PLoS ONE: abnehmend Kern-Fukosylierung zu Malignität in Gastric Cancer

Abstrakt

Das Ziel der Studie ist es N-Glycan Profilierung Veränderungen im Zusammenhang mit Magenkrebs und erkunden Sie die Auswirkungen der Kern-Fukosylierung auf biologischen zu identifizieren Verhalten von menschlichen Magenkrebszellen. Insgesamt 244 Probanden einschließlich Magenkrebs, Magengeschwür und gesunden Kontroll wurden rekrutiert. N-Glycan Profilierung aus Serum und Gesamtproteine ​​in Magengewebe wurde durch DNA-Sequenzer-unterstützte Fluorophor-unterstützte Kapillarelektrophorese analysiert. Die Fülle der gesamten Kern-fukosylierte Reste und die Expression von in Kern Fukosylierung beteiligten Enzyme wurden mit Lectinblot, quantitative reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion, Western-Blot, Immunhistochemische Färbung und Lektin-histochemische Färbung analysiert. Die rekombinanten Plasmide von GDP-Fucose-Transporter und α-1,6-Fucosyltransferase (Fut8) wurden Magenkrebszelllinien BGC-823 und SGC-7901 konstruiert und Transfektion in. CCK-8 und Wundheilungs Assays wurden verwendet, um die funktionellen Auswirkungen der Kern-Fucosylierung Modulation auf die Zellproliferation und Migration zu bewerten. Charakteristisch Serum N-Glycan-Profile wurden bei Magenkrebs gefunden. Im Vergleich mit der gesunden Kontrolle wurde eine trianntenary Struktur Hülle und Fülle, Peak 9 (NA3Fb) wurde deutlich bei Magenkrebs erhöht, während die gesamte Fülle von Kern-fukosylierte Rückstände (sumfuc) verringert wurde. Kern-fukosylierte Strukturen, peak6 (NA2F) und peak7 (NA2FB) wurden in Magentumorgewebe verstorben, wenn dieser im Vergleich zum benachbarten Nicht-Tumorgewebe. Konsequent, Objektiv culinaris Agglutinin (LCA) wurden -bindende Proteine ​​signifikant verringert in Seren von Magenkrebs, und Proteinebene von Fut8 war signifikant im Magentumorgewebe im Vergleich zu dem in benachbarten Nicht-Tumor-Gewebe verringert. Eine Hochregulierung des BIP-Tr und Fut8 könnte hemmen Proliferation, aber hatte keinen signifikanten Einfluss auf die Migration von BGC-823 und SGC-7901-Zellen. Kern-Fukosylierung wird nach unten in Magenkrebs geregelt. Hochregulation von Kern-Fukosylierung könnte die Proliferation der menschlichen Magenkrebszellen hemmen

Citation:. Zhao Y-P, Xu X-Y, Fang M, Wang H, Sie Q, Yi C-H, et al. (2014) Verminderte Kern-Fukosylierung zu Malignität in Magenkrebs beiträgt. PLoS ONE 9 (4): e94536. doi: 10.1371 /journal.pone.0094536

Editor: Salvatore V. Pizzo, der Duke University Medical Center, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 19. August 2013; Akzeptiert: 17. März 2014; Veröffentlicht: 14. April 2014

Copyright: © 2014 Zhao et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Die Studie wurde von National Natural Science Foundation of China (Nr 81201697, 81101639 und Nr 81271925) unterstützt; Wissenschaft und Technologie Kommission der Stadt Shanghai (Nr 10ZR1439100 und Nr 11JC1416400) .Die Geldgebern hatte keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zu veröffentlichen oder um die Herstellung des Manuskripts

konkurrierende Interessen.: die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

