PLoS ONE: Toenemend Core-fucosylatie Draagt ​​bij aan Maligniteit bij maagkanker

Abstract

Het doel van de studie is om N-glycaan profilering veranderingen in verband met maagkanker te identificeren en te verkennen van de gevolgen van de kern-fucosylatie op biologische gedrag van menselijke maagkanker cellen. Een totaal van 244 onderwerpen, zoals maagkanker, maagzweer en gezonde controle werden gerekruteerd. N-glycaan-profilering uit serum en totale eiwitten in gastrische weefsels werd geanalyseerd door DNA-sequencer ondersteunde fluorofoor ondersteunde capillaire elektroforese. De overvloed van totale kern gefucosyleerd residuen en de expressie van enzymen betrokken bij kern-fucosylatie werden geanalyseerd met lectine blot kwantitatieve reverse transcriptie-polymerase kettingreactie, western blot, immunohistochemische kleuring en lectine-histochemische kleuring. De recombinante plasmiden van het BBP-fucose transporter en α-1,6-fucosyltransferase (Fut8) werden geconstrueerd en getransfecteerd in maagkanker cellijnen BGC-823 en SGC-7901. CCK-8 en wondgenezing assay werden gebruikt om de functionele gevolgen van kern-fucosylatie modulatie op celproliferatie en celmigratie beoordelen. Kenmerk serum N-glycaan-profielen werden gevonden bij maagkanker. In vergelijking met de gezonde controle, een trianntenary structuur overvloed piek 9 (NA3Fb) was significant verhoogd bij maagkanker, terwijl de totale overvloed aan kern gefucosyleerde residuen (sumfuc) werd verlaagd. -Kern gefucosyleerd structuren peak6 (NA2F) en peak7 (NA2FB) waren overleden gastrische tumorweefsels in vergelijking met die in naburige niet-tumorweefsels. Consequent, Lens culinaris agglutinine (LCA) -bindende eiwitten werden significant verlaagd in sera van maagkanker en eiwitniveau van Fut8 significant gastrische tumorweefsels afgenomen vergeleken met die in naburige niet-tumorweefsels. Opregulatie van het BBP-Tr en Fut8 kon proliferatie te remmen, maar had geen significante invloed op de migratie van BGC-823 en SGC-7901-cellen. Core-fucosylatie is vastgelegd geregeld bij maagkanker. Opregulatie van kern-fucosylatie van proliferatie van menselijke maagkanker inhiberen

Citation:. Zhao Y-P, Xu X-Y, M Fang, Wang H, U Q, Yi C-H, et al. (2014) Verminderde Core-fucosylatie Draagt ​​bij aan Maligniteit bij maagkanker. PLoS ONE 9 (4): e94536. doi: 10.1371 /journal.pone.0094536

Editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, de Verenigde Staten van Amerika

Ontvangen: 19 augustus 2013; Aanvaard: 17 maart 2014; Gepubliceerd: 14 april 2014

Copyright: © 2014 Zhao et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Het onderzoek werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (nr 81201697, 81101639 en nr 81271925); Wetenschap en Technologie Commissie van Shanghai Gemeente (No. 10ZR1439100 en nr 11JC1416400) .De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen.: de auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

