PLoS ONE: verstärkte Expression von Long nicht-kodierenden RNA HOTAIR ist im Zusammenhang mit der Entwicklung von Magen Cancer

Abstrakt

Die lange nicht-kodierenden RNA HOTAIR wurde berichtet, ein schlechter prognostischer Biomarker in einer Vielzahl von zu sein bösartige Tumore. Es ist jedoch wenig über die Vereinigung von HOTAIR mit Magenkrebs bekannt. Wir untersuchten die Expression von HOTAIR in 68 Magenkrebs-Proben mittels quantitativer real-time RT-PCR und analysiert ihre Korrelation mit den klinischen Parametern. Die funktionelle Bedeutung HOTAIR wurde durch Erzeugung von menschlichen Magenkrebszelllinien mit erhöhtem oder unterdrückt HOTAIR Ausdruck untersucht. Die Verankerung -unabhängigen Wachstum wurde durch Soft-Agar-Test bewertet. Die erhöhte oder unterdrückt HOTAIR Magenkrebszellen exprimierten, wurden in die Schwanzvene oder den Peritonealraum von immundefizienten Mäusen injiziert, um die Wirkung dieses Moleküls auf der Metastasierung und peritoneal Verbreitung zu untersuchen. Die Expression von HOTAIR war signifikant höher als bei Krebs-Läsionen als in benachbarten, nicht-Krebsgewebe im menschlichen Magen-Krebs. Bei der diffusen Art von Magenkrebs, die Hoch HOTAIR Gruppe (HOTAIR /GAPDH > 1) zeigte deutlich mehr venösen Invasion, häufige Lymphknotenmetastasen und eine niedrigere Gesamtüberlebensrate im Vergleich zu den Low-HOTAIR Gruppe (HOTAIR /GAPDH < 1). Koloniebildung auf dem weichen Agar wurde in einer HOTAIR abhängigen Weise erhöht. HOTAIR exprimierenden MKN74 gebildet mehr Lebermetastasen im Vergleich zu steuern, wenn sie in die Schwanzvene von Mäusen injiziert. Darüber hinaus reduzierte Expression von HOTAIR in KATO III Peritonealdialyse Verbreitung unterdrückt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass HOTAIR eine zentrale Rolle bei der Entwicklung von Magenkrebs spielt

Citation. Endo H, Shiroki T, Nakagawa T, Yokoyama M, Tamai K, Yamanami H, et al. (2013) verstärkte Expression von Long nicht-kodierenden RNA HOTAIR ist mit der Entwicklung von Magenkrebs in Verbindung gebracht. PLoS ONE 8 (10): e77070. doi: 10.1371 /journal.pone.0077070

Editor: Dajun Deng, Peking University Cancer Hospital und Institute, China

Received: 10. Juni 2013 beginnen; Akzeptiert: 5. September 2013; Veröffentlicht: 10. Oktober 2013

Copyright: © 2013 Endo et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI Zuschuss numbers24791480 und 24.591.022 (http://www.jsps.go.jp/j-grantsinaid/index.html) und grant-in-aid von HIROMI Medical Research Foundation (http unterstützt: //www.smtb .jp /personal /Betrauung /Management /public /Beispiel /pdf /natural-06a.pdf) und Daiwa Securities Health Foundation (http://www.daiwa-grp.jp/dsh/grant/outline.html). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

die Häufigkeit und Sterblichkeit von Magenkrebs in den meisten Regionen der Welt dramatisch in den letzten 50 Jahren zurückgegangen, aber es bleibt immer noch die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle weltweit [1]. Trotz der jüngsten Fortschritte in diagnostischen Verfahren, wie Vergrößerungs Endoskopie mit schmalbandigen imaging (NBI) [2] und in der Behandlung, einschließlich Zieltherapie [3,4], gibt es noch eine große Anzahl von Patienten mit Magenkrebs mit einer schlechten Prognose. Der Pathomechanismus der aggressiven biologischen Funktion in diesem Krebs beitragen noch geklärt werden.