der Magenkrebs (GC) ist die vierthäufigste Krebserkrankung und die zweithäufigste Ursache von Krebs Todesfälle weltweit [1]. - [3], besonders häufig in vielen asiatischen Ländern, insbesondere China [4]. Protein-Glykosylierung ist eine der häufigsten Proteine ​​posttranslationale Modifikationen gemacht [5]. Glycans können an Proteine ​​entweder über eine Amid-Gruppe (N-verknüpfte Glykosylierung) oder einer Hydroxylgruppe (O-gebundene Glykosylierung) befestigt werden, die durch verschiedene Biosynthesewege auftreten und möglicherweise unabhängige Funktionen haben [6]. N-verknüpfte Glykosylierung spielt fundamentale Rolle in vielen biologischen Prozessen, wie Zelladhäsion, Zellmigration und Signaltransduktion [7]. Abnormale Expression von N-gebundenen Glykoproteinen ist in verschiedenen Krankheiten beobachtet [8] - [10]. Auf eine eingehende Charakterisierung von N-gebundenen Glykoproteinen und krankheitsassoziierten Glykosylierung Veränderungen wurden verschiedene Methoden entwickelt worden. In unserer früheren Studie haben wir einige N-Glycan-Marker in heptatocellular Karzinom (HCC) und Darmkrebs mit Hilfe einer Kapillare basierend Elektrophorese genannt DNA-Sequenzierer-unterstützte Fluorophor-unterstützte Kapillarelektrophorese (DSA-FACE) [11] identifiziert. Außerdem wurde berichtet, dass α-1, 6-Fucosyltransferase (Fut8) Aktivität und Expression in verschiedenen menschlichen Krebsarten erhöht wird, was eine Rolle für dieses Enzym bei der Tumorentstehung und Progression darauf hindeutet, wie HCC [12], [Darmkrebs ,,,0],13], nicht-kleinzelligem Lungenkrebs [14] und ovarian seröse Adenokarzinom [15]. Altered Core-Fucosylierung ist eine der wichtigsten abnormal glykosylierten Modifikation in Malignitäten identifiziert. Fut8 katalysiert die Übertragung von Fucose von Guanosindiphosphat (GDP) -fucose zum innersten GlcNAc von Hybrid und komplexen N-verknüpften Oligosaccharide über eine α-1,6-Bindung, was zu einem Kern-fucosyliert Glykoproteine ​​[16] - [17] und verändern biologische Funktion von resultierenden Glykoproteine ​​[18]. Obwohl viele Studien, die den Zusammenhang zwischen der veränderten Kern Fukosylierung und anderen aggressiven Tumoren berichtet haben, zu unserem Wissen, bleibt der Einfluss von Kern-Fukosylierung auf Magenkrebs nicht bekannt. In dieser Studie analysierten wir N-Glycan Profilierung mit DSA-FACE in beiden Serumproben von Magenkrebs, Magengeschwür, gesunden Kontrollen und Gewebeproteine ​​von Tumoren und benachbarten nicht-Tumoren. Dann erweitern die Funktions Forschung auf den identifizierten spezifischen Glykosylierungen.

Materialien und Methoden

Ethik Statement

Das Studienprotokoll von der chinesischen Ethikkommission für Humanressourcen auf dem Zweiten genehmigt wurde Military Medical University. Alle Studienteilnehmer bereitgestellt informierte Zustimmung geschrieben.

Studienpopulation

Insgesamt 105 Patienten mit Magenkrebs (n = 80) und Magengeschwür (n = 25) wurden zwischen Dezember 2007 und Oktober eingeschrieben 2010 im Changzheng Krankenhaus der Second Military Medical University (Shanghai, China). Alle Fälle mit immatrikuliert Magenkrebs wurden histologisch durch zwei Pathologen und Fälle mit Magengeschwür bestätigt rekrutiert wurden von Gastroskop bestätigt. Patienten mit Magenkrebs, die präoperative Chemotherapie erhalten, und die hatten andere Erkrankungen, einschließlich Infektionen wurden von der Studie ausgeschlossen. Serumproben wurden vor der chirurgischen Resektion erhalten. Für eine Kontrollgruppe, 139 Alter, wurden gesunde Probanden aus einem Pool von Krebs-freie Personen eingeschrieben sind, im Krankenhaus für eine regelmäßige körperliche Untersuchung besucht und die freiwillig die Forschung in der gleichen Zeit zu verbinden. Wir definierten eine gesunde Person als jemand, der frei von Krankheiten angesehen (einschließlich keine Geschichte von Krebs) bei Gesundheits-Check-up. Die folgenden klinischen Merkmale der Patienten waren zum Zeitpunkt der Vollblutsammlung erhalten. Eine Zusammenfassung der Daten aus diesen Fächern ist in Tabelle 1 das Fortschreiten aller Patienten mit Magenkrebs zur Verfügung gestellt wurde nach der Union for International Cancer Control (UICC) TNM Kriterien für Magenkrebs eingestuft, 13 Patienten (16,25%) hatte Bühne I, 24 Patienten (30,00%) hatten im Stadium II, 30 Patienten (37,5%) hatten im Stadium III und 13 Patienten (16,25%) hatten im Stadium IV. Das Durchschnittsalter der Patienten betrug 54,35 ± 6,69, davon 60 Männer und 20 Frauen. Serum wurde unter Verwendung eines Standardprotokolls aus Vollblut gewonnen, behandelt durch Zentrifugation bei 10.000 g für 20 Minuten und bei -80 ° C gelagert.

N-Glycan Profilieren von Serumproteinen

Serum protein N-Glycan-Analysen wurden wie früher beschrieben durchgeführt [11]. Kurz gesagt, mit 8-aminonaphtalene-1, die N-Glycane, die auf den Proteinen in 2 ul Serum wurden 3, mit Peptid N-Glycosidase-F (PNGaseF) (New England Biolabs, Boston, Mass) und dann markiert freigegeben 6- trisulfonsäure (APTS) (Invitrogen, Carlsbad, CA) .Sialic Säure mit Arthrobacter entfernt wurde ureafaciens Sialidase (Roche Bioscience, Palo Alto, CA) und die verarbeiteten Proben wurden mit DSA-FACE-Technologie unter Verwendung eines Kapillarelektrophorese-basierten ABI3500 Genetic analysiert Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). Die 9 intensivsten Peaks, die in allen Proben nachgewiesen wurden (zusammen machten diese Peaks für > 90% des gesamten Serum N-Glycane) wurden GeneMapper Software (Applied Biosystems) analysiert. Jede Struktur von N-Glycan wurde durch Normalisierung seiner Höhe auf die Summe der Höhen aller Peaks numerisch beschrieben.

