PLoS ONE: Mycoplasma hyorhinis Aktiviert die NLRP3 Inflammasoms und fördert die Migration und Invasion von Magenkrebs Cells

Abstrakt

Hintergrund

Mycoplasma hyorhinis
( M.hyorhinis wird M.hy
) mit der Entwicklung von Magen- und Prostatakrebs in Verbindung gebracht. Die NLRP3 Inflammasoms, ein Proteinkomplex Kontrolle Reifung von wichtigen proinflammatorischen Zytokine Interleukin (IL) -1β und IL-18, auch bei der Tumorentstehung und Metastasierung von verschiedenen Krebsarten beteiligt ist.

Methodik /wesentlichen Ergebnisse

Um zu klären, ob M.hy
Tumorentwicklung über Inflammasoms Aktivierung gefördert, wir Monozyten für IL-1β und IL-18 Produktion auf M.hy
Herausforderung analysiert. Wenn ausgesetzt M.hy
zeigte menschliche Monozyten schnelle und robuste IL-1β und IL-18-Sekretion. Wir identifizierten ferner, dass Lipid-assoziierte Membranprotein (LAMP) von M.hy
für IL-1β Induktion verantwortlich war. Die Anwendung kompetitive Inhibitoren, Gen-spezifischen shRNA und Gen gezielt Mäuse, überprüften wir, dass M.hy
induzierte IL-1β Sekretion war NLRP3 abhängige In-vitro-
und in vivo
. Cathepsin B-Aktivität, K ^{+ Ausstrom, Ca 2+ Einstrom und ROS-Produktion waren alle für die Aktivierung NLRP3 Inflammasoms erforderlich von M.hy
. Wichtig ist, dass es ist IL-1β, aber nicht IL-18 von Makrophagen in Frage gestellt mit M.hy
Magenkrebs Zellmigration und Invasion gefördert.}

Schlussfolgerungen

Unsere Daten deuten darauf hin, dass die Aktivierung des NLRP3 Inflammasoms von M.hy
kann mit seiner Förderung von Magenkrebs Metastasen in Verbindung gebracht werden, und anti- M.hy
Therapie oder Begrenzung NLRP3 Signalisierung könnte wirksamer Ansatz sein für die Kontrolle von Magenkrebs Fortschritt

Citation:. Xu Y, Li H, Chen W, Yao X, Xing Y, Wang X, et al. (2013) Mycoplasma hyorhinis
Aktiviert die NLRP3 Inflammasoms und fördert die Migration und Invasion von Magenkrebszellen. PLoS ONE 8 (11): e77955. doi: 10.1371 /journal.pone.0077955

Editor: Suresh Yenugu, University of Hyderabad, Indien

Empfangen: 5. Juni 2013; Akzeptiert: 6. September 2013 beginnen; Veröffentlicht: 6. November 2013

Copyright: © 2013 Xu et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit durch Zuschüsse aus 100 Talent Program der chinesischen Akademie der Wissenschaften, Natural Science Foundation of China unterstützt wurde (91029707, 31170868), Shanghai Natural Science Foundation (11ZR1442600), Novo Nordisk-CAS Research Foundation, SA-SIBS-Stipendienprogramm sowie Zuschüsse aus dem National Key Programme auf Infectious Disease (2012ZX10002007-003). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Mykoplasmen sind pleomorphe, Wand frei, prokaryotischen Organismen, die entweder auf den eukaryotischen Zellmembranen oder in den Zellen befinden, und sie sind die kleinsten Organismen, die zur Selbstreplikation [1]. Bisher wurden mindestens 16 Mycoplasmenarten wurden von Menschen isoliert [2]. Mycoplasma hyorhinis
( M.hy
) wurde für den Menschen nicht pathogen angesehen, da sie swine was zu Atemwegserkrankungen und Entzündungen der Brust und Gelenke befällt gewöhnlich [3], [4] . Allerdings schlägt Beweise dafür häufen sich, dass M.hy
Infektion beim Menschen in klinischen Ergebnissen führt. M.hy
in 56% der Magenkarzinom gefunden wurde, 55% der Kolonkarzinom und 52,6% der Lungenkarzinombiopsien [5]. Darüber hinaus 36% Männer mit benigner Prostatahyperplasie (BPH) und 52% Männer mit Prostatakrebs sind M.hy
seropositiven. Diese klinischen Befunde legen nahe, eine mögliche Verbindung zwischen M.hy
Exposition mit Magen-, Darm-, Lungen- und Prostatakrebs [5], [6].

