PLOS ONE: Diminué Core-fucosylation Contribue à malignité dans le cancer gastrique

Résumé

Le but de l'étude est d'identifier les changements de profilage N-glycanes associés au cancer de l'estomac et d'explorer l'impact des core-fucosylation sur les comportements biologiques des cellules cancéreuses gastriques humaines. Un total de 244 sujets, y compris le cancer gastrique, ulcère gastrique et de contrôle en bonne santé ont été recrutés. Le profilage des N-glycanes à partir de sérum et de protéines totales dans les tissus gastriques a été analysé par électrophorèse capillaire séquenceur d'ADN assistée assistée par fluorophore. L'abondance des résidus de noyau fucosylé totaux et l'expression des enzymes impliquées dans le noyau fucosylation ont été analysées par transfert de lectines, réaction quantitative de la chaîne polymérase-transcription inverse, Western Blot, la coloration immunohistochimique et coloration à la lectine histochimique. Les plasmides recombinants de GDP-fucose transporteur et α-1,6-fucosyltransférase (FUT8) ont été construits et transfectés dans des lignées cellulaires de cancer gastrique BGC-823 et SGC-7901. CCK-8 et de cicatrisation dosage ont été utilisés pour évaluer l'impact fonctionnel de base-fucosylation modulation sur la prolifération cellulaire et la migration. profils de N-glycane sériques Caractéristique ont été trouvés dans le cancer gastrique. Par rapport au témoin sain, une structure abondance trianntenary, pic 9 (NA3Fb), a été augmenté de façon significative dans le cancer gastrique, tandis que l'abondance totale des résidus de base-fucosylé (sumfuc) a diminué. structures de noyau fucosylé, PEAK6 (NA2F) et (peak7 NA2FB) sont décédés dans les tissus tumoraux gastriques par rapport à celle dans les tissus non tumoraux adjacents. Systématiquement, l'agglutinine de Lens culinaris (LCA) les protéines de liaison d'été diminué de manière significative dans le sérum du cancer de l'estomac, et le niveau de FUT8 de protéine a été diminué de manière significative dans les tissus tumoraux gastriques par rapport à celle dans les tissus non tumoraux adjacents. La régulation positive du PIB-Tr et FUT8 pourrait inhiber la prolifération, mais n'a pas eu d'influence significative sur la migration des BGC-823 et les cellules SGC-7901. Core-fucosylation est bas réglementé dans le cancer gastrique. La régulation positive du core-fucosylation pourrait inhiber la prolifération des cellules cancéreuses gastriques humaines

Citation:. Zhao Y-P, Xu X-Y, Fang M, Wang H, Q Vous, Yi C-H, et al. (2014) Diminution de Core-fucosylation Contribue à malignité dans le cancer gastrique. PLoS ONE 9 (4): e94536. doi: 10.1371 /journal.pone.0094536

Editeur: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Etats-Unis d'Amérique

Reçu le 19 Août 2013; Accepté le 17 Mars 2014; Publié le 14 Avril, 2014

Droit d'auteur: © 2014 Zhao et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. L'étude a été soutenu par la national science Foundation naturel de la Chine (n ° 81201697, 81101639 et n ° 81271925); Science et technologie Commission de la municipalité de Shanghai (n ° 10ZR1439100 et n ° 11JC1416400) .Les bailleurs de fonds n'a joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents.: les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