Das Genom-Sequenzierungsprojekte zeigten, dass das menschliche Genom von weniger als 2% Protein kodierenden Genen besteht, und mehr als 90% des Genoms transkribiert wird als nicht-kodierenden RNAs (ncRNA) [5-7]. Diese ncRNAs werden in zwei Gruppen eingeteilt, je nach dem Nukleotid Größe. Micro-RNAs sind etwa 18 bis 25 Nukleotide lang, während lange nicht-kodierenden RNA von mehr als 200 Nukleotiden besteht. HOTAIR ist eine lange nicht-codierende RNA, die von einem benutzerdefinierten Bebauen Array des Hoxc Locus identifiziert wurde. HOTAIR wurde gezeigt, dass Histon H3 Lysin-27 von HOXD Locus mit dem polycomb repressive Komplex 2 (PRC2) und hemmen HOXD Genexpression, das sich auf einem anderen Chromosom [8] trimethylate. HOTAIR fördert Metastasierung durch Interaktion mit PRC2 die Transkription von mehreren Metastasierung Suppressor-Gene in Brustkrebs zu reprimieren [9]. Die verstärkte Expression von HOTAIR mit Invasivität, Metastasierung und einer schlechten Prognose in einer Vielzahl von Krebsarten wie Brust-, Darm-, Bauchspeicheldrüsen- und Lungenkrebs [9-12] verbunden. Es ist jedoch wenig über die Expression und /oder die Funktion von HOTAIR in Magenkarzinom Entwicklung bekannt. In der aktuellen Studie untersuchten wir die Beteiligung von HOTAIR in der menschlichen Entwicklung von Magenkrebs und untersucht, ob seine Expression mit dem aggressiven Verhalten von Magenkrebs korrelieren würde.

Materialien und Methoden

Tissues

68 Magenkrebs Gewebe wurden von Patienten erhalten, die eine Operation bei Miyagi Cancer Center (Natori, Japan) wurden, zwischen 2007 und 2011. Alle Proben sofort bald eingefroren wurden in flüssigem Stickstoff nach der Resektion und gelagert bei -80 ° C oder fixiert 10% gepuffertem Formalin und in Paraffin eingebettet. Die Magenkrebs wurden histologisch als intestinalen Typ klassifiziert (n = 36), diffuse Typ (n = 32) nach der Klassifikation der Weltgesundheitsorganisation und früheren Berichten [13]. Bei keinem der Patienten erhielten eine Chemotherapie und Strahlentherapie vor der Operation. Für die statistische Analyse wurde durch den Tod des Gesamtüberlebens von jeglicher Ursache, und Kaplan-Meier-Überlebenskurven verwendet wurden.

Zelllinien

Die Magen-Krebs-Zelllinien MKN74 (Darm-Typ) [14] und KATO III (diffuse Typ) [15] wurden von RIKEN BioResource Center (Tsukuba, Japan) erhalten. Beide Zellinien wurden in RPMI-1640 (Gibco /Life Technologies Co., CA) mit 10% inaktiviertem FBS (Euroclone, Milano, Italien) mit 100 Einheiten /ml Penicillin und 100 ug /ml Streptomycin (Gibco /Life Technologies Co. beibehalten CA,) und kultiviert in einem befeuchteten 5% CO _{2 Inkubator bei 37 ° C.}

RNA-Präparation, reverse Transkription und quantitative Echtzeit-PCR

Gesamt-RNA aus gefrorenen Proben und Zelllinien wurde durch isogene (NIPPON GENE, Tokyo, Japan) extrahiert nach dem Protokoll des Herstellers. cDNAs von allen Proben wurden aus 1,0 &mgr; g Gesamt-RNA durch PrimeScript® erste Strang cDNA Synthese Kit (Takara Bio, Siga, Japan) nach dem Protokoll des Herstellers synthetisiert. Die Expression von HOTAIR wurde von LightCycler Brilliant SYBR Green qRT-PCR-Kit (Roche Applied Science, IN) nach dem Protokoll des Herstellers mit den spezifischen Primer-Sets entsprechend der früheren Studie [9] quantifiziert. Das Niveau der Expression HOTAIR in jeder Probe wurde auf den jeweiligen GAPDH Expressionsniveau normalisiert. Die Spezifität jeder PCR-Reaktion wurde durch Schmelzkurvenanalysen bestätigt.