Bei der mikrobiellen Infektion, Wirts pattern recognition receptors ( PRRS) wie TLRs spüren die Erreger und lösen die Synthese von proinflammatorischen Zytokinen wie pro-IL-1β und pro-IL-18 über NF-kappaB-Aktivierung. Zur gleichen Zeit, eine andere Gruppe von PRRs einschließlich NLRP3 ASC Adapterprotein rekrutieren und zur Aktivierung von Caspase-1 führen, die eine aktive Protease spaltet die Vorläuferform von Zytokinen einschließlich pro-IL-1β und pro-IL-18 in reife, sekretierte Form [7]. Pathogens oder anspruchsvolle Mittel verursachen Kalium Ausströmen, Mitochondrien Schaden, Mitochondrien-DNA-Freisetzung, ROS-Produktion, intrazellulären Calcium-Erhöhung oder zelluläre zyklisches AMP Abnahme der angeborenen Immunzellen, die alle in Caspase-1-Aktivierung beteiligt sind [8], [9], [10 ], [11], [12], [13]. Während dieses Prozesses die NLRP3, ASC und pro-Caspase-1 bilden eine molekulare Plattform namens Inflammasoms. Bisher wurde eine Reihe von Inflammasome identifiziert wurden, von ihnen, der NLRP3 Inflammasoms gefunden wurde, mit der Tumorentwicklung assoziiert [14], [15], obwohl Kontroverse von verschiedenen Modellen besteht [16], [17]. Nichtsdestoweniger wurde IL-1β berichtet Tumorzellwachstum und die Metastasierung durch mehrere pro-metastatic Gene induzieren wie Matrix-Metalloproteinasen und endotheliale Adhäsionsmoleküle sowie TGF-β, Chemokine und Wachstumsfaktoren [18] zu fördern. In einer koreanischen Bevölkerung, die Kombination aus erhöhter Schleimhaut IL-1β Ebene und Homozygotie für IL-1β -31T single nucleotide polymorphism (SNP) sind beide mit einem erhöhten Risiko für Magenkrebs [18]. Weiterhin Tu et al. festgestellt, dass Magen-spezifische Expression von humanem IL-1β in transgenen Mäusen zu spontaner Magen Entzündungen und Krebs [19] vorgeschlagen, weiter geführt, dass IL-1β menschlichen Magenkrebsentstehung fördern kann. Im Gegensatz dazu erhöht die IL-18-NK-Zellaktivität reduziert Tumorigenese, induziert Apoptose und hemmt in Tumorzellen, Angiogenese anti-Tumor-Wirkung ausüben [20], [21]. Darüber hinaus wurde ein ungeeignetes Produktion von IL-18 gefunden zu der Pathogenese von Krebs beitragen und die klinischen Ergebnisse von Patienten beeinflussen können [22]. IL-18 wurde berichtet, Matrix Metalloproteinase-9-Produktion stimulieren, was zu einer erhöhten Migration und Invasion in Koronararterie glatten Muskelzellen und HL-60-myeloischer Leukämie-Zellen [23], [24]. Es wurde auch berichtet, dass die Serum-IL-18-Ebene bei Magenkrebs-Patientengruppe, die signifikant höher war als bei Magengeschwür Patientengruppe [25] und IL-18 kann über die Herunterregulierung von CD70 Metastasierung und Immun-Escape von Magenkrebs erhöhen und Wartung von CD44 in menschlichen Magenkrebszelllinie NCI-N87 und SNU16 [26]. Es ist auch ein wichtiger Mediator von VEGF-verstärkte Migration in menschlichen Magenkrebszelllinien SNU-601 [27]. Die obigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass Mycoplasma hyorhinis
kann durch die Aktivierung Inflammasoms Migration und Invasion von Magenkrebszellen fördern.

Bis heute ein breites Spektrum an Mikroorganismen wie Viren, Bakterien, Pilze und Protozoen gewesen identifiziert die NLRP3 Inflammasoms [28] zu aktivieren. Eine aktuelle Studie hat gezeigt, dass Mycoplasma pneumoniae
konnte auch IL-1β-Produktion in menschlichen Zellen [29] zu induzieren. Ob jedoch M.hy
, die ein wichtiger Faktor bei der Entwicklung von Magenkrebs ist, wie oben erwähnt [5], [30], [31], aktiviert die NLRP3 Inflammasoms und ob diese Aktivierung trägt zur Magenkrebs Entwicklung bleiben unbekannt. In dieser Studie haben wir festgestellt, dass M.hy
IL-1β-Sekretion in einem NLRP3 Inflammasoms abhängig ausgelöst, und die resultierende IL-1β induzierte Migration und Invasion von Magenkrebszellen.