le cancer gastrique introduction (GC) est le quatrième cancer le plus fréquent et la deuxième cause la plus fréquente de cancer lié décès dans le monde [1]. - [3], particulièrement répandue dans de nombreux pays asiatiques, en particulier la Chine [4]. Glycosylation des protéines est l'une des modifications post-traductionnelles les plus courantes apportées aux protéines [5]. Glycanes peuvent être attachés à des protéines soit par l'intermédiaire d'un groupe amide (de N-glycosylation) ou un groupe hydroxyle (de O-glycosylation), qui se produire à travers différentes voies biosynthétiques et ont potentiellement des fonctions indépendantes [6]. N-glycosylation joue un rôle fondamental dans de nombreux processus biologiques tels que l'adhésion cellulaire, la migration cellulaire et la transduction du signal [7]. une expression anormale de glycoprotéines N-lié a été observé dans diverses maladies [8] - [10]. Lors de la caractérisation en profondeur de glycoprotéines N-liés et les changements de glycosylation associés à la maladie, plusieurs méthodes ont été développées. Dans notre étude précédente, nous avons identifié certains marqueurs N-glycanes dans le carcinome heptatocellular (HCC) et le cancer du côlon à l'aide d'une électrophorèse capillaire à base appelée ADN électrophorèse capillaire assistée fluorophore assistée séquenceur (DSA-FACE) [11]. En outre, il a été rapporté que les α-1, 6-fucosyltransférase (FUT8) L'activité et l'expression est augmentée dans plusieurs cancers humains, ce qui suggère un rôle de cette enzyme dans le développement et la progression tumorale, comme le HCC [12], un cancer colorectal [ ,,,0],13], le cancer non à petites cellules du poumon [14] et un adénocarcinome séreux de l'ovaire [15]. Altered noyau-fucosylation est une des plus importantes modifications glycosylée anormaux identifiés dans les tumeurs malignes. FUT8 catalyse le transfert de fucose à partir de guanosine diphosphate (GDP) -fucose au GlcNAc le plus interne d'hybride et d'oligosaccharides complexes liés par N par l'intermédiaire d'un 1,6-liaison α, entraînant les glycoprotéines de noyau fucosylé [16] - [17] et altérer la fonction biologique de glycoprotéines résultant [18]. Bien que de nombreuses études ont rapporté l'association entre modifiée core-fucosylation et d'autres tumeurs agressives, à notre connaissance, l'influence du noyau fucosylation sur le cancer gastrique reste inconnue. Dans cette étude, nous avons analysé le profilage N-glycane avec DSA-FACE dans les deux échantillons de sérum de cancer gastrique, ulcère gastrique, les contrôles sains et les protéines de tissus provenant de tumeurs et de non-tumeurs adjacentes. Puis étendre la recherche fonctionnelle sur les glycosylations spécifiques identifiés.

Matériel et méthodes

Ethique Déclaration

Le protocole d'étude a été approuvé par le Comité d'éthique chinois des Ressources humaines à la deuxième Université médicale militaire. Tous les participants à l'étude ont donné par écrit leur consentement éclairé.

Population
Étude

Au total, 105 patients atteints de cancer gastrique (n = 80) et l'ulcère gastrique (n = 25) ont été inscrits entre Décembre 2007 et Octobre 2010 à l'Hôpital Changzheng de la deuxième université médicale militaire (Shanghai, Chine). Tous les cas de cancer gastrique ont été inscrits histopathologique confirmée par 2 pathologistes et des cas d'ulcère gastrique recrutés ont été confirmées par gastroscope. Les patients atteints de cancer gastrique ayant reçu une chimiothérapie préopératoire, et qui avaient d'autres maladies, y compris les infections ont été exclus de l'étude. Des échantillons de sérum ont été obtenus avant résections chirurgicales. Pour un groupe de contrôle, 139 âge appariés, des volontaires sains ont été recrutés parmi un groupe de personnes sans cancer qui a visité le même hôpital pour un examen physique régulier et qui se porte volontaire pour se joindre à la recherche au cours de la même période. Nous avons défini un individu en bonne santé comme quelqu'un qui a été considéré comme exempt de maladies (y compris sans antécédents de cancer) au bilan de santé. Les caractéristiques cliniques des sujets suivants ont été obtenus au moment de la collecte de sang total. Un résumé des données de ces sujets est fourni dans le tableau 1. La progression de tous les patients atteints de cancer gastrique a été classé selon l'Union internationale contre le cancer (UICC) Critères TNM de stadification du cancer gastrique, 13 patients (16,25%) étaient au stade I, 24 patients (30,00%) étaient au stade II, 30 patients (37,5%) avaient stade III, et 13 patients (16,25%) étaient au stade IV. L'âge moyen des patients était de 54.35 ± 6.69 dont 60 mâles et 20 femelles. Le sérum a été collecté en utilisant un protocole standard à partir de sang entier, traité par centrifugation à 10 000 g pendant 20 minutes et stocké à -80 ° C.

profilage N-glycanes à partir de protéines sériques

protéine sérique Les analyses des N-glycanes ont été effectuées comme décrit précédemment [11]. En bref, les N-glycanes présents sur les protéines dans 2 ul de sérum ont été libérées avec un peptide N-glycosidase F (PNGaseF) (New England Biolabs, Boston, MA), puis marquées avec 8-aminonaphtalène-1, 3, 6- trisulfonique (APTS) (Invitrogen, Carlsbad, CA) l'acide .Sialic a été enlevé avec Arthrobacter ureafaciens sialidase (Roche Bioscience, Palo Alto, CA), et les échantillons traités ont été analysés avec la technologie DSA-FACE en utilisant un ABI3500 génétique à base d'électrophorèse capillaire Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). Les 9 pics les plus intenses qui ont été détectés dans tous les échantillons (ensemble, ces pics ont représenté > 90% de sérum total de N-glycanes) ont été analysées en utilisant le logiciel GeneMapper (Applied Biosystems). Chaque structure de N-glycanes a été décrit numériquement en normalisant sa hauteur à la somme des hauteurs de tous les pics.