de maagkanker (GC) is de vierde meest voorkomende vorm van kanker en de tweede meest voorkomende oorzaak van kanker gerelateerde sterfgevallen wereldwijd [1]. - [3], vooral voor in veel Aziatische landen, met name China [4]. Eiwitglycosylatiepatronen is een van de meest voorkomende posttranslationele modificaties aan eiwitten [5]. Glycanen kunnen eiwitten hetzij via een amidegroep (N-gebonden glycosylering) of een hydroxylgroep (O-gekoppelde glycosylatie), die ontstaan ​​door verschillende biosynthetische pathways en potentieel onafhankelijke functies worden gehecht [6]. N-gekoppelde glycosylering speelt een fundamentele rol in vele biologische processen zoals celadhesie, celmigratie en signaaltransductie [7]. Abnormale expressie van N-gekoppelde glycoproteïnen is waargenomen bij verschillende ziekten [8] - [10]. Na grondige karakterisering van N-gekoppelde glycoproteïnen en ziektegeassocieerde glycosylatieveranderingen zijn verschillende methoden ontwikkeld. In onze vorige studie hebben we een aantal N-glycan markers in heptatocellular carcinoom (HCC) en darmkanker met behulp van een capillaire elektroforese gebaseerd genaamd DNA-sequencer bijgestaan-fluorofoor bijgestaan ​​capillaire elektroforese (DSA-FACE) [11] vastgesteld. Bovendien is gerapporteerd dat α-1, 6-fucosyltransferase (Fut8) activiteit en expressie is verhoogd bij verschillende menselijke kankers, suggereert een rol voor dit enzym bij tumorontwikkeling en progressie, zoals HCC [12], colorectale kanker [ ,,,0],13], nonsmall cellige longkanker [14] en eierstok sereus adenocarcinoom [15]. Veranderde kern-fucosylatie is een van de belangrijkste geglycosyleerde abnormale modificatie die in maligniteiten. Fut8 katalyseert de overdracht van fucose van guanosinedifosfaat (GDP) -fucose de binnenste GlcNAc hybride en complexe N-gekoppelde Oligosacchariden via een α-1,6-koppeling, waardoor kern gefucosyleerde glycoproteïnen [16] - [17] en veranderen biologische functie van glycoproteïnen verkregen [18]. Hoewel veel studies het verband tussen gewijzigde kern-fucosylatie en andere agressieve tumoren gerapporteerd, voor zover wij weten, de invloed van de kern-fucosylatie op maagkanker blijft onbekend. In deze studie analyseerden we N-glycaan-profilering met DSA-FACE zowel serummonsters van maagkanker, maagzweer, gezonde weefsels en eiwitten van tumoren en naburige niet-tumoren. uit te breiden dan de functionele onderzoek op de geïdentificeerde specifieke glycosyleringen.

Materialen en methoden

Ethics Verklaring

De studie protocol werd goedgekeurd door de Chinese ethische commissie van Human Resources bij de Tweede militaire Medische Universiteit. Alle deelnemers aan de studie mits schriftelijke toestemming.

Studiepopulatie

In totaal zijn 105 patiënten met maagkanker (n = 80) en maagzweren (n = 25) werden ingeschreven tussen december 2007 en oktober 2010 at Changzheng ziekenhuis van de Tweede Militaire Medische Universiteit (Shanghai, China). Alle gevallen maagkanker ingeschreven werden histopathologisch bevestigd door 2 pathologen en gevallen met een maagzweer gerekruteerd werden bevestigd door gastroscoop. Patiënten met maagkanker die preoperatieve chemotherapie en die hadden andere ziekten waaronder infecties werden uitgesloten van de studie. Serum monsters werden verkregen voor chirurgische resectie. Voor een controle groep, werden 139 leeftijd gematchte, gezonde vrijwilligers ingeschreven uit een pool van kanker-vrije individuen die hetzelfde ziekenhuis bezocht voor een regelmatige lichamelijk onderzoek en die vrijwillig aan het onderzoek mee in dezelfde periode. We definieerden een gezond persoon als iemand die vrij van aandoeningen (waaronder geen geschiedenis van kanker) bij health check-up werd geacht. De volgende klinische kenmerken van de patiënten werden verkregen bij de volbloeddonatie. Een samenvatting van de gegevens van deze onderwerpen wordt in Tabel 1. De voortgang van alle patiënten met maagkanker werd geclassificeerd volgens de Unie International Cancer Control (UICC) TNM criteria voor maagkanker, 13 patiënten (16,25%) hadden stadium I, 24 patiënten (30,00%) hadden fase II, 30 patiënten (37,5%) hadden stadium III en 13 patiënten (16,25%) had stadium IV. De gemiddelde leeftijd van de patiënten was 54,35 ± 6,69 inclusief 60 mannen en 20 vrouwen. Serum werd verzameld met behulp van een standaard protocol uit vol bloed, behandeld door centrifugatie bij 10.000 g gedurende 20 minuten, en opgeslagen bij -80 ° C.

N-Glycan profilering serumeiwitten

serumeiwitten N-glycaan-analyses werden uitgevoerd zoals eerder [11] beschreven. Kort samengevat, de N-glycanen aanwezig op de eiwitten in 2 pl serum werden uitgebracht met peptide N-glycosidase-F (PNGaseF) (New England Biolabs, Boston, MA) en vervolgens gemerkt met 8-aminonaphtalene-1, 3, 6- trisulfonzuur (APTS) (Invitrogen, Carlsbad, Calif) .Sialic zuur werd verwijderd met Arthrobacter ureafaciens sialidase (Roche Bioscience, Palo Alto, Calif), en de verwerkte monsters werden geanalyseerd met DSA-FACE-technologie met behulp van een capillaire elektroforese-gebaseerde ABI3500 Genetische analyzer (Applied Biosystems, Foster City, Californië). De 9 meest intense pieken die in alle monsters gedetecteerd (samen deze pieken opgenomen > 90% van het totaal serum N-glycanen) werden geanalyseerd met GeneMapper software (Applied Biosystems). Elke structuur van N-glycaan werd numeriek beschreven door het normaliseren van de hoogte op de som van de hoogten van de pieken.