Ergebnisse |

M.hy
Trigger IL-1β und IL-18 Produktion in THP-1-Zellen

zu bestimmen, ob M.hy
induziert IL -1β Produktion von angeborenen Immunzellen, überwacht wir reifen IL-1β Ebenen in humanen monozytären Zelllinie THP-1-Zellen mit unterschiedlichen Mengen von in Frage gestellt M.hy
. In diesem Experiment wurde eine starke Induktion von IL-1β in einer dosisabhängigen Weise beobachtet (1A). Als nächstes maßen wir die pro-IL-1β-mRNA-Spiegel in den Zellen und reifen IL-1β zu verschiedenen Zeitpunkten in den Kulturüberständen Proteinspiegel nach M.hy
Herausforderung. Es wurde beobachtet, dass IL-1β-mRNA-Spiegel bei 3 Stunden nach der Herausforderung (Abbildung 1B) und reifen IL-1β (1C) und IL-18 (Abbildung 1D) Proteinspiegel erreichte 12 Stunden nach Herausforderung gipfelte. Außerdem THP-1 abgeleiteten Makrophagen auch robust Sekretion von IL-1β, IL-18 sowie andere inflammatorische Zytokine wie IL-6 und IL-8 (Figur 1E, Figur S1) gezeigt. Um die obigen Feststellungen in THP-1-Zelllinie bestätigen wir die IL-1β-Produktion in primären humanen Monozyten von gesunden Spendern untersucht in Frage gestellt mit M.hy
, wobei IL-1β wurde ebenfalls stark induziert (Abbildung 1F) . Diese Daten zeigten, dass M.hy
ausgelöst robust IL-1β und IL-18-Sekretion aus humanen myeloischen Zellen.

LAMP abgeleitet von M.hy
für IL Verantwortlich ist -1β Induktion durch TLR2

Als nächstes untersuchten wir, ob die Replikation von M.hy
für IL-1β-Produktion in Monozyten erforderlich war. Wie in 2A gezeigt, M
.hy
durch Erhitzen oder ultraviolette (UV) -Behandlung, wie viel IL-1β-Sekretion aus THP-1-Zellen als lebende M induziert inaktivierte .hy
. Dies wies darauf hin, dass bestimmte hitze- und UV-beständig Komponente von M.hy
für die Induktion von IL-1β Sekretion verantwortlich war. Lipid-assoziierte Membranprotein (LAMP) ist reichlich auf der Oberfläche von ausgedrückt M.hy
[32] und frühere Studie ergab, dass Membran-Lipoproteine ​​aus anderen Mycoplasmenarten IL-1β-Sekretion induziert [33]. Wir vermuteten daher, dass M.hy
abgeleitet LAMP (MLAMP) in THP-1-Zellen für die IL-1β Induktion verantwortlich sein kann. Wir extrahierten LAMP dann von M.hy
(2B) und die Fähigkeit der getesteten MLAMP IL-1β-Sekretion in THP-1-Zellen zu induzieren. Wir fanden, dass MLAMP eindeutig Sekretion induziert von IL-1β in einer dosisabhängigen Weise, während die wässrige Phase von M.hy
Extrakt nicht in der Lage war, dies zu tun (Abbildung 2C). Um die mögliche RNA und /oder DNA-Kontamination in MLAMP auszuschließen, behandelt man die MLAPMs mit RNase und DNase und gefunden, dass MLAMP die Hauptkomponente für IL-1β Induktions (Abbildung S2) war.

Es wurde berichtet, dass MLAMP hauptsächlich aktivierte NF &kgr; B durch TLR2 und TLR6 [34], [35]. Deshalb wandten wir zuerst eine T2.5 TLR2 neutralisierende Antikörper die TLR2 Signal zu blockieren, mit cont2 dient als Isotyp-Kontrolle [36]. Wie in 2D gezeigt, blockiert T2.5 vollständig die IL-1β-Sekretion durch TLR2-Agonist P3CSK4 stimuliert, aber nicht durch den TLR4-Liganden LPS. Wichtig ist, dass IL-1β Sekretion von M.hy
infizierten Zellen stark von T2.5 reduziert wurde, was darauf hinweist, dass TLR2 in MLAMP beteiligt war ausgelöst IL-1β-Sekretion in menschlichen Monozyten. Interessanterweise IL-1β Sekretion von M.hy
infizierten Zellen wurde nicht vollständig von T2.5 (2D) blockiert, die vorgeschlagen, dass TLR2-unabhängigen Signalweg auch in MLAMP beteiligt war ausgelöst IL-1β-Sekretion, die verdient eine weitere Untersuchung in der Zukunft.

M.hy
induziert IL-1β Sekretion durch Aktivierung des NLRP3 Inflammasoms

Um zu testen, ob M.hy
induzierte IL-1β-Sekretion durch Inflammasoms Aktivierung, wir grundiert ersten verwendeten LPS THP-1 abgeleiteten Makrophagen, wenn zu überprüfen M.hy
Inflammasoms wie ATP oder MSU aktivieren kann, die Inflammasoms Aktivatoren bekannt sind. Wie in 3A gezeigt, M
.hy
der Lage war, IL-1β Freisetzung in den grundierten Zellen zu induzieren. Als nächstes untersuchten wir die Spaltung von Caspase-1 und Oligomerisierung von ASC, zwei wichtige Entscheidungsträger für die Inflammasoms Aktivierung. Wir fanden, dass M.hy
die Spaltung von Caspase-1 gefördert und Oligomerisierung von ASC (3B), eine direkte Aktivierung von Inflammasoms Angabe von M.hy.