Des échantillons de tissus

Tous les tissus ont été utilisés conformément au Règlement de la Commission de révision institutionnelle la deuxième université médicale militaire. Des échantillons de tissus ont été obtenus from10 de 80 patients atteints de cancer gastrique. Des échantillons de tissu inclus 2 tranches, d'un tissu tumoral et d'un tissu non tumoral adjacent. des échantillons de tissus appariés (environ 0,5 x 0,5 x 0,5 cm ^{3, dupliqué pour chaque échantillon) sélectionnée ont été soit immédiatement congelé à -80 ° C pour l'ARN et de protéines d'extraction ou fixé dans 10% de formaline tamponnée pour un maximum de 24 heures, puis transformé en un bloc intégré de paraffine et stockés à température ambiante pour la coloration histochimique.}

profilage N-glycanes à partir de protéines de tissus et l'analyse structurale par digestion exoglycosidase

les protéines ont été extraites à partir d'environ 25 mg de spécimens de tissus congelés . Les échantillons de tissus ont été suspendus et pestled dans un tampon de lyse contenant des inhibiteurs de protéase cocktail (Roche Diagnostics, Meylan, France). les parties non lysées ont été éliminés par centrifugation (12 000 g pendant 10 minutes à 4 ° C) deux fois. La concentration des protéines solubilisées a été déterminée en utilisant le kit BCA (Pierce Biotechnology /Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL), et les échantillons de protéine ont été stockés à -80 ° C jusqu'à utilisation. Un total de 40 pg de protéines tissulaires ont été utilisées pour établir des profils de N-glycanes à l'aide de la méthode ordinaire de profilage N-glycanes la même que celle effectuée dans le sérum décrit ci-dessus. Pour identifier core-α-1, structures N-glycanes 6-fucosylées, un nombre approprié de APTS-étiquetés N-glycanes ont été digérés avec les deux Arthrobacter ureafaciens sialidase et bovine rénaux α-1, 6-fucosidase (prozyme, San Leandro, CA , ETATS-UNIS). la technologie DSA-FACE a été utilisé pour analyser les produits de la digestion et de logiciels GeneMapper a été utilisé pour analyser la hauteur des pics.

extraction de l'ARN et quantitative en temps réel
PCR

Les ARN totaux ont été extraits à l'état congelé les tissus et les cellules, en utilisant le kit d'extraction totale de l'ARN selon les instructions du fabricant (Axygen Biosciences, Hangzhou, Chine). La pureté et la concentration de l'ARN ont été déterminées par spectrophotomètre (Eppendorf, Hambourg, Allemagne), puis conservés à -80 ° C jusqu'à utilisation. L'ADNc a été synthétisé en utilisant le kit ReverTra As-α-RT-PCR (Toyobo Co., Osaka, Japon), selon les instructions du fabricant. Amorces ont été conçues en utilisant le programme Primer Express (Applied Biosystems, les séquences sont présentées dans le tableau S1). Quantitative PCR en temps réel a été réalisée en utilisant le SYBR® vert en temps réel kit PCR Master Mix (Toyobo Co., Osaka, Japon) et a été analysé sur Applied Biosystems 7300 système PCR en temps réel (ABI, Foster City, CA, USA) . Toutes les analyses ont été réalisées indépendamment en triple. cycle de PCR consistait en une dénaturation à 95 ° C pendant 5 minutes, suivi de 40 cycles à 95 ° C pendant 15 secondes et à 59 ° C ou 55 ° C pendant 15 secondes, et la détection pendant 45 secondes à 72 ° C. La quantité relative de FUT8 ou guanosine diphosphate (PIB) transporteur -fucose (PIB-Tr) transcrits dans chaque échantillon a été normalisé au gène de ménage β-actine et la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) en soustrayant le cycle. Les niveaux d'expression des gènes ont été déterminés en utilisant le procédé Delta-Delta Ct. valeurs d'expression de transcription absolus au-delà de 40 cycles ont été considérés en dessous des niveaux détectables. Faire fondre les courbes ont été vérifiées pour chaque réaction de garantir qu'un seul produit a été amplifié.