weefselmonsters

Alle weefsels werden volgens de Institutional Review Board Reglement de Tweede Militaire Medische Universiteit. Weefselmonsters werden verkregen from10 van 80 patiënten met maagkanker. Weefsel monsters die 2 segmenten, een tumorweefsel en een naastgelegen niet-tumorweefsel. Gepaarde weefselmonsters (ongeveer 0,5 x 0,5 x 0,5 cm ^{3, gedupliceerd voor elk monster) geselecteerd werden hetzij onmiddellijk bevroren bij -80 ° C voor RNA en eiwit extractie of in 10% gebufferde formaline gefixeerd tot 24 uur en vervolgens verwerkt tot een paraffine ingebedde blokken en bewaard bij kamertemperatuur histochemische kleuring.}

N-Glycan profilering van weefsel eiwitten en structuuranalyse uitgaande van exoglycosidase digestie

De eiwitten werden van ongeveer 25 mg bevroren weefselmonsters geëxtraheerd . De weefselmonsters werden opgeschort en pestled in lysisbuffer die proteaseremmers cocktail (Roche Diagnostics, Meylan, Frankrijk). Gelyseerde delen werden verwijderd door centrifugatie (12.000 g gedurende 10 minuten bij 4 ° C) tweemaal. De concentratie van opgeloste eiwitten werd bepaald onder gebruikmaking van de BCA kit (Pierce Biotechnology /Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) en het eiwit monsters werden opgeslagen bij -80 ° C tot gebruik. Een totaal van 40 ug weefsel eiwitten werden gebruikt voor N-glycaan-profielen met reguliere suikerpatronen profilering werkwijze dezelfde als die uitgevoerd in serum bovenbeschreven stellen. Core-α-1, 6-gefucosyleerd N-glycan structuren, een geschikt aantal-APTS gemerkte N-glycanen werden gedigereerd met zowel Arthrobacter ureafaciens sialidase en bovine kidney α-1, 6-fucosidase (Prozyme, San Leandro, CA identificeren , VERENIGDE STATEN VAN AMERIKA). DSA-FACE-technologie werd gebruikt om de omzettingsproducten analyseren en GeneMapper software werd gebruikt om de hoogte van de pieken analyseren.

RNA-extractie en kwantitatieve real-time PCR

Totaal RNA werd geëxtraheerd uit bevroren weefsels en cellen, met behulp van totale RNA-extractie kit volgens de instructies van de fabrikant (Axygen Biosciences, Hangzhou, China). De zuiverheid en concentratie van RNA werden bepaald door spectrofotometer (Eppendorf, Hamburg, Duitsland) en vervolgens bij -80 ° C tot gebruik bewaard. Het cDNA werd gesynthetiseerd met behulp ReverTra Ace-α-RT-PCR kit (Toyobo Co., Osaka, Japan) volgens de instructies van de fabrikant. Primers werden ontworpen met behulp van de Primer Express programma (Applied Biosystems, de sequenties worden getoond in Tabel S1). Kwantitatieve real-time PCR werd uitgevoerd met behulp van SYBR® Green real-time PCR Master Mix kit (Toyobo Co., Osaka, Japan) en werd geanalyseerd op Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR systeem (ABI, Foster City, CA, USA) . Alle assays werden onafhankelijk in drievoud uitgevoerd. PCR cycling bestond uit denaturatie bij 95 ° C gedurende 5 minuten, gevolgd door 40 cycli bij 95 ° C gedurende 15 seconden en bij 59 ° C of 55 ° C gedurende 15 seconden en detectie voor 45 seconden bij 72 ° C. De relatieve hoeveelheid Fut8 of guanosinedifosfaat (GDP) -fucose transporter (GDP-Tr) transcripten in elk monster werd genormaliseerd op de huishoudgen β-actine en glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH) door het aftrekken van de cyclus. De niveaus van genexpressie werden bepaald met Delta-Delta Ct methode. Absolute transcript expressie waarden boven 40 cycli werden onder detecteerbare niveaus beschouwd. Smelt curven werden gecontroleerd voor elke reactie te garanderen dat een enkel product werd geamplificeerd.