Darüber hinaus haben wir getestet, ob M.hy IL-1β Sekretion bestimmter Inflammasoms Komponenten abhängig war induziert
. Erstens fanden wir, dass die spezifische Caspase-1-Inhibitor YVAD-AC-CHO verringerte IL-1β-Sekretion in THP-1-Zellen in einer dosisabhängigen Weise (3C). Als nächstes, wenn spezifische shRNA die Expression von Caspase-1 und ASC (3D), IL-1β Produktion stark von verringert wurde zum Schweigen verwendet wurde, M.hy
Herausforderung (Abbildung 3E), was darauf hinweist, dass M.hy
induzierte IL-1β Sekretion auf Caspase-1 und ASC abhängig war.

Dann haben wir getestet, ob NLRP3 für M.hy erforderlich war
IL-1β-Sekretion induziert. Erstens fanden wir, dass der Inhibitor NLRP3 Glybenclamide unterdrückt M.hy
induzierte IL-1β-Sekretion in dosisabhängiger Weise (Figur 3F) [37]. Als spezifische shRNA verwendet wurde, um die Expression von NLRP3 (Abbildung 3G), IL-1β Produktion stark von verringert wurde zum Schweigen zu bringen M.hy
Herausforderung (3H), was darauf hinweist, dass M.hy
induzierte IL-1β-Sekretion auf NLRP3 abhängig. Dies wurde durch Immunoblotting bestätigt, in denen die Caspase-1-Aktivierung und IL-1β Produktion sowohl NLRP3 abhängig (Figur 3I) waren. Darüber hinaus fanden wir weiterhin, dass MLAMP die Hauptkomponente durch verantwortlich für NLRP3 Inflammasoms Aktivierung war M.hy
(Abbildung S2C). Zusätzlich wurde berichtet AIM2 Inflammasoms durch DNA aktiviert werden [38], und wir fanden, dass M.hy
DNA induzierte IL-1β Sekretion über AIM2 Inflammasoms (Abbildung S3A). Interessanterweise M.hy
induzierte IL-1β-Sekretion war in erster Linie abhängig von NLRP3, während AIM2 nur zum Teil beteiligt (Abbildung S3A) war. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse klar gezeigt, dass M.hy
IL-1β-Sekretion durch die Aktivierung des NLRP3 Inflammasoms in humanen monozytären Zellen induziert.

Mechanismen Basiswert M.hy
ausgelöst NLRP3 Inflammasoms Aktivierung

Aktivierung von NLRP3 Inflammasoms durch eine Vielzahl von Stimuli, hängt von Cathepsin B-Aktivität, K ^{+ Efflux, Calcium-Einstrom und /oder Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) [11], [ ,,,0],12], [13], [39]. Um zu untersuchen, die Mechanismen, die IL-1β Freisetzung in Reaktion auf M.hy
Herausforderung, wir zuerst angewendet Cathepsin B-spezifischer Inhibitor CA-074 Me und beobachteten eine signifikante Abschwächung des IL-1β Sekretion auf M .hy
Herausforderung. Bei einer Konzentration von 100 &mgr; M, CA-074 Me vollständig blockiert IL-1β Freisetzung (4A). Diese Hemmung war nicht aufgrund einer toxischen Wirkung auf die Zellen, wie IL-8-Sekretion durch dieses Inhibitors betroffen war sehr mild (Figur 4E). Wichtig ist, dass, wenn die Zellen mit Cathepsin K behandelt wurden Inhibitor I, die Abnahme von IL-1β-Sekretion bei allen (4B und 4F) nicht klar war, was darauf hindeutet, dass die Cathepsin B-Aktivität speziell in NLRP3 Inflammasoms Aktivierung während der M beteiligt war .hy
Herausforderung. Zusätzlich wird, wenn wir K + Efflux blockiert durch die extrazelluläre K Erhöhung + Konzentration, IL-1β-Sekretion durch THP-1-Zellen auf wurde M.hy
Herausforderung signifikant in dosis reduziert abhängig (4C). Wieder gab es keine toxische Wirkung von KCL als IL-8-Produktion aus den gleichen Zellen normal (4G). Um herauszufinden, ob Calcium-Einstrom Inflammasoms Aktivierung geholfen, fügten wir verschiedene Dosen von EGTA in dem Zellkulturmedium und festgestellt, dass EGTA Behandlung blockiert M.hy
-induzierte IL-1β-Sekretion in einer dosisabhängigen Art und Weise, und keine toxische Wirkung von EGTA wurde von IL-8-Produktion (4D und 4H) als belegt beobachtet.}

