PLoS ONE: Nicht-invasive Visualisierung von MicroRNA-16 in der Chemoresistenz von Magenkrebs Unter Verwendung eines Dual-Reporter Gene Imaging System

Abstrakt

MicroRNAs (miRNAs) sind eine zentrale Rolle bei der Entwicklung von Medikamentenresistenz in einer Vielzahl von malignen Erkrankungen spielen eine Rolle. Viele Studien wurden auf der In-vitro-
Ebene durchgeführt jedoch und konnte nicht bieten die in vivo
Informationen zu den Funktionen von miRNAs in der Anti-Krebs-Arzneimittel-Resistenz. Hier führten wir ein Dual-Reporter-Gen-Bildgebungssystem für nicht-invasiv die kinetische Expression von miRNA-16 Überwachung während der Chemoresistenz bei Magenkrebs sowohl In-vitro-
und in vivo
. Menschliche Natriumiodid Symporter (hNIS) und Glühwürmchen-Luciferase (Fluc) Gene wurden verknüpft hNIS /Fluc Doppel Fusion Reportergens zu bilden und dann menschlichen Magenkrebszelllinie NF-3xmir16 und seine multidrug resistance Zelllinie NF-3xmir16 /VCR erzeugen. Radiojodid Aufnahme und Fluc Lumineszenzsignale In-vitro-
korreliert gut mit Lebendzellzahlen. Die Luciferase-Aktivitäten und radioaktivem Jod-Aufnahme in NF-3xmir16 Zellen wurden bemerkenswert durch exogene oder endogene miRNA-16 unterdrückt. Der NF-3xmir16 /VCR-Zellen zeigten eine signifikante Zunahme von ^{131I Aufnahme und Lumineszenzintensität gegenüber NF-3xmir16 Zellen. Die Radioaktivität von in vivo
99m Tc-Pertechnetat Bildgebung und die Intensität von Biolumineszenz-Bildgebung wurden auch in NF-3xmir16 /VCR erhöhte sich im Vergleich mit dem in NF-3xmir16 Tumorxenografte. Darüber hinaus dieses Reporter-Gen-System, fanden wir, dass Etoposid (VP-16) und 5-Fluorouracil (5-FU) aktiviert miRNA-16-Expression In-vitro-
und in vivo
und die Hochregulation von miRNA-16 ist p38MAPK abhängig aber NF-kappaB unabhängig. Dieses Dual Imaging Reporter-Gen kann für In-vivo-Bildgebung
von microRNAs in der Chemoresistenz von Krebserkrankungen, sowie zur Früherkennung und Diagnose in der Klinik als ein neues Werkzeug bedient werden}

Citation:. Wang F, Song X, Li X, Xin J, Wang S, Yang W, et al. (2013) Nicht-invasive Visualisierung von MicroRNA-16 in der Chemoresistenz von Magenkrebs einen Dual Reporter Gene Imaging System. PLoS ONE 8 (4): e61792. doi: 10.1371 /journal.pone.0061792

Editor: Javier S. Castresana, Universität von Navarra, Spanien

Empfangen: 21. November 2012; Akzeptiert: 13. März 2013 beginnen; Veröffentlicht: 17. April 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit die National Natural Science Foundation of China unter Grants Nr wurde durch das Programm des nationalen Grundlagenforschung und Entwicklungsprogramm von China (973) unter Grant No 2012CB518101, 2011CB707702 unterstützt. 81090272, 81090274, 81227901, Innovation Teamentwicklung Förderung durch China-Abteilung of Education (2010CXTD01), 863-Programm von China (2012AA02A603) und der National Key Technology Support Program unter Grant No 2012BAI23B06. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:. Co-Autor Xiaoyuan Chen dient als Redakteur für diese Zeitschrift. Dabei werden nicht die Einhaltung der Autoren ändern, um alle Politiken PLoS ONE auf den Austausch von Daten und Materialien.

Einführung

Magenkrebs bleibt die erste häufigste Ursache für Krebstod in China und die vierthäufigste Bösartigkeit weltweit trotz einer dramatischen Abnahme der Mortalität und Morbidität in den letzten drei Jahrzehnten [1]. Die Chemotherapie wurde sowohl resectable und fortgeschrittenem Magenkrebs zu behandeln, weit verbreitet, was zu einer Verbesserung der Gesamtüberlebenszeit sowie die Lebensqualität der Patienten [2], [3]. Allerdings versagt Langzeit Chemotherapie oft alle Tumorzellen zu eliminieren, wegen der intrinsischen oder erworbene Multidrug-Resistenz (MDR), die die Hauptursache für Tumorrezidiv ist [4]. Derzeit hat der MDR als multifaktorielles Phänomen betrachtet worden Notfall mehrere Hauptmechanismen beteiligt, einschließlich der erhöhten Metabolismus von Arzneimitteln, verminderte Aufnahme von wasserlöslichen Medikamenten, veränderte Wirkstofftargets, reduzierte intrazelluläre Wirkstoffkonzentration von Effluxpumpen, veränderte Zellzyklus-Checkpoints und induziert Antwortgene apoptotischen Wege zu beeinträchtigen, etc
[5]. Obwohl die MDR-Mechanismen ausführlich untersucht worden sind, bleiben die Schlüsselfaktoren für dieses Phänomen weitgehend unklar.