Western blot en lectine blot

Eiwitten werden geëxtraheerd uit bevroren weefsel de procedure hierboven beschreven, en een totaal van 50 pg eiwitten werden gescheiden door elektroforese in 10% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gel (SDS-PAGE). Gels werden gekleurd met Coomassie blauw G250 of proteïnen in de gel werden overgebracht op een nitrocellulosemembraan () voor het detecteren van Fut8 of het percentage kern gefucosyleerde eiwitten. Voor serummonsters, in totaal 85 gevallen van maagkanker (n = 80), maagzweren (n = 25) en gezonde controlepersonen (n = 30) werden gebruikt voor SDS-PAGE en lectine- blot. De membranen werden gedurende de nacht geblokkeerd bij 4 ° C met 5% magere melk eiwit of 5% runderserumalbumine in tris-gebufferde zoutoplossing [140 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (TBS)] en vervolgens gedurende 2 uur bij kamertemperatuur 1:100 verdund anti-humaan Fut8 antilichaam (15C6, anti-humaan Fut8, Fujirebio Corp., Japan) en 5 ug /ml gebiotinyleerd lensculinaris A agglutinine (LCA) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) in TBS bevattende 0,05% Tween-20 (TBST buffer), en vervolgens geïncubeerd met een verdunning van 1:10,000 fluorescent gelabelde secundaire antilichamen (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) of IRDye 800CW streptavidine (LI-COR Biosciences) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd . De membranen werden ontwikkeld met de Odyssey IR Imaging System. Anti-beta actine (1:2000) werd gebruikt voor interne referentie antilichaam voor western-blot. Gezuiverd albumine werd gebruikt als negatieve controle voor lectine blot en totaal eiwit gekleurd met Coomassie blauw werd gebruikt om het percentage kern gefucosyleerde eiwit te berekenen.

immunohistochemische (IHC) kleuring en lectine-histochemische kleuring

De vaste weefselmonsters ingebed in paraffine werden gesneden in 4-mm-zieken plakken voor immunohistochemische kleuring voor Fut8 en lectine-histochemische kleuring voor LCA. Na deparaffineren, rehydratatie, endogeen peroxidase geblokkeerd en antigeenterugtrekking (10 mM Tris /1 mM EDTA, pH 9,0, autoclaaf behandeld) ondergingen, werden monsters geïncubeerd met een muizen monoklonaal antilichaam tegen humaan Fut8 (1:100) of gebiotinyleerd LCA (1 :500) overnacht bij 4 ° C, en vervolgens met mierikswortel peroxidase-geconjugeerd secundair antilichaam of fluoresceïne gemerkt streptavidine bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Kernen werden tegengekleurd met hematoxyline of DRAQ5. Negatieve controle was samengesteld uit identiek behandeld histologische secties met de muis IgG te vervangen muis Fut8.

cellijnen en cultuur

De menselijke maagkanker cellijnen, BGC-823 en SGC-7901, werden aangekocht van het Shanghai Institute of Cell Biology, de Chinese Academie van Wetenschappen en gekweekt bij 37 ° C onder 5% CO _{2 in RPMI 1640-medium en DMEM-medium (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), respectievelijk met 10% FBS, 1% glutamine, en 1% antibioticum oplossing.}

de bouw van het bbp-Tr en Fut8 recombinante plasmiden en transfectie van maagkanker cellen

de pEGFP-N1-GDP-Tr en de pEGFP-N1 -Fut8, het plasmide vector dat codeert voor humaan BBP-Tr of Fut8, werd gegenereerd door het invoegen van het BBP-Tr of Fut8 cDNA in een pEGFP-N1 vector (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA), die een CMV-promotor en SV40 vroege promoter, en het neomycine /kanamycine resistentie gen van Tn5. De vector backbone bevat ook een SV40 oorsprong van replicatie in zoogdiercellen. De meervoudige kloneringsplaats (MCS) naast de onmiddellijk vroege promotor van CMV. De menselijke GDP-Tr of Fut8 gen werd gekloneerd uit het mRNA geëxtraheerd met TRIzol reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) uit menselijk leverweefsel door het uitvoeren van RT-PCR met de primers (tabel S2) waarin de XhoI en KpnI restrictieplaatsen bevatten, digereren met XhoI en KpnI en het ligeren in de pEGFP-N1. De pEGFP-N1-GDP-Tr of pEGFP-N1-Fut8 werd getransfecteerd in Escherichia coli DH5a voor amplificatie en DNA sequentiebepaling werd gebruikt om de betrouwbaarheid te waarborgen. Plasmide DNA werd bereid met de Qiagen DNA mini kit (Qiagen, Hilden, Duitsland) volgens de instructies van de fabrikant. Plasmiden werden getransfecteerd in de menselijke maagkanker cellijnen, BGC-823 en SGC-7901 bij 80% confluentie en 5 x 10 ^{5 cellen per putje in een zes-well plaat met de Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, USA ) volgens de instructies van de fabrikant. De getransfecteerde cellen die het doelwit gen tot expressie werd bevestigd door kwantitatieve RT-PCR.}