Darüber hinaus haben wir getestet, ob M.hy
Herausforderung induzierte ROS-Erzeugung in THP-1-Zellen . Für diesen Assay THP-1-Zellen wurden zunächst mit dem Redox-sensitive Fluorophor DCFDA und dann herausgefordert mit M.hy
, ATP geladen wurde als positive Kontrolle eingeschlossen. Wie in 5A gezeigt ist, 16,9% CM-H2DCFDA positive Zellen wurden nach 30 Minuten nachgewiesen M.hy
Behandlung in unbehandelten Zellen auf 1,6% verglichen. Diese Daten legen nahe, dass ROS NLRP3 Inflammasoms Aktivierung in Reaktion beitragen können zu M.hy
Herausforderung. Um diese Möglichkeit zu überprüfen, vorbehandelte wir THP-1 Zellen, die mit ROS-Inhibitor Diphenyliodonium (DPI) für 30 Minuten und dann in Frage gestellt, die Zellen mit M.hy
vor der Messung von IL-1β Produktion 6 Stunden später. Wie erwartet, drastisch reduziert DPI M.hy
IL-1β Freisetzung (5B) induziert. Eine neuere Studie hat gezeigt, dass ROS-Inhibitor, wie DPI IL-1β-Freisetzung durch Hemmen NLRP3 Genexpression in Mausmakrophagen abgeschafft [40]. Daher überwacht wir auch die mRNA-Ebene von Pro-IL-1β und NLRP3 unter DPI Behandlung. Wir fanden, dass DPI deutlich die Expression von pro-IL-1β und NLRP3 (5C-D) verringert, was mit der Feststellung von Mauszellen konsistent war [40]. Darüber hinaus untersuchten wir auch die Aktivierung von Caspase-1 und festgestellt, dass niedrige Dosen (1 oder 10 &mgr; M) von DPI-Behandlung nicht die Caspase-1-Aktivierung während 100 &mgr; M DPI gehemmt Caspase-1-Aktivierung (5E) nicht beeinträchtigte. Dies zeigte, dass DPI in menschlichen Zellen mit NLRP3 Inflammasoms Aktivierung durch Hemmung der NLRP3 Transkription gestört sowie Caspase-1-Aktivität, wenn eine hohe Dosis angewendet wurde. Zusammengefasst legen diese Daten nahe, dass Cathepsin B-Aktivität, K ^{+ Ausstrom, Ca 2+ Einstrom und ROS alle trugen zu NLRP3 Inflammasoms Aktivierung als Antwort auf M.hy
Herausforderung.}

M.hy
NLRP3 Inflammasoms Aktiviert in vivo

Wenn Knochenmark der Maus abgeleiteten dendritischen Zellen (BMDCs) wurden mit M.hy
eine anhaltende IL-1β Induktion wurde (6A) beobachtet. Weitere Experimente auf BMDCs isoliert aus Wildtyp (WT) Mäuse oder Mäuse mangelhaft für die Caspase-1, ASC oder NLRP3 mit M.hy
Herausforderung bestätigt, dass M.hy
Induktion von IL- 1β war NLRP3 abhängig (6B) Inflammasoms. Weiterhin systemische Inokulation von M.hy
in WT-Mäusen IL-1β-Produktion in Serum und peritoneale Lavage (PLF) induziert, aber nicht in Mäusen fehlt ASC oder NLRP3 (6C-D). Interessanterweise war die basale Niveau von IL-1β in ASC-defizienten Mäusen deutlich höher als bei WT oder NLRP3 defizienten Mäusen, sondern Herausforderung mit M.hy
weiter nicht die Sekretion von IL-1β in solchen Mäusen erhöhen (6C-D). Zusammengefasst bestätigt diese Ergebnisse, dass M.hy auch NLRP3 Inflammasoms aktiviert
Mäuse In-vitro-
und in vivo
.

M. hy
Induced IL-1β Fördert Magentumorzellmigration und Invasion

Die obigen Daten zeigten deutlich, dass M.hy
der Lage war, IL-1β Produktion von angeborenen Immunzellen durch NLRP3 zu induzieren Inflammasoms Aktivierung. Frühe epidemischen Studien zeigten eine mögliche Rolle von Mycoplasma in der Entwicklung von Magenkrebs [5]. Und Mycoplasma hyorhinis
demonstriert Tumorzellmigration, Invasion und Metastasierung von In-vitro-Karten und in vivo
[41] zu fördern. Wir vermuten, dass es einen anderen Mechanismus für diese Aktion existieren können, die ist, dass M.hy
durch die Förderung der Magen-Krebsentstehung und /oder Metastasierung fördern kann IL-1β-Produktion. Und wir bestätigt, dass M.hy
Magenkrebs Zellmigration und Invasion (Abbildung S5) gefördert. Da M.hy
Magenkrebszellen zu infizieren nachgewiesen wurde ([41], Abbildung S4), ist es somit möglich, dass M.hy
direkt Inflammasoms Aktivierung in Krebszellen induzieren kann. Es wurde jedoch keine Inflammasoms Aktivierung bei Magenkrebs-Zellen (S6) nachgewiesen.