HOTAIR Ausdruck retroviraler Vektor

Human HOTAIR cDNA (addgene, Cambridge, MA) wurde durch PCR und wurde in die pBabe puro eingefügt Vektor (pBabe -HOTAIR). Rekombinante Retrovirus wurde mit Platin-A (Plat-A, bereitgestellt von Prof. Kitamura) hergestellten Verpackungszelllinien, wie zuvor beschrieben [16]. Kurz gesagt, wurden Plat-A-Zellen mit pBabe -HOTAIR oder pBabe-puro Vector (EV) transfiziert. Fugene-6 (Roche Applied Science) und Opti-MEM I (Gibco /Life Technologies Co.) wurden nach dem Protokoll des Herstellers hinzugefügt. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurde das Retrovirus enthaltende Überstand gesammelt und durch ein 0,45 um-Filter. MKN74-Zellen wurden mit den rekombinanten Retroviren infiziert und dann mit Puromycin selektiert.

RNA-Interferenz

HOTAIR in KATO III Knockdown, haben wir Knockout ™ RNAi-Systeme (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA) nach dem Protokoll des Herstellers. Kurz gesagt, haben wir vier shRNA-Sequenz HOTAIR gezielt entworfen, wie in Tabelle 1. Nach dem Tempern der komplementären Oligonucleotide shRNA gezeigt, ligiert man die geglühten Oligonukleotiden in pSIREN Vektor (shHOTAIR). Dann wir transfizierte Plat-A-Zellen mit shHOTAIR oder pSIREN Vektor (EV) und infiziert KATO III mit den rekombinanten Retroviren und mit Puromycin selektiert. Die Zellen transduziert mit dem sh-HOTAIR2 und -3 Vektor wurden für weitere Untersuchungen ausgewählt. Jedes in vitrto
Experiment wurde dreifach durchgeführt, dreimal wiederholt und repräsentative Daten werden angezeigt.
shRNA
Sequence
shHOTAIR-1sensegatccgaacgggagtacagagagattttcaagagaaatctctctgtactcccgttcttttttganti-senseaattcaaaaaagaacgggagtacagagagatttctcttgaaaatctctctgtactcccgttcgshHOTAIR-2 sensegatccgccacatgaacgcccagagattttcaagagaaatctctgggcgttcatgtggttttttg anti-senseaattcaaaaaaccacatgaacgcccagagatttctcttgaaaatctctgggcgttcatgtggcgshHOTAIR-3 sensegatccgtaacaagaccagagagctgttttcaagagaaacagctctctggtcttgttattttttganti-senseaattcaaaaaataacaagaccagagagctgtttctcttgaaaacagctctctggtcttgttacgshHOTAIR-4sensegatccaattcttaaattgggctggttcaagagaccagcccaatttaagaattttttttganti-senseaattcaaaaaaaattcttaaattgggctggtctcttgaaccagcccaatttaagaattgTable 1. Sequenzen von shRNA-Einsätze für die shHOTAIR exprimierenden Vektor.
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Zellwachstumstest

1 x 10 ^{4-Zellen wurden in 96-Well-Platten in normalen Zellwachstum pro Vertiefung ausgesät Medien. Die 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-Diphenyltetrazoliumbromid, gelb tetrazol (MTT) Assay wurde unter Verwendung eines Zellproliferation Kit I (GE Healthcare Life Sciences, NJ) durchgeführt nach dem Protokoll des Herstellers. Messungen der Extinktion bei 570 nm von VersaMax (Molecular Devices, CA) wurden hergestellt nach 24, 48 und 72 Stunden Inkubation MTT-Formazan-Produktion zu schätzen. Der Index bei 48 und 72 Stunden ausgewertet wurde bei 24 Stunden, dass normalisiert.}

Soft-Agar-Koloniebildungstest

Soft-Agar-Assays wurden in 6-Well-Platten konstruiert. Die Basisschicht aus jeweils aus gut von 1 ml mit Endkonzentrationen von 1 x Medien (RPMI-1640 plus 10% inaktiviertes FBS) und 0,6% mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose. Die Platten wurden bei Raumtemperatur, bis sie fest gekühlt, an welcher Stelle eine 1-ml Wachstum Agar-Schicht gegossen wurde, bestehend aus 1 x 10 ^{4 suspendierten Zellen in 1 x Medien und 0,3% mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose. Platten wurden erneut bei Raumtemperatur gekühlt, bis die Wachstumsschicht erstarrt. Eine weitere 1 ml 1 x media ohne Agarose wurde am Tag 0 auf der Oberseite der Wachstumsschicht zugegeben und erneut am Tag 14 des Wachstums. Die Zellen wurden bei 37 ° C für 4 Wochen und insgesamt Kolonien gezählt wurden wachsen gelassen.}