celproliferatie assay

celproliferatie assays werden uitgevoerd met Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Dojin, Japan) volgens de instructies van de fabrikant. Celgroei werd gemeten elke 24 uur gedurende 5 dagen, en voor elk tijdstip werd in duplo uitgevoerd. De absorptie werd gemeten voor elke wel bij een golflengte van 450 nm.

wondgenezing assay

Voor de wondgenezing assay, de menselijke maagkanker cellijnen, BGC-823 en SGC-7901 ( 1 x 10 ^{5 cellen /35 x 11 mm schalen) werden gezaaid en gedurende 24 uur bij 37 ° C en vervolgens getransfecteerd met recombinant plasmiden. Na het bereiken van samenvloeiing, werd de cellaag in elke plaat gekrast met een plastic pipet tip. De migratie van de cellen op de rand van de kras werd geanalyseerd 0, 24 en 48 uur werden de opnamen en geanalyseerd met Leica fluorescentiemicroscoop en gekoppeld beeldanalysesoftware (Comet Assay IV Image Analysis System, PI, UK).}

Routine Tumor Maker Detectie

Klinische en biochemische gegevens van de patiënten worden samengevat in tabel 1. Routine biochemische testen werden gemeten onder toepassing van standaardwerkwijzen en gekoppeld reagentia (Hitachi 7600 Analyzer (Hitachi, Tokyo, Japan) . Tumor marker niveaus, met inbegrip van koolhydraten antigeen 19-9 (CA19-9), carcino-embryonaal antigeen (CEA), Cytokeratin 19 (CK19), CA125 en CA724, werden bepaald op een Roche E170 modulair met matchende reagentia.

Statistische analyse

Alle kwantitatieve variabelen werden uitgedrukt als gemiddelden ± standaarddeviaties tenzij anders vermeld. kwantitatieve variabelen werden vergeleken met de Student t test, variantieanalyse (ANOVA), of parametrische toetsen. Pearson correlatie coëfficiënten (Spearman coëfficiënten correlatie berekend voor ordinale categorische variabelen) en de bijbehorende waarschijnlijkheid ( p
) gebruikt om correlaties tussen parameters te evalueren. Alle gemelde p
waarden waren 2 staart, en p
waarden < 0,05 werden beschouwd als statistisch significant. Statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS 16.0 voor Windows statistische software (SPSS Inc.).

Resultaten

Verschillende serum N-Glycan profilering patronen bij maagkanker, maagzweer en gezonde controles

gebruiken DSA-FACE onderzochten wij de N-glycaan-profielen gedesialyleerde sera van patiënten met maagkanker (n = 80), maagzweren (n = 25), en leeftijd gematchte gezonde individuen (n = 139). Wij gekwantificeerd en statistisch vergeleken pieken bij 3 verschillende groepen. Minstens 9 N-glycaan structuren (pieken) werden in alle monsters (Figuur 1A). De structuuranalyse van deze N-glycanen werd eerder gepubliceerd door Callewaert [11]. De gemiddelde relatieve abundantie van deze N-glycaan structuren beschreven in Tabel 2. De grote verscheidenheid aan structuren in de pieken 2, 3, 5, 6, 7, 8 en 9 blijkt statistisch significante verschillen tussen de maagkanker, maagzweer en gezonde controle groepen, wat aangeeft dat de verschillende N-glycaanpatronen verscheen in verschillende pathofysiologische omstandigheden. Vergeleken met de gezonde controlegroep, peak5 (bigalacto biantennaire glycan, NA2) en peak9 (vertakking α-1,3-gefucosyleerd triantennaire glycan, NA3Fb) werden verhoogd (P < 0,001) (Figuur 1B); terwijl kern- gefucosyleerd pieken, zoals peak2 (agalacto kern-α-1,6-gefucosyleerd splitsend biantennaire glycan, NGA2FB), peak3 (single agalacto kern-α-1,6-gefucosyleerd biantennaire glycan, NG1A2F), peak6 (bigalacto kern -α-1,6-gefucosyleerd biantennaire glycan, NA2F) en peak7 (bigalacto kern-α-1,6-gefucosyleerd splitsend biantennaire glycan, NA2FB) werden afgenomen in de maagkanker groep (P < 0,001). Ook de overvloed aan kern gefucosyleerde structuur glycanen genoemd sumfuc (geeft de totale kern gefucosyleerd structuren, waaronder piek 1, 2, 3, 4, 6 en 7) was significant verminderd in de maagkanker (P < 0,001) (Figuur 1C ). De maagkanker groep werd verder onderverdeeld in 4 subgroepen aan TNM Staging van UICC voor maagkanker. De structuur overvloed en sumfuc niet significant veranderen tussen de 4 verschillende subgroepen; echter werd sumfuc geleidelijk af met progressie stadia van maagkanker (tabel 3).