Wir stellten fest, neben der Wirkung von humanen rekombinanten IL-1β (rIL-1β) auf die Magenkrebszelle Karzinogenese in einem Koloniebildungstest, die ergab, dass die rIL-1β nicht die Proliferation von Magenkrebs-Zelllinie MGC-803 (Abbildung S7) beeinflusst hat. Da IL-1β wurde berichtet, die Metastasierung von anderen Tumoren zu fördern [18], überprüften wir die Auswirkungen von rIL-1β auf die Migration und Invasion von MGC-803-Zellen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die MGC-803 Migration und Invasion mit rIL-1β Behandlung verbessert wurden (7A und 7C), während der Behandlung mit rIL-18 keine Wirkung (7B und 7D) zeigte. Als nächstes behandelt wir diese Magenkrebszellen mit den Kulturüberständen von M.hy
von NLRP3, mit Silencing Makrophagen oder Makrophagen in Frage gestellt THP-1 abgeleitet ASC und Caspase-1 für die Migration und Invasion Assay. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Kulturüberstände von M.hy
scramble Makrophagenzellen stark verbesserte Migration und Invasion von Magenkrebszellen herausgefordert, während die Kulturüberstände aus der NLRP3, ASC oder Caspase-1 Knockdown Makrophagen nicht taten, wahrscheinlich aufgrund der verminderten IL-1β-Sekretion (8A und 8C). Diese verbesserte Migration und Invasion von MGC-803-Zellen wurde durch die Behandlung der Zellen mit anti-IL-1β mAb (8B und 8D) aufgehoben. Zusammengenommen unsere Ergebnisse zeigen, dass M.hy
Migration und Invasion von Magenkrebs-Zelllinie-803 MGC induziert durch die Förderung von IL-1β Sekretion von monozytären Zellen. Darüber hinaus gab unsere Daten, dass M.hy
Inflammasoms Aktivierung induziert fördern können M.hy
Replikation (Abbildung S8), die ein positives Feedback erzeugen kann und führt schließlich zu Chronifizierung von Krankheiten.

Diskussion

Mykoplasmen unterscheiden sich von anderen Bakterien, die durch geringe Größe, Minute Genom und der Mangel an Zellwand. Viele Mykoplasmen Kolonisation und Infektion über die Einhaltung etablieren Gewebe zu bewirten. Weil ihre dynamische Oberflächen Architektur antigen und funktionell vielseitig ist, sind Mykoplasmen fähig Wirtsimmunangriff zu entziehen und die Anpassung an viele Lebensräume und verursachen chronische Krankheiten [32]. Da die Identifizierung von M.hy
swine 1962 wurde wenig untersucht zu diesem Pathogen durchgeführt, bis festgestellt wurde, mit verschiedenen menschlichen Krebsarten in Verbindung gebracht werden [5], [41], [42], [ ,,,0],43]. In jüngerer Zeit fanden Wissenschaftler heraus, dass M.hy
Protein p37 zur Förderung der Krebszelle Invasivität und Metastasierung verantwortlich war [30], [44]. Neben dieser direkten Mechanismus kann diese Mikrobe auch tumorigenesis oder Metastasierung induzieren indirekt über eine lokale chronische Entzündungsprozess. Es ist bekannt, dass IL-1β ein wichtiger pro-inflammatorischen Zytokins, das Wachstum von Dickdarmkrebszellen und verbessert die Invasivität und Metastasierung von B16-Melanomzellen [19], [45] fördert. Überexpression von IL-1β wurde gefunden Magen Entzündungen und Krebs in Mäusen zu induzieren [19]. In dieser Studie untersuchten wir, ob die NLRP3 Inflammasoms, die steuert, IL-1β Reifung von M.hy
aktiviert wurde, und ob diese Aktivierung auf M.hy beitragen kann
Magen Metastasierung assoziiert . Unsere Ergebnisse zeigten, dass M.hy
die NLRP3 Inflammasoms aktiviert In-vitro-
und in vivo
und die Förderung von Magenkrebs Zellmigration und Invasion von M .hy
war abhängig von NLRP3 Inflammasoms Aktivierung. Neben NLRP3 fanden wir, dass M.hy
DNA auch die AIM2 Inflammasoms aktiviert, aber MLAMP Aktivierung von NLRP3 war die dominierende Komponente für IL-1β Induktion von M.hy.

Es wurde kürzlich berichtet, dass acylierte Lipopeptid von Hitze abgetötete Mycoplasma Acholeplasma laidlawii
(HKAL) IL-1β-Produktion durch NLRP7 Inflammasoms in menschlichen Zellen induziert werden, während die Gesamt HKAL induzierte IL-1β Sekretion teilweise war NLRP3 abhängig [46], was darauf hinweist, dass mehrere Inflammasome kann durch bestimmte Mycoplasma aktiviert werden. Unsere Daten nicht aus, die mögliche Beteiligung von NLRP7 in M.hy
IL-1β Produktion induziert, aber M.hy
hauptsächlich aktiviert, um die NLRP3 Inflammasoms, weil die IL-1β-Sekretion fast vollständig in den NLRP3 zum Schweigen gebracht Zellen (3H und 3I) abgeschafft.