MicroRNAs (miRNAs) sind eine neue Klasse von endogenen kleinen nicht-kodierenden RNAs (19-23 Nukleotide), die sich negativ auf Genexpressionen regulieren die post-transkriptioneller Ebene durch vollständige oder unvollständige Basenpaarung mit der 3'-untranslatierten Region (UTR) von Ziel-mRNAs und damit mRNAs Abbau oder Übersetzung Repression [6] induzieren. Derzeit haben Schwellen Studien die Existenz und die Bedeutung von miRNAs in der Entwicklung von Antikrebsarzneimittelresistenz und miRNAs Expressionsprofilen vorgeschlagen, können mit der Entwicklung von Arzneimittelresistenz korreliert werden [7] - [10] zeigt, dass die miRNAs vermittelte Form drug resistance fügt einen weiteren Mechanismus der MDR. In unserer früheren Studie wurde berichtet, dass zwei miRNAs, miRNA-15b und miRNA-16, wurden in einem multiresistenten menschlichen Magenkrebszelllinie SGC7901 /VCR und seine elterliche Zelllinie SGC7901 [11] unterschiedlich exprimiert. Es wurde jedoch erst am In-vitro-
Ebene durchgeführt und konnte nicht die in vivo
Informationen zu den Funktionen von miRNAs in der Anti-Krebs-Medikamentenresistenz zu reflektieren.

Die jüngsten Fortschritte in der molekularen Bildgebung erlaubt die nicht-invasive Darstellung von normalen und abnormalen zellulären Prozesse in lebenden Probanden auf molekularer Ebene und nicht auf der anatomischen Ebene [12]. Mehrere nicht-invasive Strategien, wie ein fluoreszierendes Protein, Luciferase-Reportergens, Nukleolin Aptamer oder fluoreszierende Molecular Beacon konjugiert Nanopartikel verwenden, wurden während der Karzinogenese, Neurogenese oder myogenesis In-vitro-
die Expressionsmuster verschiedener miRNAs zu überwachen entwickelt und in vivo
[13] - [16]. Die vorliegende Studie war es, ein nicht-invasives Verfahren zur Überwachung von miRNA-16 in der Chemoresistenz von Magenkrebs durch ein Dual-Imaging-Reporter-Gen-System, in dem die menschliche Natriumiodid Symporter (hNIS) und Glühwürmchen-Luciferase (Fluc) Gene eines Fusionsgens verknüpft wurden einzuführen, Biolumineszenz-Bildgebung und ^{99m Tc-Pertechnetat Gamma-Kamera-Bildgebung in vivo
.}

Materialien und Methoden

Tiere

Spezifische pathogen-free 8-Wochen -old weibliche BALB /c Nacktmäuse wurden von der Shanghai animal Center in China erhalten und in der Vierten Military Medical University Tierzentrum, China gezüchtet. Alle Versuchstiere wurden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen untergebracht. Die Tier Protokolle in dieser Studie verwendet wurden von der Vierten Military Medical University Ethics Review Board genehmigt. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Vierten Military Medical University Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren formuliert von der National Society for Medical Research durchgeführt.

Reagenzien und Antikörper

monoklonalen Maus-Antikörper gegen hNIS (ab17795) wurde von Abcam gekauft. Kaninchen polyklonalen Antikörper, der spezifisch an Bcl-2 wurde von Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) erworben. Bay11-7082 (NF-kappaB-Hemmer) und SB203580 (p38 MAPK-Inhibitor) wurden von Beyotime Institut für Biotechnologie (Shanghai, China) erhalten. Die Anti-Krebs-Arzneimittel, einschließlich Vincristin (VCR), Etoposid (VP-16), Mitomycin C (MMC), Cisplatin (CDDP), 5-Fluorouracil (5-FU) und Adriamycin (ADR) wurden von Wolsen Biotechnologie (Xi'an erworben haben, China). Der GV260-Fluc-puro Lentiviren Plasmid wurde aus Shanghai GeneChem Company (Shanghai, China) erhalten. Alle Zellkulturmedien und Serum wurden von Gibco (Grand Island, NY) erworben.