Correlatie tussen N-glycanen en routine tumormarkers

Tot op heden CEA nog veel gebruikt voor het screenen en bewaking van maagkanker. We analyseerden de correlaties tussen individuele N-glycan marker met CA19-9, CEA, CK19, CA125 en CA724. De Pearson correlatie analyse gaf aan dat CEA positief werd geassocieerd met peak1 (r = 0,19; P < 0,01), en peak9 (r = 0,28; P < 0,01), terwijl een negatieve met peak6 (r = -0,18; P < 0,01) en peak8 (r = -0,23, P < 0,01). (Tabel 4)

Vergelijking van sumfuc tussen maagkanker en andere kankers spijsverteringsstelsel

Eerder hebben we de N-Glycan profilering van hepatocellulair carcinoom bestudeerd (HCC) [19] en colorectale kanker (CRC) [20]. De overvloed aan sumfuc bleek statistisch significante verschillen tussen de maagkanker (41,32 ± 6,39), HCC (50,99 ± 8,39), CRC (45,33 ± 5,96) en gezonde controlepersonen (47,67 ± 5,08) groepen (P < 0,001, Tabel 5) dat aangeeft dat verschillend niveau van de kern-fucosylatie verscheen in kankers met verschillende weefsel oorsprong. Onder de 4 groepen, het niveau van de kern-fucosylatie in HCC was het hoogst, terwijl de fucosylatie niveau maagkanker het laagst, en zelfs lager dan die bij gezonde controle.

N-Glycan profilering patronen maagtumor en niet-tumorweefsels

N-glycaan-profielen werden gedesialyleerd eiwit van maagtumor en niet-tumorweefsels onderzocht. De drie meest voorkomende bigalacto biantennaire glycanen toonde in serum, peak5 (NA2), peak6 (NA2F) en preak7 (NA2FB) geïdentificeerd die in het weefsel (Figuur 2A). Peak6 en Peak7 werden bevestigd aan de kern-gefucosyleerde structuren dervied van peak5 na behandeling met kern-α-1, 6-fucosidase spijsvertering (figuur 2A) zijn. De hoogtes van deze drie pieken werden geanalyseerd met GeneMapper software. De verhouding van peak6 tot peak5 lager in tumorweefsels dan in naburige niet-tumorweefsels (0,83 ± 0,18 vs 1,05 ± 0,42, figuur 2B), en de verhouding van peak7 tot peak5 (0,13 ± 0,06 vs 0,16 ± 0,04, Figuur 2C). Echter, er waren geen statistisch significante verschillen (P > 0,05). Tussen tumor en niet-tumorweefsels

