo AD-EMX2, mes perkeltų ir išreiškė stabilizavosi ß-kateninai (S45Y mutacija) šiose skrandžio vėžio ląstelių užsikrėtusių Ad-EMX2. Mes pastebėjo, kad per išreikšti ß-kateninai gerokai susilpnintas augimo slopinimo poveikį Ad-EMX2 tiek AGS ir MKN28 ląstelių (p < 0,01), bet ne AZ521 ląstelių (5C pav.) Kartu šie rezultatai patvirtina svarbų vaidmenį EMX2 į slopinimo WNT keliu skrandžio vėžio.

slopinimas skrandžio vėžio augimo Adenovirus pristatytas EMX2 in vivo pervežimas

Mes įsisteigę MKN28 ir AGS ksenografiniuose modeliai ištirti gydomąjį potencialą adenoviruso pristatytas EMX2 skrandžio vėžio vivo
. Vieną savaitę po skiepijimo, pelių vietos navikai, svyruoja nuo 50 iki 100 mm ^{2 gavo tiesioginį naviką injekcija 1 × 10 9 plokšteles formuojantys vienetai nurodytu adenovirus. Augimas navikų Ad-EMX2 infekuotų pelių buvo žymiai lėčiau nei iš kontrolinės grupės (P < 0,05, 6A pav į kairę du skydai). Tuo užbaigus eksperimentas naviko masės Ad EMX2 užkrėstų pelių taip pat žymiai mažiau negu kontrolinės grupės (p < 0,05 MKN28 naviko, P < 0,01 AGS naviko, pav 6A teisę skydelis). Dažymo intensyvumas proliferacinėje persekiotoją KI67 naviko egzempliorių pabaigus eksperimentą paaiškėjo, kad pristatymas Ad-EMX2 žymiai sumažino Ki-67 dažymo (p < 0,01, 6b pav), tai rodo, ląstelių proliferacija inhibicija navikų. Be to, išlikimas Ad EMX2 užsikrėtę grupėje buvo žymiai geriau nei kontrolinėje grupėje (p = 0,014, 6C pav.) Suderinamas su mūsų in vitro
analizė, citozolinių β-kateninai ir kanoninė WNT kelio metu tolesni tikslai, C-MYC ir cikloniniai D1 taip pat buvo downregulated Ad-EMX2 užsikrėtę MKN28 ir AGS navikai (restauravimo EMX2 išraiška šiose in vivo navikai taip pat buvo patvirtinta Vakarų) (6D pav). Kartu paėmus, mūsų rezultatai rodo, gydomąjį potencialą adenoviruso pristatytas EMX2 gydyti skrandžio vėžiu.}

Diskusijos

homeozinis genas genai buvo gerai žinomas dėl savo svarbos plėtros dešimtmečius, tuo tarpu tyrimas šie genai onkogenezėje metu vis dar yra savo ankstyvojoje stadijoje. Netipiško homeozinis genas genas išraiškos nebuvo užfiksuota įvairių vėžio [32], [33], nurodydamos hemeobox išraiškos pokyčiai gali būti svarbūs onkogenezėje. Tai gali suteikti molekulinė pagrindo potencialių klinikinėje praktikoje. Tačiau vis dar reikia visapusiškai sprendžiami keli pagrindiniai klausimai, įskaitant molekulinius mechanizmus, kad vairuoti su netipiško išraiška, ir tolesni tikslai ir signalizacijos būdus, kurie skatina onkogenezei. Šiame tyrime mes teikiame įžvalgų apie šiuos klausimus tiria EMX2 į žmogiškąjį skrandžio vėžio.

Mūsų tyrimas pranešė reikšmingai sumažėjo ir nuostolių EMX2 raiškos skrandžio vėžio ląstelių linijų ir pirminių navikų audiniuose, ir parodė, kad downregulation reikšmingai koreliavo su hiper-metilinimas dėl EMX2 promotoriaus, rodo epigenetinius nutildymo kaip svarbų mechanizmą EMX2 disreguliacija į žmogaus skrandžio vėžio. Iš tiesų, epigenetinius modifikacija buvo pasiūlyta kaip pagrindinis mechanizmas, atsakingas už homeozinis genas genų downregulation ar nuslopinami kitų vėžio audinių tipų, kur šie genai funkcija naviko slopinimą [14], [32]. Be to, mūsų stebėjimas EMX2 dowregulation ne invazinės skrandžio displazija palaiko galimą svarbų EMX2 į patologinę progresavimo žmogaus skrandžio vėžio. Vienas apribojimas mūsų tyrime yra analizuojamų audinių mėginių skaičius. reikia išnagrinėti toliau įteisinti metilinimo-nuslopinami iš EMX2 skrandžio vėžio ieškojimas didesnis skaičius pacientų mėginių. Nepaisant to, mūsų rezultatai pateikti pirmąjį tiesioginį įrodymų, pagrindžiančių šį mechanizmą skrandžio vėžio ir nustatyti EMX2 kaip spėjamą naujo naviko slopintuvas skrandžio vėžio.