Doppel Reportergenplasmids konstruieren

Die kodierende Sequenz von hNIS-Gen wurde durch PCR aus einem Plasmid amplifiziert freundlicherweise von Dr. Weidong Yang (Vierte Military Medical University, China) unter Verwendung der folgenden Primer:

hNIS-Fw: 5'-CGGGATCCCGCCACCATGGAGGCCGTGGAGACC-3 '

hNIS-Rev: 5'-CGGGTACCGGTACGAGGTTTGTCTCCTGCTGGTC-3 '

Für den Aufbau eines dualen Expressionsvektor wurde die cDNA von hNIS Gens in das eingefügt BamH
I und Age
I-Restriktionsenzym-Stellen eines lentiviralen Vektors GV260 -Fluc-puro (Shanghai GeneChem, China), die eine Fluc Gen unter der Kontrolle des Ubiquitin-Promotors kodiert. Das resultierende Zweiexpressionskonstrukt GV260-hNIS /Fluc wurde weiter verwendet GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 Plasmid zu erzeugen. Drei Kopien von komplementären Sequenzen gegen miRNA-16 (3xmir16) wurden nach dem Stopp-Codon des hNIS eingefügt /Fluc Fusionsgen GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 (1A) zu erzeugen. Eine verschlüsselten Nukleotidsequenz ähnlicher Länge 3xmir16 wurde auch auf der 3'UTR von hNIS /Fluc-Fusionsgens eingeführt, um ein Kontrollkonstrukt (GV260-hNIS /Fluc-Gerangel. Die 3xmir16 Sequenz oder Gerangel Sequenz, die durch das Glühen der folgenden Oligonukleotide wurden erhalten zu erhalten :

3xmir16-Fw: 5'-CGCCAATATTTACGTGCTGCTACGCCAATATTTACGTGCTG-CTACGCCAATATTTACGTGCTGCTA-3 '

3xmir16-Rev: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCGTAGCAGCACGTAAATAT-TGGCGTAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3'

Scramble-Fw: 5 '- TCGTGGCGTCATTTCTTCAGAATCCGTCCTCCCAAGTACT-CAGTGTGCTAATGTCTATCGATACAA-3'

Scramble-Rev: 5'-TTGTATCGATAGACATTAGCACACTGAGTACTTGGGAGG-ACGGATTCTGAAGAAATGACGCCACGA

Magenkrebs-Zellkultur und stabile Zelllinie Generation

Menschliche Linie Magenkrebs SGC7901 und seine multidrug-resistente Variante SGC7901 /VCR (etabliert und in unserem Labor gehalten, wie zuvor beschrieben [11]) wurden in RPMI-1640-Medium mit 10% fötalem Kälberserum und 100 Einheiten Penicillin und 100 ug /ml Streptomycin (Invitrogen ). Um den MDR Phänotyp, Vincristin (mit einer Endkonzentration von 1 &mgr; g /ml) aufrechterhalten wurde SGC7901 /VCR-Zellen zu dem Kulturmedium zugegeben. Zur Erzeugung von stabilen Zelllinie, Lentivirusvektor GV260-hNIS /Fluc oder GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 wurde zum ersten Mal in 293T-Zellen kotransfiziert mit Plasmiden, die Verpackung ( gag, pol, VSV-G
). Das Wachstumsmedium wurde bei 6 h nach der Transfektion und Lentiviren-haltige Überstand verändert bei 48 h nach der Transfektion geerntet. Die geernteten Überstände wurden bei 4.000 g für 10 min zentrifugiert, um Zelltrümmer zu pelletieren. Konzentrierte Virus wurde auf 293T-Zellen titriert. SGC7901 Zellen und SGC7901 /VCR-Zellen wurden mit GV260-hNIS /Fluc und GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 Virus transduziert jeweils bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10. Dann wurden die Zellen mit Puromycin für 3 Wochen und Zellkolonien gescreent gesammelt erweitert für den nächsten Schritt Experimente

RNA-Oligos und Transfektion

Die miRNA-16 und Negativkontrolle (NC) RNA-Oligos wurden synthetisiert (Shanghai Genepharma, China) durch die folgenden Sequenzen.:

miRNA-16 Sinn: 5'-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3 '

miRNA-16 anti-sense: 5'-CGCCAAUAUUUACGU-GCUGCUA-3'

NC Sinn: 5 '-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3'

NC anti-sense: 5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3 '