Gewebeproben

Alle Gewebe wurden in Übereinstimmung mit den Institutional Review Board Verordnungen verwendet von der Zweite Military Medical University. Gewebeproben wurden ab 10 von 80 Patienten mit Magenkrebs erhalten. Gewebeproben enthalten 2 Scheiben, ein Tumorgewebe und einer benachbarten, nicht-Tumorgewebe. Gepaart Gewebeproben (ca. 0,5 x 0,5 x 0,5 cm ^{3, für jede Probe dupliziert) ausgewählt wurden entweder sofort bei -80 ° C eingefroren für RNA und Proteinextraktion oder in 10% gepuffertem Formalin fixiert für bis zu 24 Stunden und dann verarbeitet in ein Paraffin eingebettet Block und bei Raumtemperatur für histochemische Färbung gelagert.}

N-Glycan Profilierung aus Gewebeproteine ​​und Strukturanalyse unter Verwendung exoglycosidase Verdau

Proteine ​​von etwa 25 mg gefrorene Gewebeproben extrahiert wurden, . Die Gewebeproben wurden in Lyse-Puffer mit Protease-Inhibitoren-Cocktail (Roche Diagnostics, Meylan, Frankreich) suspendiert und Pistill. Unlysierte Teile wurden durch Zentrifugation (12000 g für 10 Minuten bei 4 ° C) entfernt, zweimal. Die Konzentration des solubilisierten Proteine ​​wurde unter Verwendung des BCA-Kit (Pierce Biotechnology /Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) bestimmt und die Proteinproben wurden bei -80 ° C bis zur Verwendung gelagert. Insgesamt 40 &mgr; g Gewebeproteine ​​wurden verwendet, N-Glykan-Profile mit regulären N-Glycan Profilierungsverfahren das gleiche wie das in Serum oben beschrieben durchgeführt, zu etablieren. In den Kern-α-1, 6-fucosylierten N-Glycan-Strukturen, eine entsprechende Anzahl von APTS-markiertes N-Glycane wurden sowohl mit Arthrobacter ureafaciens Sialidase und Rindernieren α-1 verdaut, 6-Fucosidase (Prozyme, San Leandro, CA identifizieren , USA). DSA-FACE-Technologie wurde verwendet, um zu analysieren wurde die Verdauungsprodukte und GeneMapper Software verwendet, um die Höhe der Spitzen zu analysieren.

RNA-Extraktion und quantitative Echtzeit-PCR

Gesamt-RNAs wurden aus gefrorenen extrahiert Gewebe und Zellen, die gesamt-RNA-Extraktions-Kits unter Verwendung von nach den Anweisungen des Herstellers (Axygen Biosciences, Hangzhou, China). Die Reinheit und Konzentration der RNA wurden durch Spektrophotometer (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) bestimmt, und dann bei -80 ° C bis zur Verwendung gelagert. Die cDNA wurde unter Verwendung ReverTra Ace-α-RT-PCR-Kits (Toyobo Co., Osaka, Japan) synthetisiert nach den Anweisungen des Herstellers. Primer wurden unter Verwendung der Primer Express-Programm (Applied Biosystems; die Sequenzen sind in Tabelle S1 gezeigt) ausgelegt. Quantitative Echtzeit-PCR wurde durchgeführt, die SYBR® Green Real-time PCR Master Mix Kit (Toyobo Co., Osaka, Japan) und wurde auf Applied Biosystems 7300 Real-Time-PCR-System (ABI, Foster City, CA, USA) analysiert . Alle Assays wurden dreifach unabhängig durchgeführt. PCR-Zyklus bestand aus Denaturierung bei 95 ° C für 5 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen bei 95 ° C für 15 Sekunden und bei 59 ° C oder 55 ° C für 15 Sekunden, und die Detektion für 45 Sekunden bei 72 ° C. Die relative Menge an Fut8 oder Guanosindiphosphat (GDP) -fucose transporter (GDP-Tr) Transkripte in jeder Probe wurde normalisiert auf das Housekeeping-Gen β-Actin und Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) durch den Zyklus subtrahiert wird. Die Niveaus der Genexpression wurden unter Verwendung von Delta-Delta Ct-Methode bestimmt. Absolute Transkriptexpression Werte über 40 Zyklen wurden unter nachweisbaren Mengen berücksichtigt. Schmelzen Kurven wurden für jede Reaktion überprüft um sicherzustellen, dass ein einzelnes Produkt amplifiziert.