Be to, mes ištirti svarbius onkogeninių kelius, per kurį EMX2 veikė skrandžio vėžio ir nustatė, kad WNT signalizacijos kelias gali vaidinti svarbų vaidmenį tarpininkavimo EMX2 funkciją. Mes iliustruota platinimo tyrimus, kad aukštos raiškos egzogeninės EMX2 reikšmingai slopino didėjimas skrandžio vėžio ląstelių linijų trūksta endogeninio genų ekspresiją (AGS ir MKN28 ląstelių), atitinkantis ankstesnius pranešimus, kad skirtumas EMX2 išraiškos neigiamai koreliuoja su platinimu kituose vėžio ląstelių tipų [ ,,,0],24], [25]. Mes taip pat parodė, kad WNT signalizacijos kelias buvo smarkiai slopinamas EMX2 in vivo, parsisiųsti ir in vitro
, teikti papildomų įrodymų, kad WNT signalizacijos kelias gali tarpininkauti EMX2 funkciją vėžio kaip anksčiau pasiūlė [22 ].

Galiausiai, mūsų rezultatai rodo, kad naudojant EMX2 genų terapija su skrandžio vėžio gydymui potencialą. Infekcija auglių su Ad-EMX2 reikšmingai slopino platinimu ir dar svarbiau, pagerėjo bendrasis išgyvenimas. Reikia pažymėti, kad tiekimo sistema mes naudojamas gydymui buvo rekombinantinis serotipo adenovirusas 5 (AD5), dažniausiai naudojamas vektorius kelių rūšių vėžys genų terapijos [11], [12], [34], [35]. Palyginti su adenovirusu-susijęs virusinės (AAV) ir retrovirusinių pristatymo sistemų, adenoviruso vektorių, pavyzdžiui, Ad5, aiškiai turi daug privalumų. Pavyzdžiui, adenovirusiniai vektoriai turi didelę tropizmas leidžiantį efektyviai nukreipti nuo daugelio audinių interesų, didelės keliamosios talpa ir aukštos transdukcijos efektyvumo lyginant su AAV sistemos [10] ir taip pat ne integruoti savybes, kurios priešingu atveju indukuoti atsitiktinių mutagenezes genomo [riziką ,,,0],10], [36] [36], [37], [38]. Be to, adenovirusiniai vektoriai gali būti suprojektuotos taip, kad vėžio atrankinės oncolytic virusų [39], [40], [41], kurie yra labai svarbus klinikinėje praktikoje vėžio genų terapija. Tačiau vis dar yra daug iššūkiai naudojant adenoviruso vektoriai pristatyti genų terapiją pacientams. Pavyzdžiui, jie gali būti greitai prarado iš ląstelių, kad padalinti greitai po to, kai infekcija. Kiti veiksniai, turintys įtakos klinikinei taikymą adenoviruso pristatymo apima pakavimo pajėgumą ir šeimininko asortimentą adenoviruso vektoriai, jų genų ekspresijos profilio ir polinkį sukelti imuninį atsaką, ypač svarbu, jei kartotinių dozių reikia [42], [43]. Nepaisant to, mūsų vivo
tyrimas Ad EMX2 infekcijos rodo, kad EMX2 genų terapija gali turėti potencialą tapti klinikinis priešnavikinis terapinis strategija skrandžio vėžio gydymo ateityje.

• PLoS ONE: diferencinė ekspresija fosfolipazę C Epsilon 1 yra susijusi su lėtiniu gastritu ir skrandžio atrofijos Cancer
• PLoS ONE: Triukšmo slopinimo ir XB130 yra susijęs su abiem prognozė ir Chemosensitivity skrandžio vėžio