Western blot et lectine blot

Les protéines ont été extraites de tissus congelés avec la procédure décrite ci-dessus, et un total de 50 les protéines pg ont été séparés par électrophorèse dans 10% de gel de sodium dodécyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE). Les gels ont été colorés avec du bleu de Coomassie G250 ou les protéines dans le gel ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose () pour la détection de FUT8 ou le pourcentage de protéines de nucléocapside fucosylé. Pour les échantillons de sérum, un total de 85 cas de cancer de l'estomac (n = 80), l'ulcère gastrique (n = 25) et témoin sain (n = 30) ont été utilisées pour SDS-PAGE et lectine-blot. Les membranes ont été bloquées pendant une nuit à 4 ° C avec 5% de protéines de lait écrémé ou 5% de sérumalbumine bovine dans du Tris-solution saline tamponnée [140 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl (TBS)] et ensuite mis en incubation pendant 2 heures à température ambiante, avec 1:100 dilué l'anticorps anti-humain FUT8 (15C6, FUT8 anti-humaine, Fujirebio Corp., Japon) ou 5 ug /ml de lentille biotinylé culinaris agglutinine A (LCA) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) dans du TBS contenant 0,05% Tween-20 (tampon TBST), puis mis en incubation avec une dilution 1:10,000 des anticorps secondaires marqués par fluorescence (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) ou IRDye 800CW-streptavidine (LI-COR Biosciences) pendant 1 heure à la température ambiante, . Les membranes ont été développées avec le système d'imagerie infrarouge Odyssey. Anti-beta actine (1:2000) a été utilisée pour l'anticorps de référence interne pour western-blot. albumine purifiée a été utilisé comme témoin négatif pour lectine blot et de protéines totales colorées au bleu de coomassie a été utilisé pour calculer le pourcentage de protéine noyau fucosylé.

immunohistochimique (IHC) coloration et lectine-histochimique coloration

Les spécimens de tissus fixes incorporés dans de la paraffine ont été coupées en tranches de 4 mm de maladie pour une coloration immunohistochimique pour FUT8 et lectine-histochimique coloration pour LCA. Après avoir subi déparaffinage, réhydratation, le blocage de la peroxydase endogène, et la récupération de l'antigène (Tris 10 mM /EDTA 1 mM, pH 9,0, traité en autoclave), les échantillons ont été incubés avec un anticorps monoclonal de souris contre FUT8 humaine (1:100) ou LCA biotinylé (1 :500) pendant une nuit à 4 ° C, puis avec du raifort anticorps secondaire conjugué à la peroxydase ou la streptavidine marquée à la fluorescéine à 37 ° C pendant 30 min. Nuclei ont été contre l'hématoxyline ou DRAQ5. Contrôle négatif était composé de coupes histologiques identique traitées avec IgG de souris pour remplacer la souris FUT8.

Les lignées cellulaires et la culture de

Les lignées cellulaires de cancer gastrique humain, BGC-823 et SGC-7901, ont été achetés de l'Institut de Shanghai de biologie cellulaire, Académie chinoise des sciences et de culture à 37 ° C sous 5% de CO _{2 en milieu RPMI 1640 et du milieu DMEM (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), respectivement, avec 10% de FBS, 1% de glutamine et une solution à 1% d'antibiotiques.}

Construction du GDP-Tr et FUT8 plasmides recombinants et la transfection de cellules de cancer gastrique

pEGFP-N1-GDP-Tr et le pEGFP-N1 -Fut8, le vecteur plasmidique codant pour le PIB-Tr humain ou FUT8, a été généré par l'insertion GDP-Tr ou FUT8 ADNc dans un vecteur pEGFP-N1 (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA), contenant un promoteur de CMV et le promoteur précoce SV40, ainsi que le gène de résistance à la néomycine /kanamycine de Tn5. Le squelette du vecteur contient également une origine de replication de SV40 dans des cellules de mammifères. Le site de clonage multiple (MCS) est à côté du promoteur précoce immédiat du CMV. Le gène GDP-Tr ou FUT8 humain a été clone à partir de l'ARNm extrait avec le réactif Trizol (Invitrogen, Carlsbad, Etats-Unis) à partir de tissu hépatique humain en effectuant une RT-PCR en utilisant les amorces (tableau S2) dans lequel les sites de restriction Xho I et Kpn I ont été inclus, digestion avec Xho I ou Kpn I et ligaturer dans le pEGFP-N1. Le pEGFP-N1-GDP-Tr ou pEGFP-N1-FUT8 a été transfecté dans E. coli DH5a pour l'amplification et le séquençage d'ADN a été utilisé pour assurer la fidélité. On a préparé l'ADN plasmidique en utilisant le kit Qiagen DNA Mini (Qiagen, Hilden, Allemagne) selon les instructions du fabricant. Les plasmides ont été transfectés dans les lignées humaines gastriques de cellules cancéreuses, BGC-823 et SGC-7901 à 80% de confluence et 5 × 10 ^{5 cellules par puits dans une plaque à six puits en utilisant la Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, États-Unis ) selon les instructions du fabricant. Les cellules transfectées qui expriment le gène cible ont été confirmés par RT-PCR quantitative.}