Vor der Transfektion wurden SGCC7901 Zellen bei 1 × 10 ^{ausgesät 5 Zellen pro Vertiefung in eine 24-Well-Platte und 24 h wachsen. Transfektionseffizienz wurde mit Lipofectamin 2000-Reagens (Invitrogen) durchgeführt nach dem Protokoll des Herstellers. Alle Transfektion wurden dreifach durchgeführt.}

Quantitative real time PCR (qRT-PCR) Analyse

Gesamt-RNA aus den kultivierten Zellen isoliert wurde mit Trizol (Invitrogen). RT wurde mit PrimerScript RT Regent Kit durchgeführt (Takara, Japan) und qPCR wurde mit Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) und ABI StepOne Plus-Echtzeit-PCR-System (Applied Biosystems) durchgeführt nach dem Protokoll des Herstellers . PCR-Produkte wurden auf 3% Agarose-Gelen analysiert. Die relative Menge von miRNA-16 wurde auf U6 snRNA normalisiert. Und die relative Menge an Fluc war GAPDH Gen normalisiert. Die fold change für miRNA-16 oder Fluc-Gen aus Experiment Gruppe in Bezug auf die Kontrollgruppe wurde die 2 berechnet ^{-ΔΔCt Methode, bei ΔΔCt = ACt Experiment - ACt Kontrolle und ACt = Ct miRNA - Ct U6 oder ACt = ct Fluc - ct GAPDH. PCR wurde dreifach durchgeführt. Die Primer, die für Stamm-Schleifen-RT-PCR für miR-16 verwendet werden, wie folgt aufgeführt:}

U6 Fw: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 '

U6 Rev: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3 '

miR-16 RT 5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGG-ATACGACCGCCAAT-3'

miR-16 Fw: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3 '

miR-16 Rev: 5 '-TGCGTGTCGTGGAGTC-3'

Fluc-Fw: 5'-GGTCCTATGATTATGTCCGGTTATG-3 '

Fluc-Rev: 5'-ATGTAGCCATCCATCCTTGTCAAT-3'

GAPDH-Fw: 5'-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3 '

GAPDH-Rev: 5'-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3'

Western-Blot-Analyse

SGC7901 Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und dann lysiert in kaltem Lysepuffer (20 mM NaCl, 200 mM Tris-HCl [pH 7,4], 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1% Triton X-100 und 1% Aprotinin) für 30 min auf Eis. Zelllysate wurden dann bei 12.000 rpm für 15 min bei 4 ° C zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und gleiche Proteinmengen wurden durch 8% SDS-PAGE aufgetrennt und dann auf Nitrocellulosemembranen überführt. Die Membranen wurden in Blockierungslösung, enthaltend 5% BSA für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und dann mit den angegebenen Antikörpern immuno-geblottet. Immunreaktive Banden wurden unter Verwendung eines verstärkten Chemilumineszenz-Kits (Amersham Pharmacia Corp., Piscataway, NJ) sichtbar gemacht.

MTT-Test

Um die Wachstumsraten von NF-leer bestimmen, NF-3xmir16 und NF-3xmir16 /VCR-Zellen wurden diese drei Arten von Zellen in 96-Well-Platten mit den gleichen Nummern (5000 Zellen) pro Vertiefung beimpft. Zu verschiedenen Zeitpunkten (24, 48, 72, 96 h), 25 &mgr; l von 5,0 mg /ml sterilfiltriert 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5- diphenyl tetrazoliumbromid (MTT; Sigma) zu jeder Vertiefung zugegeben. Das nicht umgesetzte Farbstoff wurde nach 4 h Inkubation entfernt und die unlöslichen Formazan-Kristalle wurden in 100 &mgr; l Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Die Absorption bei 570 nm (Referenzwellenlänge, 630 nm) wurde mit einem Synergy II Multimode-Mikroplatten-Reader (BioTech Instruments, VT) gemessen.

Radioaktive Jodid-Aufnahme-Assay

Um die Beziehung zwischen Jodid identifizieren Aufnahme und der Zellzahl wurde eine Verdünnungsreihe von Zellen in 24-Well-Platten inokuliert. Nach 12 h Inkubation wurde die ^{131I Aufnahme Ebene untersucht. Die Jodid-Aufnahme durch Inkubation der Zellen mit 500 ul Hanks 'ausgeglichener Salzlösung (HBSS), enthaltend 0,5% Rinderserumalbumin und mit 37 kBq von trägerfreiem Na 131I und 10 mM NaI für 30 min bestimmt. Nach der Inkubation wurden die Zellen zweimal so schnell wie möglich mit 1 ml eiskaltem HBSS-Puffer gewaschen. Zellen wurden mit 200 &mgr; l Trypsin abgelöst, und die Radioaktivität wurde unter Verwendung eines γ-Zählers (Perkin-Elmer) gemessen. Um die funktionelle Expression von hNIS in Reportergensystem, NF-3xmir16 Zellen ausgewertet wurden bei 1 × 10 5 Zellen pro Vertiefung in einer Platte mit 24 Vertiefungen am Tag vor der Transfektion dann miRNA-16 und NC-Oligos ausgesät in transfiziert . 24 h später wurden die Jodid-Aufnahme gemessen, wie oben beschrieben.}