Western blot und Lectin-Blot

Die Proteine ​​wurden aus gefrorenen Gewebe mit dem Verfahren extrahiert oben beschrieben, und insgesamt 50 ug Proteine ​​wurden durch Elektrophorese in 10% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) getrennt. Gele wurden mit Coomassie-Blau G250 oder die Proteine ​​in dem Gel gefärbt wurden auf eine Nitrocellulosemembran () für den Nachweis von Fut8 oder dem Prozentsatz von Kern-fucosyliert Proteine ​​übertragen. Für Serumproben, insgesamt 85 Fälle von Magenkrebs (n = 80), Magengeschwür (n = 25) und gesunden Kontrolle (n = 30) wurden für die SDS-PAGE und Lectin-Blot verwendet. Die Membranen wurden über Nacht bei 4 ° C mit 5% fettfreiem Milchprotein oder 5% Rinderserumalbumin in Tris-gepufferter Kochsalzlösung [140 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (TBS)] und dann 2 h bei Raumtemperatur inkubiert, blockiert mit 1:100 Antikörper anti-human Fut8 verdünnt (15C6, anti-human Fut8, Fujirebio Corp., Japan) oder 5 &mgr; g /ml biotinylierter Lens culinaris Agglutinin A (LCA) (Vector Laboratories, Burlingame, Calif) in TBS, enthaltend 0,05% Tween-20 (TBST-Puffer), und dann mit einer 1:10,000 Verdünnung von fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) oder IRDye 800CW-Streptavidin (LI-COR Biosciences) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert . Die Membranen wurden mit dem Odyssey IR Imaging System entwickelt. Anti-Beta-Aktin (1:2000) wurde für die interne Referenz Antikörper für Western-Blot verwendet. Gereinigtes Albumin wurde als negative Kontrolle für die Lectin-Blot und Gesamtprotein mit Coomassie-Blau verwendet wurde, verwendet, um den Prozentsatz der Kern-fucosyliert Proteins zu berechnen.

immunhistochemische (IHC) Färbung und Lektin-histochemische Färbung

Die fixierten Gewebeproben in Paraffin eingebettet wurden für Fut8 und Lektin-histochemische Färbung für LCA zur immunhistochemischen Färbung in 4-mm-sick Scheiben schneiden. Nach der Einwirkung Entparaffinierung, Rehydrierung, die endogene Peroxidase-Blocker sowie Antigen-Retrieval (10 mM Tris /1 mM EDTA, pH 9,0, Autoklaven behandelt) wurden Proben mit einem monoklonalen Maus-Antikörper gegen die menschliche Fut8 (1:100) oder biotinylierten LCA inkubiert (1 :500) über Nacht bei 4 ° C und anschließend mit Meerettich-Peroxidase-konjugierten sekundären Antikörper oder Fluorescein markiertem Streptavidin bei 37 ° C für 30 min. Die Zellkerne wurden mit Hämatoxylin oder DRAQ5 gegengefärbt. Negativkontrolle wurde identisch behandelt histologischen Schnitten mit Maus-IgG zusammengesetzt Maus Fut8 zu ersetzen.

Zelllinien und Kultur

Die menschlichen Magenkrebszelllinien, BGC-823 und SGC-7901 wurden gekauft von der Shanghai Institut für Zellbiologie, chinesische Akademie der Wissenschaften und bei 37 ° C unter 5% CO _{2 in RPMI 1640-Medium und DMEM-Medium (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), die jeweils mit 10% FBS, 1% Glutamin und 1% Antibiotika-Lösung.}

Ausbau des BIP-Tr und Fut8 rekombinanter Plasmide und Transfektion von Magenkrebszellen

die pEGFP-N1-GDP-Tr und die pEGFP-N1 -Fut8, der Plasmidvektor Codierung menschlichen GDP-Tr oder Fut8 wurde durch Einfügen von GDP-Tr oder Fut8 cDNA in einen pEGFP-N1-Vektor (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA), das einen CMV-Promotor erzeugt und SV40-early-Promotor sowie das Neomycin /Kanamycin-Resistenz-Gen von Tn5. Das Vektorrückgrat enthält auch einen SV40-Replikationsursprung in Säugerzellen. Die multiple Klonierungsstelle (MCS) befindet sich neben dem unmittelbar frühen Promotor des CMV. Der menschliche GDP-Tr oder Fut8 Gen wurde aus dem mit TRIzol-Reagenz (Invitrogen, Carlsbad, USA) aus humanem Lebergewebe durch Durchführung der RT-PCR unter Verwendung der Primer (Tabelle S2), in dem die Xho I oder Kpn I-Restriktionsstellen extrahierte mRNA kloniert enthalten waren, mit Xho I oder Kpn I Verdau und dem pEGFP-N1 Ligierung in. Die pEGFP-N1-GDP-Tr oder pEGFP-N1-Fut8 wurde für die Amplifikation und DNA-Sequenzierung in Escherichia coli DH5a transfiziert verwendet wurde, die Treue zu gewährleisten. Plasmid-DNA wurde mit dem Qiagen DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) hergestellt, wie es gemäß den Anweisungen des Herstellers. Plasmide wurden in die menschlichen Linien Magenkrebszelle transfiziert, BGC-823 und SGC-7901 bei 80% Konfluenz und 5 x 10 ^{5 Zellen pro Vertiefung in einer Sechs-Well-Platte unter Verwendung des Lipofectamin ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, USA ) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die transfizierten Zellen, die Zielgen exprimiert durch quantitative RT-PCR bestätigt wurden.}