verlaagde totale kern fucosylatie gewezen in sera en weefsels van maagkanker

Omdat LCA kan specifiek herkennen glycoproteïnen met α-1,6-gefucosyleerd-linked N-acetyl-D-glucosamine-asparagine (GlcNAc-Asp) in de trimannosyl kern hebben we de totale kern gefucosyleerde eiwitten van sera en weefsels bij maagkanker middels LCA tot de vaststelling in DSA-FACE valideren. In serum, het niveau van LCA bindende kern fucoseresiduen lager in maagkanker dan in de maagzweer en gezonde controles (Figuur 3A). Totaal kernfucose overvloed neeg ook lager in de maag tumoren in vergelijking met die in gepaarde aangrenzende weefsels (Figuur 3B). Om te bepalen of de verandering van de totale kern fucosylatie gastrische tumorweefsel tot wijziging van de glycosylering biosyntheseroute relevant is, werd kwantitatieve RT-PCR gebruikt om de overvloed aan zoogdieren Fut8 en GDP-Tr analyseren maagtumoren en aangrenzende weefsels. De resultaten lieten zien dat er geen significant verschil in Fut8 en GDP-Tr mRNA expressie waargenomen tussen tumoren en aangrenzende weefsels (Figuur 3C en 3D). De relatieve overvloed aan Fut8 eiwit werd geïllustreerd met behulp van western blot (raw data werd weergegeven in figuur S1). De Fut8 in aangrenzende weefsels was significant hoger dan in tumorweefsels (P < 0,05) (Figuur 3E). Immunohistochemie toonde dat de Fut8 sterk positief werd uitgedrukt aan de luminale grens van niet-tumor- gastrische cellen (Figuur 4B), maar het zwak positieve expressie in tumorcellen (Figuur 4A). De expressie van LCA-binding-kern gefucosyleerde glycoproteïnen hoger in niet-tumor cellen maag dan in tumorcellen (Figuur 4C, 4D). Dus, het niveau van de totale kern fucosylatie geïdentificeerd verminderd in zowel serum en weefsels van maagkanker.

Effect van Fut8 en GDP-Tr op de proliferatie en migratie in menselijke maagkanker cellijnen

De menselijke maagkanker cellijnen, BGC-823 en SGC-7901 werden in vitro onderzoek. Sinds BGC-823 uitgedrukt lagere niveau van het BBP-Tr terwijl SGC-7901 lager Fut8 in onze pilot-onderzoek uitgedrukt, werd pEGFP-N1-bbp-Tr getransfecteerd in BGC-823 voor overexpressie BBP-Tr en pEGFP-N1- Fut8 was getransfecteerd in SGC-7901 voor overexpressie Fut8. Recombinante expressies werden met succes aangetoond door reportergen GFP expressie (Figuur S2). Om de mogelijke betrokkenheid van het BBP-Tr en Fut8 in tumor proliferatie en migratie te onderzoeken, BGC-823 en SGC-7901-cellen werden onderzocht na transfectie met behulp van CCK-8 en wondgenezing respectievelijk migratie test. De resultaten toonden aan dat opregulatie van GDP-Tr verlaagde BGC-823 proliferatie 2-5 dagen na transfectie en opregulatie van Fut8 verminderde SGC-7901 proliferatie op 2 dagen na transfectie (figuur 5A en 5B). Deze resultaten toonden aan dat hoge expressie van GDP-Tr en Fut8 de proliferatie van menselijke maagkanker cellen kunnen onderdrukken. Wondgenezing assay aangetoond dat het BBP-Tr en Fut8 hebben geen significante invloed op de migratie in BGC-823 en SGC-7901 op 48 uur na de behandeling (figuur 5C en 5D).

Discussie

glycosylering is een van de meest voorkomende posttranslationele modificaties verscheen in ongeveer 70% van alle bekende eiwitten. Veranderingen in de glycosylering een rol spelen in een diverse reeks biologische fenomenen zoals tumorcelmetastase, intracellulaire communicatie en ontsteking [21] - [23]. Steeds meer studies geven aan dat de veranderingen van glycosylering en de niveaus van glycosyltransferasen activiteiten afgeleid van de maligne transformatie menselijke maligniteiten [24] relevant - [25]. DSA-FACE is een eenvoudige en efficiënte technologie voor het meten van N-glycaan veranderingen in serum. We hebben eerder deze technologie gebruikt om te helpen bij de diagnose van HCC en CRC [19] - [20]. In de huidige studie, we gebruikten het karakteristieke N-gekoppelde profielen patroon in maagkanker analyseren. De resultaten geven aan dat er significant verschillend suikerpatronen profilering patronen bij maagkanker, maagzweer en gezonde controles. Onder deze verschillende profilering patronen, peak9 en sumfuc gevonden in tegengestelde patroon bij maagkanker worden veranderd vergeleken met die in de controlegroep. Zoals blijkt uit eerder onderzoek werd peak9 geassocieerd met de ontwikkeling van soorten tumoren bevestigden wij opnieuw dat de triantennaire N-glycaan structuur overvloed in maagkanker aanzienlijk toe en deze verandering was geopenbaard worden gecorreleerd met CEA, hetgeen een vaakst gebruikte CRC marker en is een zeer heterogeen glycoproteïne dat 60% koolhydraten [26] bevat. In individuele N-glycaan structuur overvloed analyse hebben we vastgesteld dat sumfuc aanzienlijk bij maagkanker was afgenomen vergeleken met de controlegroep. Voor deze bevinding verder te valideren, voerden we lectine vlek zowel in sera en weefsels. Via HCC serum als een positieve controle, zagen we verminderde fucosylatie van N-glycanen in de totale eiwitten in sera van maagkanker. Een soortgelijke trend werd onthuld in de maag tumor weefsels. Deze bevindingen zijn consistent met onze eerdere rapporten over CRC [20]. Maar de resultaten zijn in tegenstelling tot eerdere verslagen over kanker met andere weefsel oorsprong. De toename gefucosyleerd oligosacchariden onder pathologische omstandigheden gerapporteerd door anderen en onze fractie [19]. De gefucosyleerde AFP (AFP-L3) werd gebruikt als marker HCC klinische praktijk [25]. De tegenstrijdigheden van de kern-fucosylatie niveaus verscheen in verschillende kankers kan het gevolg zijn van de verschillende taken van verschillende weefsels, b.v. lever is het belangrijkste orgaan verantwoordelijk voor de productie glycoproteïnen naast immunoglobuline producerende B-lymfocyten [27] - [28].