Frühe Studien vorgeschlagen, dass ROS die NLRP3 Inflammasoms aktivierte Caspase-1 durch die Aktivierung [47]. jüngsten Untersuchung ergab jedoch, dass ROS-Inhibitoren mit der Transkription von IL-1β und NLRP3 gestört, aber nicht berührt Aktivierung von Caspase-1 in Mauszellen [40]. In unserer Studie, obwohl ROS Hemmung mit niedrig dosiertem DPI (10 uM) signifikant die IL-1β Produktion auf reduziert M.hy
Herausforderung, hat es nicht die Caspase-1-Spaltung hemmen, die Markierung von Inflammasoms Aktivierung. Wenn jedoch hohe Dosis von DPI (100 uM) aufgebracht wurde, Caspase-1-Spalt deutlich gehemmt (5E) wurde, was darauf hindeutet, dass eine hohe Dosis von DPI kann die Montage von Inflammasoms Komplexes unterdrücken, obwohl wir nicht die Möglichkeit, dass dieser Effekt könnte ausschließen wurden von der NLRP3 mRNA Abschaffung von der Basislinie (Abbildung 5D) geführt. Es ist wahrscheinlich, dass die ROS-Inhibitor mit stören könnten sowohl pro-IL-1β-Synthese und Caspase-1-Aktivierung.

Wie M.hy
fördert ROS-Produktion in Makrophagen schwer fassbar bleibt. Der Mangel an Zellwand von M.hy
direkten Kontakt der Mycoplasma-Membran und Wirtszellmembran ermöglicht, und dieser Kontakt kann mit eukaryotischen Wirtszelle zu Fusion von Mycoplasma führen. Diese Fusion kann nicht nur auf Mycoplasma Komponenten führen in die Wirtszelle zu liefern, sondern auch das Einführen der Mycoplasma Membrankomponenten in die Membran der eukaryontischen Wirtszelle ermöglichen. Vor kurzem M.hy
Membranen wurden gefunden Phospholipase A (PLA) zu besitzen, die in der Plasmamembran Störung Prozess einbezogen werden können, die von der Invasion von Wirtszellen auftritt [48], [49]. Während dieses Prozesses können die Wirtszellen ROS erzeugen. Es würde sich lohnen, zu untersuchen, ob PLA für die M.hy erforderlich ist
ROS-Produktion und IL-1β-Sekretion induziert.

Wie unsere Daten belegen, lysosomale Bruch, K ^{+ Ausströmen, Ca 2+ Einstrom und ROS waren alle in beteiligt M.hy
induzierte NLRP3 Aktivierung. Wie bereits berichtet, K + Ausstrom und phagolysosomalen Bruch kann Ca induzieren 2 + Zustrom, während Ca 2 + Zustrom kann Dysfunktion der Mitochondrien verursachen, die von oxidierten mitochondriale DNA (mtDNA) in Freisetzung führt in die Cytosol, wo sie die NLRP3 Inflammasoms [9], [12] zu binden und zu aktivieren. Mitochondrien scheint durch NLRP3 spürte als zentrale Drehscheibe für die Integration der verschiedenen Signale zu handeln, aber der relative Beitrag von ROS und mtDNA für NLRP3 Inflammasoms Aktivierung ist bisher noch nicht klar, [9].}

Obwohl M .hy
ist nicht hoch virulent, es kann eine chronische Infektion etablieren. Durch eine allmähliche und schrittweise Interaktion mit Wirtszellen, induziert es chromosomale Instabilität und maligne Transformation, damit das Tumorwachstum zu fördern, Migration oder Invasion [50], [51]. Die M.hy
p37 Protein gefördert Magenkrebszellen, Prostatakarzinom und Melanomzelllinien Invasivität [30], [31]. Darüber hinaus tragen auch die pro-inflammatorischen Mikroumgebung wie IL-1β Produktion zu diesem Prozess [19]. Unsere Studie zeigt, dass M.hy
induzierte IL-1β Migration und Invasion der Magenkrebszellen gefördert, während M.hy
induzierte IL-18 auf die Migration und Invasion nicht der Fort Magenkrebszellen, die aus anderen Berichten anders war [26], [27]. Eine mögliche Erklärung ist, dass IL-18 Magenkrebszellen Migration und Invasion über die Regulation von CD70, CD44 und VEGF-Expression in Immunzellen gefördert haben, die unsere weitere Untersuchung verdient [26]. Eine andere Erklärung könnte sein, dass die Dosis von rIL-18 sie verwendet (150 ng /ml) ist viel höher als das, was wir verwendet [27]. Außerdem IL-1β gefördert Migration und Invasion der Magenkrebszellen können durch Matrix-Metalloproteinase-9 (MMP-9) als andere Forscher berichtet [52] vermittelt werden. Allerdings erhalten direkte und solidere Beweise und die entsprechenden Mechanismen über die Verbindung zwischen NLRP3 Inflammasoms Aktivierung ausgelöst durch M.hy, Poster und Magenkrebs Metastasen, geeignete Tiermodelle wie die in vivo
Tumorinvasionstest [53] und Patientenstudien werden für eine weitere Studie in der Zukunft benötigt.

Materialien und Methoden

Cell Culture

THP-1-Zellen, PMA-induzierte Makrophagen und Magenkrebszelle MGC-803 wurden in RPMI 1640-Medium mit essentieller Nahrungsergänzungsmittel gehalten. Humane Monozyten wurden isoliert durch Percol TM-Dichtegradientenzentrifugation (GE Healthcare Bio-Sciences, Schweden) aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs), erhalten von Shanghai Blood Center (Shanghai, China).