Zellproliferationsassays

Zellproliferationsassays mit Zellzählung Kit-8 durchgeführt wurden (CCK-8, Dojin, Japan) nach den Anweisungen des Herstellers. Das Zellwachstum wurde alle 24 h über 5 Tage überwacht und für jeden Zeitpunkt wurde doppelt durchgeführt. Die Absorption wurde für jeden gemessen und bei einer Wellenlänge von 450 nm.

Wundheilungs Assay

Für die Wundheilungsassay die menschlichen Magenkrebszelllinien, BGC-823 und SGC-7901 ( 1 × 10 ^{5 Zellen /35 × 11 mm-Schalen) wurden ausgesät und für 24 Stunden bei 37 ° C und dann transfiziert mit rekombinanten Plasmiden inkubiert. Nach dem Zusammenfluss zu erreichen, wurde die Zellschicht in jeder Platte mit einer Plastikpipettenspitze gekratzt. Die Migration der Zellen am Rand des Kratzers bei 0, 24 und 48 Stunden untersucht wurde, wurden die Bilder aufgenommen und von Leica-Fluoreszenzmikroskop und angepaßten Bildanalyse-Software (Comet Assay IV-Bildanalysesystem, PI, UK) analysiert.}

Routine Tumor Maker Erkennung

klinischen und biochemischen Daten der Patienten sind in Tabelle 1 Routine biochemische Tests zusammengefaßt sind, wurden unter Verwendung von Standardmethoden und angepasst Reagenzien gemessen (Hitachi 7600 Analyzer (Hitachi, Tokyo, Japan) . Tumormarker Ebenen, einschließlich der Kohlenhydrat-Antigen 19-9 (CA 19-9), carcino-embryonale Antigen (CEA), Cytokeratin 19 (CK19), CA125 und CA724, wurden auf einem Roche E170 modular aufeinander abgestimmte Reagenzien bestimmt.

Statistische Analyse

Alle quantitativen Variablen wurden als Mittelwert ± Standardabweichungen, sofern nicht anders angegeben. quantitative Variablen mit dem Student t-Tests verglichen wurden, Varianzanalysen (ANOVA) oder nichtparametrischen Tests. Pearson Korrelationskoeffizienten (Spearman Korrelationskoeffizienten für ordinale kategoriale Variablen berechnet wurden) und deren zugehörigen Wahrscheinlichkeiten ( p
) verwendet wurden Korrelationen zwischen den Parametern zu bewerten. Alle gemeldeten p
Werte waren 2-tailed und p
Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet. Statistische Analysen wurden mit SPSS 16.0 für Windows Statistik-Software (SPSS Inc.) durchgeführt.

Ergebnisse |

Verschiedene Serum N-Glycan Profilmuster bei Magenkrebs, Magengeschwür und gesunden Kontrollen

mit DSA-FACE, untersuchten wir die N-Glykan Profile in desialyliertes Seren von Patienten mit Magenkrebs (n = 80), Magengeschwür (n = 25), und dem Alter angepasst gesunden Personen (n = 139). Wir quantifizieren und statistisch diese Spitzen unter 3 verschiedenen Gruppen verglichen. Mindestens 9 N-Glycan-Strukturen (Peaks) wurden in allen Proben (1A) identifiziert. Die Strukturanalyse dieser N-Glykane wurde zuvor von Callewaert veröffentlicht [11]. Die durchschnittliche relative Häufigkeit dieser N-Glykanstrukturen in Tabelle 2 die Fülle von Strukturen in den Peaks 2, 3, 5, 6, 7 beschrieben, 8 und 9 ergab statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Magenkrebs, Magengeschwür und gesunden Kontroll Gruppen, was darauf hinweist, dass verschiedene N-Glycan-Muster in verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen erschien. Im Vergleich mit der gesunden Kontrollgruppe, peak5 (bigalacto biantennary Glykan, NA2) und peak9 (Verzweigung α-1,3-fukosylierte triantennäre Glykan, NA3Fb) wurden erhöht (P < 0,001) (Abbildung 1B); während Core- fukosylierte Spitzen, wie peak2 (agalacto Kern-α-1,6-fukosylierte biantennary Glykan Halbierungs, NGA2FB), peak3 (Einzel agalacto Kern-α-1,6-fukosylierte biantennary Glykan, NG1A2F), peak6 (bigalacto Kern 0,001); -α-1,6-fucosyliertes biantennären Glykan, NA2F) und peak7 (bigalacto Kern-α-1,6-fucosyliertes halbierenden biantennären Glykan, NA2FB) wurden in der Magenkrebs-Gruppe (P <verringert. In ähnlicher Weise (zeigt insgesamt Kern-fucosyliert Strukturen, einschließlich Peak 1, 2, 3, 4, 6 und 7), die Fülle von Kern-fucosyliert Struktur Glykane genannt sumfuc wurde signifikant in der Magenkrebs (P < 0,001) verringert (1C ). Die Magen-Krebs-Gruppe wurde weiter in vier Untergruppen eingeteilt nach TNM Staging von UICC für Magenkrebs. Die Struktur Fülle und sumfuc nicht signifikant unter den vier verschiedenen Untergruppen ändern; jedoch sumfuc wurde nach und nach mit der Progression Stadien von Magenkrebs verringert (Tabelle 3).