Tiere

6-Wochen alten weiblichen NOD /Shi-scid-IL2Rγ ^{null (NOG ) Mäuse wurden von Zentralinstitut für Versuchstiere (CIEA, Kawasaki, Japan) und verwendet in diesem Experiment gekauft. Sie wurden für eine Woche vor den Experimenten akklimatisieren. Sie wurden in einem Reinraum der Tierstation in Miyagi Krebsforschungszentrum und hielt unter Standardtemperatur, Luftfeuchtigkeit und zeitlich abgestimmten Lichtverhältnissen und zur Verfügung gestellt Mäusefutter /Wasser ad libitum untergebracht.}

Schwanzvene Test der Metastasierung von Krebszellen

die Wirkung von HOTAIR Ausdruck auf hämatogenen Metastasierung zu bewerten, injiziert wir 1,0 x 10 ^{5 Zellen von HOTAIR- (n = 9) oder EV-exprimierende (n = 9) MKN74 mit 0,2 ml PBS in die Schwanzvene von Mäusen. Die Mäuse wurden für die Dauer des Experiments im allgemeinen auf Anzeichen von Krankheit wöchentlich beobachtet, und sie wurden 8 Wochen nach der Injektion getötet. Die Lunge, Leber, Nieren, Nebennieren und die Milzen der Mäuse wurden ausgeschnitten und wurden makroskopisch über die Anwesenheit von Metastasen untersucht.}

Peritoneal Metastasierung

1,0 x 10 ^{6 Zellen shHOTAIR- (n = 5) oder EV-exprimierende (n = 5) KATO III wurden mit 0,2 ml PBS in die Bauchhöhle injiziert von Mäusen, die die Wirkung von HOTAIR Ausdruck auf peritoneale Metastasierung zu bewerten. Die Mäuse wurden für die Dauer des Experiments im allgemeinen auf Anzeichen von Krankheit wöchentlich beobachtet, und sie wurden 8 Wochen nach der Injektion getötet. Das Vorhandensein von Knötchen und Aszites in der Bauchhöhle untersucht.}

Histologie und Immunhistochemie

Die ausgeschnittenen Gewebe wurden für 24 Stunden in 10% gepuffertem Formalin fixiert, dann und für die mikroskopische in Paraffin eingebettet geschnitten Untersuchung. Die Proben wurden geschnitten in 4 um dicke Abschnitte und gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin (H & E). Wir untersuchten die Anwesenheit von Mikrometastasen, die makroskopisch nicht erkannt wurde. Die erkannten Tumoren wurden weitere immunhistochemisch unter Verwendung primärer Antikörper für die menschliche Cytokeratin (Anti Cytokeratin Low, DC10 /5D3, Nichirei Co, Tokio, Japan), um sicherzustellen, untersucht, dass sie von injizierten menschlichen Magenkrebszellen abgeleitet wurden. Nach Entparaffinierung, die endogene Peroxidase-Aktivität zu blockieren die Gewebeschnitte wurden in Methanol mit 0,3% Wasserstoffperoxid in destilliertem Wasser für 20 Minuten inkubiert. Antigen Retrieval wurde durch Druck durchgeführt für 5 min bei 95 ° C Kochen in 10 mM Citratpuffer, pH 6,0, und verließ dann 30 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Endogene Biotin- oder Avidin-Bindungsstellen wurden 30 Minuten lang durch sequentielle Inkubation blockiert. Die Schnitte wurden über Nacht bei 4 ° C mit dem primären Antikörper oben beschrieben inkubiert und mit dem zweiten Antikörper reagiert. Ein Avidin-Biotin- Peroxidase-Komplex wurde verwendet, um den zweiten Antikörper zu erkennen. Die Färbung wurde mit Diaminobenzidin (DAB) sichtbar gemacht. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt, gewaschen und dehydriert eines Gradienten von Ethanol zu Xylol.