Essai de prolifération cellulaire

dosages de prolifération cellulaire ont été réalisées avec le kit de comptage de cellules-8 (CCK-8, Dojin, Japon) selon les instructions du fabricant. La croissance cellulaire a été surveillée toutes les 24 heures pendant 5 jours, et pour chaque point de temps a été effectuée en double. L'absorbance a été mesurée pour chaque puits à une longueur d'onde de 450 nm.

Cicatrisation test

Pour le test de cicatrisation, les lignées cellulaires de cancer gastrique humain, BGC-823 et SGC-7901 ( 1 × 10 ^{5 cellules /35 × 11 des plats mm) ont été ensemencées et incubées pendant 24 heures à 37 ° C, puis transfectées avec des plasmides recombinants. Après avoir atteint la confluence, la couche cellulaire dans chaque plaque a été rayée à l'aide d'une pointe de pipette en plastique. La migration des cellules au bord de la rayure a été analysée à 0, 24 et 48 heures, les images ont été capturées et analysées par Leica microscope à fluorescence et appariés logiciel d'analyse d'image (Comet Assay IV système d'analyse d'image, PI, Royaume-Uni).}

routine Tumor Maker Détection

les données cliniques et biochimiques des patients sont résumées dans le tableau 1. les tests biochimiques de routine ont été mesurées en utilisant des méthodes standard et des réactifs appariés (Hitachi 7600 Analyzer (Hitachi, Tokyo, Japon) . les niveaux de marqueurs de tumeur, y compris glucides antigène 19-9 (CA19-9), l'antigène carcino-embryonnaire (CEA), cytokératine 19 (CK19), CA125 et CA724, ont été déterminés sur un modulaire Roche E170 avec des réactifs appariés.

Analyse statistique

Toutes les variables quantitatives ont été exprimées en moyenne ± écart-types, sauf indication contraire. Les variables quantitatives ont été comparées à des tests t de Student, analyse de la variance (ANOVA), ou des tests non paramétriques. coefficients Pearson de corrélation (Spearman coefficients de corrélation ont été calculés pour les variables ordinales) et leurs probabilités associées ( p
) ont été utilisés pour évaluer les corrélations entre les paramètres. Tous les p
valeurs rapportées étaient 2 à queue, et p
valeurs < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. Les analyses statistiques ont été réalisées avec SPSS 16.0 pour le logiciel statistique de Windows (SPSS Inc.).

Résultats

Différents modèles de profilage N-Glycan sériques dans le cancer gastrique, ulcère gastrique et des contrôles sains

Utilisation de DSA-FACE, nous avons examiné les profils N-glycanes dans les sérums désialylée de patients atteints de cancer gastrique (n = 80), l'ulcère gastrique (n = 25), et l'âge apparié individus en bonne santé (n = 139). Nous avons quantifié et statistiquement comparé ces pics entre 3 groupes différents. Au moins 9 structures N-glycanes (pics) ont été identifiés dans tous les échantillons (figure 1A). L'analyse structurale de ces N-glycanes a été publié auparavant par Callewaert [11]. L'abondance relative moyenne de ces structures N-glycanes a été décrite dans le tableau 2. L'abondance des structures des pics 2, 3, 5, 6, 7, 8 et 9 ont révélé des différences statistiquement significatives entre cancer gastrique, ulcère gastrique, et contrôle sain groupes, indiquant que les différents modèles de N-glycanes sont apparus dans différentes conditions physiopathologiques. Par rapport au groupe témoin sain, peak5 (bigalacto glycane biantennées, NA2) et peak9 (ramification α-1,3-fucosylé glycane triantennés, NA3Fb) étaient élevées (P < 0,001) (figure 1B); tandis que les pics fucosylées, core-tels que (agalacto pointe 2 core-α-1,6-fucosylé bissectrice glycane biantennées, NGA2FB), peak3 (single agalacto glycane biantennées core-α-1,6-fucosylé, NG1A2F), PEAK6 (bigalacto noyau glycane -α-1,6-fucosylées biantennées, NA2F) et peak7 (bigalacto core-α-1,6-fucosylées bissectrice glycane biantennées, NA2FB) ont diminué dans le groupe de cancer gastrique (P < 0,001). De même, l'abondance des glycanes structure de noyau fucosylé désignés sumfuc (ce qui indique des structures de noyau fucosylé totaux, y compris le pic 1, 2, 3, 4, 6 et 7) a été diminué de manière significative dans le cancer gastrique (P < 0,001) (figure 1C ). Le groupe de cancer de l'estomac a également été classé en 4 sous-groupes selon la classification TNM de l'UICC pour le cancer gastrique. L'abondance de la structure et sumfuc n'a pas changé de façon significative entre les 4 sous-groupes différents; cependant, sumfuc a diminué progressivement avec des étapes de progression du cancer gastrique (tableau 3).