Die Korrelation zwischen N-Glykane und Routine Tumormarker

Bisher CEA immer noch weit verbreitet für das Screening verwendet wird, und Überwachung von Magenkrebs. Wir analysierten die Korrelationen zwischen den einzelnen N-Glycan Marker mit CA19-9, CEA, CK19, CA125 und CA724. Der Pearson-Korrelationsanalyse zeigte, daß CEA positiv mit max1 assoziiert (r = 0,19; P < 0,01) und peak9 (r = 0,28; P < 0,01), wohingegen negativ mit peak6 (r = -0,18; P < 0,01) und pEAK8 der Fa (r = -0,23; P < 0,01). (Tabelle 4)

Vergleich von sumfuc zwischen Magenkrebs und anderen Verdauungssystem Krebserkrankungen

Bisher wir die N-Glycan Profilierung des hepatozellulären Karzinoms studiert haben (HCC) [19] und Darmkrebs (CRC) [20]. Die Fülle von sumfuc ergab statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Magenkrebs (41,32 ± 6,39), HCC (50,99 ± 8,39), CRC (45,33 ± 5,96) und gesunden Kontroll (47,67 ± 5,08) Gruppen (p < 0,001, Tabelle 5), was anzeigt, dass andere Ebene der Kern-Fukosylierung erschienen bei Krebserkrankungen mit unterschiedlichen Gewebe Herkunft. Unter den vier Gruppen, war das Niveau der Kern-Fukosylierung in HCC am höchsten ist, während die Fukosylierung Ebene bei Magenkrebs war die niedrigste, und war sogar niedriger als bei gesunden Kontroll.

N-Glycan Profilmuster in Magentumor und nicht-Tumorgewebe

N-Glycan-Profile wurden in desialylierte Protein aus Magentumor und nicht-Tumorgewebe untersucht. Die drei am häufigsten vorkommenden bigalacto biantennären Glycane zeigte im Serum, peak5 (NA2), peak6 (NA2F) und preak7 (NA2FB) wurden ebenfalls in Gewebeproteinen identifiziert (Abbildung 2A). Peak6 und Peak7 wurden bestätigt Kern-fucosyliert Strukturen aus peak5 nachbehandelt mit Kern-α-1, 6-Fucosidase Verdau (2A) dervied sein. Die Höhen dieser drei Peaks wurden unter Verwendung von GeneMapper Software analysiert. Das Verhältnis von peak6 zu peak5 war niedriger in Tumorgeweben als in benachbarten, nicht-Tumorgeweben (0,83 ± 0,18 vs 1,05 ± 0,42, 2B), sowie das Verhältnis von peak7 zu peak5 (0,13 ± 0,06 vs 0,16 ± 0,04, 2C). Allerdings gab es keine statistisch signifikanten Unterschiede (P > 0,05). Zwischen Tumor- und Nicht-Tumorgeweben

Verringerte Mengen an Gesamtkern Fucosylierung in beiden Seren und Geweben von Magenkrebs identifiziert