M.hy
Strain und PCR Nachweis

M.hy
Stamm in unserer Studie verwendet wurde, aus kontaminierten Zellkultur erhalten. Mykoplasmen Detektion wurde durch zwei Runden von PCR mit Zellkulturmedium durchgeführt [54]: Erstens laufen PCR mit vier Primern 5'-ACACCATGGGAGYTGGTAAT-3 ', 5'-CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT-3', 5'-AAAGTGGGCAATACCCAC GC-3 ', 5'-TCACGCTTAGATGCTTTCAGCG-3 'mit Zellkulturmedium als Vorlage. Zweitens nehmen 1 ul des obigen PCR-Produkts als Matrize und laufen PCR mit drei Primern 5'-GTGSGGMTGGATCACCTCCT-3 ', 5'-GCATCCACCAWAWACY CTTT-3', 5'-CCACTGTGTGCCCTTTGTTCCT-3 '. Die erste und zweite PCR wird unter dem gleichen Zyklus Zustand. Dann sequenziert wir das PCR-Produkt und erhielten die folgenden Sequenzen: ACTCTTACTTAATTTAAAAGTTAATACAACTTTAATATT GCCTATTATTGCTAAAGATAAATATCTTAAGGTATTTTAATATTGGTAATCTATTTTAGAAATTTAATTTAAAAATTAAACTCGGTTATAAAAAAGATCGTTGAAATAATAAATATGAAGTTAATCATATTGTTATTTGCTATTCAGTTTTCAAAGAACTATAATTGAGAACTTAAAGCTCTCAAAACTAGACACGAATCGATTATGTAATAAGTCAATTAAGACTAACGGAAAGCGGAAAAAGAAGGTGATCCGTCCCCACG. Durch BLAST in NCBI-Datenbank, erhielten wir die Information, dass die Mykoplasmen ist M.hy
. Es kann SK76, GDL-1 oder Mcld Stamm sein.

M.hy
Kultur, DNA-Extraktion und MLAMP Vorbereitung

M.hy
WAS kultiviert in modifizierter SP-4 Medium 20% neugeborene Rinderserum, 10% Hefeextrakt, 1% Glucose, 0,00024% Phenolsulfonphthalein und 1000 IE /ml Penicillin enthält. DNA-Extraktion aus M.hy
durchgeführt wurde gemäß den Anweisungen mit Reagenzien von Shanghai Lifefeng Biotechnology Co., Ltd M.hy
wurde als Farbwechseleinheiten (CCU) quantifiziert pro Milliliter, wie beschrieben [55]. Die Extraktion von MLAMP wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [34].

Real-time PCR

NLRP3 und IL-1β-mRNA-Expression durch quantitative Echtzeit-PCR bestimmt. Relative Quantifizierung von Genen wurden normalisiert gegen eine endogene Kontrolle β-Actin über Formel [2 ^{-ΔCt (Zielgen-β-Actin)]. Die verwendeten Primer waren: Homo sapiens (hs) IL-1β, 5'-CACGATGCACCTGTACGATCA- (vorwärts) 3 ', 5'-GTTGCTCCATATCC TGTCCCT- (rückwärts) 3'; ß-Actin, 5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG- (vorwärts) 3 ', 5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC- (rückwärts) 3'; NLRP3, 5'-AAGGGCCATGGACTATTTCC- (vorwärts) 3 ', 5'-GACTCCACCCGATGACAGTT- (rückwärts) 3'. M.hy
DNA-Kopien wurden durch quantitative Echtzeit-PCR mit Standard-Kurve Methodik für die absolute Kopienzahlen dertermined. Die spezifischen Primer, die für M.hy
waren. 5 'CGATTCGTGTCTAGTTTTGAG - (vorwärts) 3', 5 'ATTGCCTATTATTGCTAAAG - (rückwärts) 3'}

ELISA

Überstände von kultivierten Zellen, Maus-Serum und der Fluid Peritoneallavage Maus für Zytokine IL-1β wurden analysiert, IL-18, IL-6 oder IL-8-Sekretion durch ELISA (BD Biosciences) nach den Anweisungen des Herstellers.

die Erzeugung von THP-1-Zellen shRNAs Targeting Gene von Interesse

shRNA Vektoren gegen menschliche NLRP3, Caspase-1 und ASC Ausdruck und ihre Gerangel Vektoren sind Geschenke von Dr. Jurg Tschopp [56]. Über die Erzeugung von THP-1-Zellen, die shRNAs, kurz, nt GATGCGGAAGCTCTTCAGTTTCA menschlicher ASC kodierenden Sequenz nt CAGGTTTGACTATCTGTTCT menschlicher NLRP3 codierende Sequenz nt GTGAAGAGATCCTTCTGTA des 3'-UTR des menschlichen Caspase-1 wurden in pSUPER eingefügt.

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