Corrélation entre N-glycanes et des marqueurs tumoraux de routine

À ce jour, le CEA est toujours largement utilisé pour le dépistage et la surveillance du cancer gastrique. Nous avons analysé les corrélations entre individu marqueur N-glycane avec CA19-9, CEA, CK19, CA125 et CA724. L'analyse de corrélation de Pearson a indiqué que le CEA était associé positivement avec pointe 1 (r = 0,19; p < 0,01) et peak9 (r = 0,28; p < 0,01), alors négativement avec PEAK6 (r = -0,18; P < 0,01) et peak8 (r = -0,23; P < 0,01). (tableau 4)

Comparaison des sumfuc entre le cancer gastrique et autres cancers du système digestif

Auparavant, nous avons étudié le profilage N-glycanes du carcinome hépatocellulaire (HCC) [19] et le cancer colorectal (CRC) [20]. L'abondance des sumfuc a révélé des différences statistiquement significatives entre les cancers gastriques (41,32 ± 6,39), HCC (50,99 ± 8,39), CRC (45,33 ± 5,96) et de contrôle en bonne santé (47,67 ± 5,08) des groupes (P < 0,001, tableau 5), ce qui indique ce niveau de base-fucosylation différent est apparu dans les cancers d'origines de tissus différents. Parmi les 4 groupes, le niveau de base-fucosylation dans le CHC est le plus élevé, alors que le niveau de fucosylation dans le cancer gastrique était le plus bas, et a même été inférieur à celui de contrôle sain.

modèles de profilage N-glycanes dans les tissus tumoraux gastriques et non tumorales
profils

N-glycane ont été examinés en protéine désialylée à partir de tissus tumoraux gastriques et non tumorales. Les trois plus abondante bigalacto glycanes biantennaires montré dans le sérum, peak5 (NA2), PEAK6 (NA2F) et preak7 (NA2FB) ont été identifiées également dans les protéines de tissus (figure 2A). PEAK6 et Peak7 ont été confirmés comme des structures de base-fucosylé dervied de peak5 après traités par core-α-1, 6-fucosidase digestion (figure 2A). Les hauteurs de ces trois pics ont été analysées en utilisant le logiciel GeneMapper. Le rapport de PEAK6 à peak5 était plus faible dans les tissus tumoraux que dans les tissus adjacents non tumorales (0,83 ± 0,18 vs 1,05 ± 0,42, la figure 2B), ainsi que le rapport de peak7 à peak5 (0,13 ± 0,06 vs 0,16 ± 0,04, figure 2C). Cependant, il n'y avait pas de différence statistiquement significative (P > 0,05). Entre les tissus tumoraux et non tumoraux

Diminution des niveaux de fucosylation de base total identifiés dans les deux sérums et les tissus du cancer gastrique