Da LCA spezifisch die Glykoproteine ​​mit α-1,6-fucosyliertes vernetzten N-Acetyl-D-Glucosamin-Asparagin (GlcNAc-Asp) in dem Kern trimannosyl erkennen, untersuchten wir die gesamten Kern fucosylierte Proteine ​​aus Seren und Gewebe in Magenkrebs LCA verwendet die Feststellung in DSA-FACE zu validieren. Im Serum war das Niveau der LCA-bindenden Kern Fucoseresten niedriger bei Magenkrebs als die in der Magengeschwür und gesunden Kontrollen (3A). Gesamtkern Fucose Fluss auch in Magentumoren, daß sie niedriger tendierten im Vergleich zu derjenigen in gepaarte benachbarte Gewebe (3B). Um zu bestimmen, ob die Veränderung der gesamten Kern Fucosylierung in Gewebe Magentumor ist relevant zur Veränderung der Glykosylierung Biosyntheseweg wurde quantitative RT-PCR verwendet, um die Fülle von Säugetier Fut8 und GDP-Tr in Magentumoren und benachbarte Gewebe zu analysieren. Die Ergebnisse zeigten, dass kein signifikanter Unterschied von Fut8 und GDP-Tr-mRNA-Expression wurden zwischen Tumoren und benachbarten Geweben (3C und 3D) beobachtet. Die relative Häufigkeit von Fut8 Protein wurde mit Western-Blot dargestellt (Rohdaten wurden in Abbildung S1 gezeigt). Die Fut8 in benachbarte Gewebe war signifikant höher als die in Tumorgeweben (P < 0,05) (Figur 3E). Immunhistochemie zeigte, dass das Fut8 war stark positiv an den luminalen Grenzen Nicht-Tumorzellen exprimiert Magen (4B), jedoch schwach positiv es in Tumorzellen exprimiert werden (4A). Die Expression von LCA-bindenden Kern-fucosyliert Glycoproteine ​​war höher in Nicht-Tumorzellen des Magens als die in Tumorzellen (4C, 4D). So wurde das Niveau des gesamten Kern Fukosylierung identifiziert verringerte sich in beiden Seren und Gewebe von Magenkrebs.

Wirkung von Fut8 und GDP-Tr auf die Proliferation und Migration in menschlichen Magenkrebszelllinien

menschlichen Magenkrebszelllinien, BGC-823 und SGC-7901 wurden in vitro-Studie verwendet. Da BGC-823 niedriger Ebene ausgedrückt des BIP-Tr während SGC-7901 niedrigere Fut8 in unserer Pilotstudie zum Ausdruck gebracht wurde pEGFP-N1-GDP-Tr in BGC-823 transfiziert für überexprimiert, GDP-Tr und pEGFP-N1- Fut8 war für überexprimierenden Fut8 in SGC-7901 transfiziert. erfolgreich umgesetzt wurden rekombinante Ausdrücke durch Reportergens GFP-Expression (Abbildung S2) gezeigt. Um die mögliche Beteiligung von GDP-Tr und Fut8 in Tumorproliferation und Migration, BGC-823 und SGC-7901-Zellen zu untersuchen wurden nach der Transfektion mit CCK-8 untersucht und Wundmigrationstest Heilung sind. Die Ergebnisse zeigten, dass upregulation des BIP-Tr BGC-823 Proliferation bei 2 Tage nach der Transfektion (5A und 5B) bei 2-5 Tage nach der Transfektion und Hochregulation von Fut8 verringert SGC-7901-Proliferation verringert. Diese Ergebnisse zeigten, dass eine hohe Expression des BIP-Tr und Fut8 konnte die Proliferation von menschlichen Magenkrebszellen unterdrücken. Wundheilungs Test zeigte, dass das BIP-Tr und Fut8 haben keinen signifikanten Einfluss auf die Migration in BGC-823 und SGC-7901 bei 48 h nach der Behandlung (5C und 5D).

Diskussion

Die Glykosylierung ist eine der häufigsten Modifikationen post-translationale in etwa 70% aller bekannten Proteine ​​erschienen. Änderungen in der Glykosylierung eine Rolle in einer vielfältigen Reihe von biologischen Phänomenen wie Metastasierung von Tumorzellen spielen, intrazelluläre Kommunikation und Entzündung [21] - [23]. Immer mehr Studien zeigen, dass die Änderungen der Glykosylierung und die Niveaus von Glycosyltransferasen Aktivitäten aus der malignen Transformation abgeleitet sind relevant für die menschliche Malignitäten [24] - [25]. DSA-FACE ist eine einfache und effiziente Technologie für N-Glycan Änderungen im Serum zu messen. Wir haben bisher diese Technologie in der Diagnose von HCC und CRC zu unterstützen [19] - [20]. In der aktuellen Studie verwendeten wir es charakteristisch, N-verknüpften Profilierungsmuster bei Magenkrebs zu analysieren. Die Ergebnisse zeigten, dass es deutlich unterschiedliche N-Glycan Profilmuster unter Magenkrebs, Magengeschwür und gesunden Kontrollen waren. Unter diesen verschiedenen Profilierungsmuster peak9 und sumfuc gefunden wurden in einem entgegengesetzten Muster in Magenkrebs geändert werden, im Vergleich zu denen bei den Kontrollen. Wie durch frühere Untersuchungen gezeigt, peak9 mit der Entwicklung von Sorten von Malignitäten assoziiert war, konnten wir bestätigen wieder, daß die triantennären N-Glycan-Struktur Fluss signifikant bei Magenkrebs erhöht und diese Änderung mit CEA zu korrelierenden offenbart worden, die gewöhnlich eine höchstens gebrauchte CRC Marker und ist ein sehr heterogener Glykoprotein, das 60% Kohlenhydrate [26] enthält. In einzelnen N-Glykanstruktur Fülle Analyse beobachteten wir, dass sumfuc signifikant bei Magenkrebs verringert wurde, verglichen mit den Kontrollen. Für diesen Befund bestätigen, führten wir Lectinblot in beiden Seren und Gewebe. Durch die Verwendung von HCC Serum als positive Kontrolle beobachteten wir verringert Fucosylierung von N-Glycane auf Gesamtproteine ​​in Seren von Magenkrebs. Ein ähnlicher Trend wurde im Magentumorgewebe ergab. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit unseren früheren Berichten über CRC [20]. Allerdings sind die Ergebnisse im Gegensatz zu früheren Berichten über Krebserkrankungen mit anderen Gewebe Herkunft. Die Erhöhungen in fucosylierten Oligosacchariden unter pathologischen Bedingungen wurden von anderen und unsere Gruppe [19] berichtet. Die fukosylierte AFP (AFP-L3) wurde als HCC Marker in der klinischen Praxis [25] verwendet. Die Widersprüche der Kern-Fucosylierung Ebenen erschienen in verschiedenen Krebsarten könnten durch unterschiedliche Gewebe spielen die verschiedenen Rollen zurückzuführen sein, z.B. Leber ist das wichtigste Organ für die Glykoproteine ​​neben Immunglobulin-produzierenden B-Lymphozyten produzieren [27] - [28].