fucosylatie wordt gekatalyseerd door fucosyltransferases, guanosine-5'-difosfaat (BBP) -fucose synthetische enzymen, en GDP-fucose vervoerder (s). GDP-fucose is een gemeenschappelijk donorsubstraat alle fucosyltransferases. Na GDP-fucose gesynthetiseerd in het cytoplasma wordt getransporteerd naar het Golgi-apparaat tot GDP-Tr te dienen als een substraat voor fucosyltransferases [17], [29]. Daarom is het BBP-Tr is een belangrijke factor voor de BBP-fucose gesynthetiseerd route. Fut8 de enige fucosyltransferase die deze kern-fucosylatie [29]. We hebben geconstateerd daalde Fut8 eiwit expressie in tumorweefsel, die onze bevindingen in sera ondersteund. Echter, Fut8 mRNA expressie was geen significant verschil in de maag tumoren en aangrenzende weefsels. Glycosylering sterk reflecterende veranderingen in het milieu van een cel. Epigenetische modificaties aan het genoom stabiel zijn doorgegeven aan dochtercellen zonder de noodzaak voor genetische sequentie veranderingen. [30] te onderzoeken of de verminderde kern fucosylatie een belangrijke rol bij carcinogenese maagkanker speelt, we verlengden de studie maag cellijnen in vitro. We vonden dat de opgereguleerd GDP-Tr en Fut8 expressie in menselijke maagkanker cellen kan leiden tot lage proliferatie. Maar we hebben geen enkel effect van de kern-fucosylatie op celmigratie te vinden. Deze resultaten helpen de potentiële mechanisme waarom verminderde kern- fucosylatie verscheen bij maagkanker en dit downgereguleerde-kern-fucosylatie gecorreleerd met enige kwaadaardige biologisch gedrag van maagkanker cellen verklaren.

De laatste jaren zijn er verschillende resultaten onthullen dat de veranderingen van glycosylering speelt een belangrijke rol in de progressie van ziekten naast leverkanker en auto-immuunziekten. De significante veranderingen in de glycosylering van uitgescheiden glycoproteïnen opgenomen een vermindering kern fucosylatie, toegenomen vertakking en verhoogde sialylering en wijzigingen van de epigenetische machine een diepgaand effect op de glycan structuren die door cellen tijdens eierstokkanker progressie [30]. De niveaus van-core gefucosyleerde biantennaire glycanen en α-2,3-gekoppelde siaalzuren waren significant verhoogd bij prostaatkanker. [31] Er was een toename van 40% in de kern van fucosylatie in de belangrijkste gesialyleerde biantennaire glycanen in de alvleesklierkanker serum, die indicatief zijn voor een subset van tumor geassocieerde glycovormen [32] was.

Onlangs heeft de functie van kern-fucosylatie werd in verband gebracht met de functie van EGFR [33]. De binding van EGF aan zijn receptor vereist kern fucosylatie van N-glycanen van EGFR.

• PLoS Genetics: kiembaanmutaties in MAP3K6 worden geassocieerd met Familiaire Gastric Cancer
• PLoS ONE: Ontdekking van Tumor Markers voor maagkanker door Proteomics