Depuis LCA peut spécifiquement reconnaître les glycoprotéines avec des α-1,6-fucosylé lié à la N-acétyl-D-glucosamine-asparagine (GlcNAc-Asp) dans le noyau trimannosyle, nous avons étudié les protéines totales du noyau fucosylées sérums et les tissus dans le cancer gastrique en utilisant l'ACV pour valider la constatation dans DSA-FACE. Dans le sérum, le niveau des résidus de fucose base de LCA de liaison était plus faible dans le cancer de l'estomac que dans l'ulcère gastrique et des témoins sains (figure 3A). L'abondance totale noyau de fucose également eu tendance à être plus faible dans les tumeurs gastriques par rapport à celle dans les tissus adjacents par paires (figure 3B). Pour déterminer si la modification de la fucosylation de base total dans le tissu de tumeur gastrique se rapporte à une altération de la voie de biosynthèse de la glycosylation, la RT-PCR quantitative a été utilisée pour analyser l'abondance des mammifères FUT8 et GDP-Tr dans les tumeurs gastriques et des tissus adjacents. Les résultats ont montré qu'aucune différence significative de l'expression et FUT8 GDP-Tr ARNm ont été observées entre les tumeurs et les tissus adjacents (figure 3C et 3D). L'abondance relative des protéines FUT8 a été illustrée à l'aide western blot (données brutes a été montré à la figure S1). Le FUT8 dans les tissus adjacents était significativement plus élevé que dans les tissus tumoraux (P < 0,05) (figure 3E). L'immunohistochimie a révélé que la FUT8 a été fortement exprimé positivement aux frontières luminale des cellules non tumorales gastriques (figure 4B), mais il faiblement exprimé positivement dans les cellules tumorales (figure 4A). L'expression de glycoprotéines de noyau fucosylé LCA de liaison était plus élevée dans les cellules non tumorales gastriques que celle dans les cellules tumorales (figure 4C, 4D). Ainsi, le niveau de fucosylation de base total a été identifié diminué dans les deux sérums et les tissus du cancer de l'estomac.

Effet de FUT8 et GDP-Tr sur la prolifération et la migration dans des lignées cellulaires de cancer gastriques humaines

Le des lignées cellulaires de cancer gastrique humain, BGC-823 et CGS-7901 ont été utilisées dans une étude in vitro. Depuis BGC-823 exprimé niveau inférieur du PIB-Tr tandis SGC-7901 exprimé niveau inférieur de FUT8 dans notre recherche pilote, pEGFP-N1-PIB-Tr a été transfecté dans BGC-823 pour surexprimant PIB-Tr et pEGFP-N1- FUT8 était transfecté dans SGC-7901 pour surexprimant FUT8. expressions recombinants ont été obtenus avec succès présentés par l'expression du gène rapporteur de la GFP (Figure S2). Pour examiner l'implication possible du PIB-Tr et FUT8 dans la prolifération de la tumeur et la migration, BGC-823 et les cellules SGC-7901 ont été étudiés après la transfection en utilisant CCK-8 et de cicatrisation des plaies test de migration respectivement. Les résultats ont montré que la régulation positive du PIB-Tr diminué BGC-823 prolifération à 2-5 jours après la transfection et la régulation positive de FUT8 diminution de la prolifération SGC-7901 à 2 jours après transfection (figure 5A et 5B). Ces résultats indiquent que l'expression élevée du PIB-Tr et FUT8 pourrait supprimer la prolifération de cellules cancéreuses gastriques humaines. Cicatrisation dosage démontré que le PIB-Tr et FUT8 ont pas d'influence significative sur les migrations en BGC-823 et SGC-7901 à 48 h après le traitement (Figure 5C et 5D).

Discussion

glycosylation est l'une des modifications post-traductionnelles les plus courants apparus dans environ 70% de toutes les protéines connues. Des altérations de la glycosylation jouent un rôle dans un ensemble diversifié de phénomènes biologiques tels que la tumeur métastatique de la cellule, la communication intracellulaire et l'inflammation [21] - [23]. De plus en plus d'études indiquent que les altérations de la glycosylation et les niveaux d'activité des glycosyltransférases dérivées de la transformation maligne correspondant aux affections malignes humaines [24] - [25]. DSA-FACE est une technologie simple et efficace pour mesurer les changements de N-glycanes dans le sérum. Nous avons déjà utilisé cette technologie pour faciliter le diagnostic du carcinome hépatocellulaire et le CRC [19] - [20]. Dans l'étude actuelle, nous l'avons utilisé pour analyser caractéristique modèle de profilage lié à N dans le cancer gastrique. Les résultats ont indiqué qu'il y avait significativement différents modèles de profilage N-glycanes entre le cancer gastrique, ulcère gastrique et des témoins sains. Parmi ces différents modèles de profilage, peak9 et sumfuc ont été trouvés pour être changé dans une tendance inverse dans le cancer gastrique par rapport à celles des témoins. Comme le montre la recherche précédente, peak9 a été associée au développement de variétés de tumeurs malignes, nous avons confirmé à nouveau que la structure triantennés N-glycane abondance a augmenté de manière significative dans le cancer gastrique et ce changement avait été révélée être en corrélation avec le CEA, qui est un plus communément utilisé marqueur CRC et est une glycoprotéine très hétérogène qui contient 60% de glucides [26]. En particulier N-glycane analyse la structure de l'abondance, nous avons observé que sumfuc a diminué de manière significative dans le cancer gastrique par rapport aux témoins. Pour valider davantage cette constatation, nous avons effectué lectine blot dans les deux sérums et les tissus. À l'aide de sérum HCC comme témoin positif, nous avons observé une baisse fucosylation de N-glycanes sur des protéines totales dans le sérum d'un cancer gastrique. Une tendance similaire a été révélé dans les tissus tumoraux gastriques. Ces résultats sont conformes à nos précédents rapports sur CRC [20]. Cependant, les résultats sont contraires aux précédents rapports sur les cancers avec d'autres origines tissulaires. Les augmentations des oligosaccharides fucosylées dans des conditions pathologiques ont été rapportées par d'autres et notre groupe [19]. L'AFP fucosylé (AFP-L3) a été utilisé comme marqueur HCC dans la pratique clinique [25]. Les contradictoires des niveaux de base-fucosylation sont apparus dans différents cancers pourrait être due aux différents rôles joués par les différents tissus, par exemple foie est le principal organe responsable de la production des glycoprotéines en plus des lymphocytes B produisant l'immunoglobuline [27] - [28].