Fukosylierung wird durch -Fucosyltransferasen katalysiert, Guanosin-5'-diphosphat (GDP) -fucose synthetische Enzyme und GDP-Fucose-Transporter (s). GDP-Fucose ist ein gemeinsames Donorsubstrat für alle -Fucosyltransferasen. Nach GDP-Fucose wurde im Zytosol synthetisiert wurde, wird es zum Golgi-Apparat durch GDP-Tr transportiert als Substrat für Fucosyltransferasen zu dienen [17], [29]. Daher ist das BIP-Tr ein Schlüsselfaktor für den GDP-Fucose synthetisiert Weg. Fut8 ist die einzige Fucosyltransferase in Core-Fucosylierung beteiligt [29]. Wir haben festgestellt verringerte Fut8 Proteinexpression in Tumorgewebe, die unsere Ergebnisse in Seren unterstützt. Jedoch war Fut8 mRNA-Expression keinen signifikanten Unterschied in Magentumoren und benachbarten Geweben. Glykosylierung ist stark reflektierend von Änderungen in der Umgebung einer Zelle. Epigenetischen Veränderungen am Genom stabil übertragen werden, um Tochterzellen ohne die Notwendigkeit für die genetische Sequenzänderungen. [30] Um zu klären, ob die verringerte Kern Fucosylierung spielt eine wichtige Rolle bei der Karzinogenese von Magenkrebs, erweiterten wir die Studie in Magenzelllinien in vitro. Wir fanden, dass das hochreguliert BIP-Tr und Fut8 Expression in menschlichen Magenkrebszellen zu niedrige Proliferation führen könnte. Aber wir konnten keine Auswirkungen der Kern-Fukosylierung auf die Zellmigration zu finden. Diese Ergebnisse helfen, das Potenzial Mechanismus zu erklären, warum Kern-Fukosylierung verringert erschienen bei Magenkrebs und diese nach unten reguliert Kern-Fukosylierung korreliert mit einigen bösartigen biologische Verhalten von Magenkrebszellen.

In den letzten Jahren gibt es mehrere Ergebnisse enthüllen, dass die Änderungen der Glykosylierung wichtige Rolle bei der Progression von Krankheiten neben Leberkrebs und Autoimmunerkrankungen spielen. Die wesentlichen Änderungen in der Glykosylierung von sekretierten Glykoproteine ​​enthalten eine Verringerung des Kern Fukosylierung erhöhte Verzweigung und erhöhte Sialylierung und Modifikationen an der epigenetischen Maschinen haben einen großen Einfluss auf die Glykanstrukturen von Zellen während der Ovarialkarzinom Progression erzeugt [30]. Die Höhe der Kern-fukosylierte biantennary Glykane und α-2,3-verknüpften Sialinsäuren wurden bei Prostatakrebs signifikant erhöht. [31] Es war eine Steigerung von 40% im Kern Fukosylierung in den wichtigsten sialylierten biantennary Glykane im Bauchspeicheldrüsenkrebs Serum, die indikativ für eine Teilmenge von tumorassoziierten glycoforms [32].

Vor kurzem hat die Funktion der Kern-Fucosylierung wäre wurde berichtet, mit der Funktion des EGFR [33] in Verbindung gebracht werden. Die Bindung von EGF an seinen Rezeptor erfordert Kern Fucosylierung von N-Glycane von EGFR.

• PLoS Genetics: Keimbahnmutationen in MAP3K6 sind mit Familial Magenkrebs assoziiert
• PLoS ONE: Entdeckung von Tumormarker für Magenkrebs von Proteomics