In-vitro-
Biolumineszenz-Bildgebung Test

Um die Beziehung zwischen Lumineszenz-Signalen und Zellzahlen, eine Verdünnungsreihe identifizieren der Zellen wurden in 24-Well-Platten inokuliert. Nach 12 h Inkubation wurde jede Vertiefung mit phosphatgepufferter beffered Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Dann D-Luciferin (Xenogen) in einer Konzentration von 0,5 mmol /l wurde unmittelbar vor dem Test zugegeben. Biolumineszenz wurde mit einem IVIS 100 Imaging System (Xenogen) gemessen und analysiert, um die lebendige Bild Software-Version mit 2,50 (Xenogen). Um die funktionelle Expression von Fluc in Reportergensystem, NF-3xmir16 Zellen ausgewertet wurden bei 1 × 10 ^{5 Zellen pro Vertiefung in einer Platte mit 24 Vertiefungen am Tag vor der Transfektion dann miRNA-16 und NC-Oligos ausgesät in transfiziert . 24 Stunden später wurde die Biolumineszenz-Assay gemessen, wie oben beschrieben.}

Biolumineszenz und 99m Tc-Pertechnetat Bildgebung in Nacktmäusen

Gleiche Zahlen (5 x 10 ^{6 Zellen) NF-leer und NF-3xmir16 oder NF-3xmir16 /VCR und NF-3xmir16 Zellen wurden xenografted subkutan in die linke und rechte Hinterflanke jedes Nacktmaus wie in den Ergebnissen angegeben. Biolumineszenz-Bildgebung wurde einen Tag nach der Zellinjektion erworben. Alle Mäuse wurden mit 2,5% Isofluran Gas in Sauerstoff bei einem Durchfluß von 1,5 l /min narkotisiert. Eine wässrige Lösung von D-Luciferin (150 mg /kg Körpergewicht) wurde perkutan 10 min vor der Bilderzeugung injiziert. Die Ganzkörperaufnahmen für Fluc Signale wurden für 2 min erworben und Living-Image Software (Xenogen) ausgeführt wurde Biolumineszenz Bilder zu erhalten. Ein ROI wurde manuell über die Signalstärke ausgewählt. Biolumineszenz-Signale werden als Photonen pro Sekunde pro Kubikzentimeter pro Steradiant (p /sec /cm 2 /sr) innerhalb eines ROI ausgedrückt.}

Für die nuklearmedizinische Bildgebung, die Tumor-Mäuse wurden intraperitoneal mit 18,5 MBq Lager von ^{99m Tc-Pertechnetat bei 2 Wochen nach der Zellinjektion. 30 min nach der Injektion wurde das Tier in einen ausgebreiteten Rückenlage auf dem Bett des SPECT-Scanner (Symbia T2, Siemens) platziert. Die Narkose wurde mit 1% bis 2% Isofluran in 100% O _{2 während der Injektion und Abbildung durchgeführt. Alle Bilder wurden mit einer 2-dimensional geordneten Teilmengen Erwartungs maximalen Algorithmus rekonstruiert. Die Aktivität wurde durch Betrachten der Regionen von Interesse (ROI) in den Tumoren und den Bereich des ROI quantifiziert wurde für alle Kern- und optische Bilder konstant gehalten. Nach Biolumineszenz und 99m Tc-Pertechnetat Bildgebung wurden die Tumoren gesammelt und gewogen.}}

Die statistische Analyse

Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Die Daten zeigen Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden unter Verwendung beurteilt die t-Tests von Student. Vergleiche zwischen mehr als zwei Gruppen wurden unter Verwendung der Varianzanalyse (ANOVA) mit dem entsprechenden posthoc Tests beurteilt. P-Werte. ≪ 0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet

Ergebnisse

• PLoS ONE: MicroRNA-219-2-3p Funktionen als Tumorsuppressor bei Magenkrebs und wird reguliert durch DNA-Methylation
• PLoS ONE: Assoziation zwischen Glutathion-S-Transferase T1 Null-Genotypen und Magenkrebsrisiko: Eine Meta-Analyse von 48 Studies