fucosylation est catalysée par fucosyltransférases, guanosine-5'-diphosphate (PIB) des enzymes synthétiques -fucose, et GDP-fucose transporteur (s). GDP-fucose est un substrat donneur commun à tous les fucosyltransférases. Après GDP-fucose a été synthétisée dans le cytosol, elle est transportée vers l'appareil de Golgi par GDP-Tr pour servir de substrat pour fucosyltransférases [17], [29]. Par conséquent, le PIB-Tr est un facteur clé pour la voie GDP-fucose synthétisé. FUT8 est le seul fucosyltransférase impliqué dans le noyau-fucosylation [29]. Nous avons détecté une diminution FUT8 expression de la protéine dans le tissu tumoral, qui a soutenu nos résultats dans les sérums. Cependant, l'expression de l'ARNm FUT8 n'a observé aucune différence significative dans les tumeurs gastriques et des tissus adjacents. La glycosylation est très réfléchissante des changements dans l'environnement d'une cellule. Les modifications épigénétiques du génome sont stablement transmises aux cellules filles, sans l'exigence d'altérations de séquences génétiques. [30] Afin de clarifier si le fucosylation noyau diminué joue un rôle important dans la carcinogenèse du cancer gastrique, nous avons étendu l'étude dans des lignées cellulaires gastriques in vitro. Nous avons constaté que l'expression régulée à la hausse du PIB-Tr et FUT8 dans les cellules cancéreuses gastriques humaines pourrait conduire à une faible prolifération. Mais nous avons échoué à trouver un impact de core-fucosylation sur la migration cellulaire. Ces résultats aident à expliquer le mécanisme potentiel pourquoi diminué core-fucosylation est apparu dans le cancer gastrique et ce noyau-fucosylation down-régulée en corrélation avec un comportement biologique maligne des cellules de cancer gastrique.

Dans les dernières années, il y a plusieurs les résultats révélant que les altérations de la glycosylation jouent un rôle important dans la progression des maladies du foie en plus du cancer et des maladies auto-immunes. Les modifications importantes dans la glycosylation des glycoprotéines sécrétées inclus une réduction de la base fucosylation, ramification accrue et une augmentation de la sialylation, et les modifications à la machinerie épigénétique avoir un effet profond sur les structures glycanniques générées par les cellules lors de la progression du cancer de l'ovaire [30]. Les niveaux de glycanes biantennées core-fucosylé et acides sialiques α-2,3-liés ont été significativement augmentés dans le cancer de la prostate. [31] Il y avait une augmentation de 40% dans le noyau fucosylation dans les principales glycanes biantennées sialylées dans le sérum du cancer du pancréas, ce qui serait le signe d'un sous-ensemble de glycoformes associés à des tumeurs [32].

récemment, la fonction du coeur-fucosylation a été rapportée pour être associée à la fonction de l'EGFR [33]. La liaison de l'EGF à son récepteur nécessite noyau fucosylation de N-glycanes de l'EGFR.

• PLOS Genetics: mutations germinales dans MAP3K6 sont associés à Cancer
• PLOS ONE: Découverte de marqueurs tumoraux pour le cancer gastrique par Proteomics