Die statistische Analyse

Die Korrelation von HOTAIR Ausdruck mit der klinisch-pathologischen Variablen des Patienten und die Rate der Metastasierung in der injizierten Mäuse wurden durch Chi-Quadrat-Test analysiert. Die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen den zwei Gruppen wurde mit Wilcoxon-Test bestimmt und P
Wert (

< 0,05) wurde als statistisch signifikant angesehen. Statistische Differenz zwischen drei Gruppen wurde unter Verwendung von Stahl Dwass Test oder Bonferroni Analyse ausgewertet und P
Wert (< 0,017) als statistisch signifikanten Gesamtüberlebenswahrscheinlichkeit angesehen wurde durch die Kaplan-Meier-Verfahren analysiert und bewertet, indem Log-Rank Test und P
Wert (< 0,05) wurde als statistisch signifikant angesehen. Alle statistischen Analysen wurden mit Ekuseru-Toukei 2012 (Social Survey Research Information Co., Ltd., Tokio, Japan) durchgeführt. Die P
Wert (< 0,05) wurde als statistisch signifikant angesehen

Ethik

Die Institutional Review Board des Miyagi Cancer Center (MCC) dieses Studienprotokoll genehmigt. und eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von jedem Patienten (Zulassungsnummer: MCC-22-30) erhalten. Das Protokoll von Tierversuchen wurde von der MCC Animal Care und Use Committee (Zulassungsnummer: MCC-AE-2011-12) zugelassen.

Ergebnisse |

Der HOTAIR Ausdruck der menschlichen Magenkrebs Proben

die HOTAIR Expressionsniveaus von Krebs und benachbarten noncancerous Gewebe von den Magenkrebs-Patienten wurden durch qRT-PCR und normalisiert durch den GAPDH Expressionsniveau untersucht. Die mittlere Expressionsniveau von HOTAIR war 4,952 ± 6,462 und 3,804 ± 6,721 (HOTAIR /GAPDH ± Standardabweichung) in Karzinom und nicht-kanzerösen Läsionen sind. Die Expressionsniveaus von HOTAIR waren signifikant höher als bei Karzinom Läsionen im Vergleich zu denen von nicht kanzerösen Läsionen ( P
= 0,019, 1A).

Assoziation zwischen der Expression von HOTAIR und der klinisch-pathologischen Faktoren in menschlichen Magenkrebs

Die menschlichen Gewebe wurden Magenkrebs histologisch in Darm-klassifiziert (n = 36) und diffuse Typen (n = 32). Die menschlichen Magenkrebsgewebe wurden klassifiziert weiter nach dem HOTAIR Expressionsniveau in den Hoch HOTAIR Gruppe (HOTAIR /GAPDH > 1,0) und Low-HOTAIR Gruppe (HOTAIR /GAPDH < 1,0) (1B und C). Der Verband der HOTAIR Ausdruck mit den klinisch-pathologischen Eigenschaften im Darm und diffusen Typ von Magenkrebs ist in den Tabellen 2 und 3 zusammengefasst. Im Darm-Typ von Magenkrebs, wurde keine signifikante Korrelation zwischen HOTAIR Expression und der klinisch-pathologischen Befunde (Tabelle 2). Darüber hinaus wurde keine signifikante Beziehung zwischen HOTAIR Ausdruck und die Gesamtüberlebenszeit gesehen, obwohl die Hoch HOTAIR Gruppe kürzere Überlebenszeit als die Low-HOTAIR Gruppe (2A) zu zeigen pflegen. Auf der anderen Seite wurde eine signifikante Assoziation zwischen HOTAIR Expression und Lymphknotenmetastasen (P = 0,043), venöse Infiltration ( P
= 0,0083), und kurze Gesamtüberlebenszeit ( P
gefunden = 0,018) in der diffusen Typ Magenkrebs (Tabelle 3 und 2B). Allerdings gab es keinen Zusammenhang zwischen der Bühne und HOTAIR Ausdruck.
HOTAIR niedrig
HOTAIR hoch
P
Wert
Age73.07 ± 9.1870.87 ± 10.650.53Gender0.63Male1016female37T0.87T1, T2610T3, T4713N0.26N078N1, N2 , N3615Ly0.68ly069ly1, ly2, ly3714v0.19v089v1, v2, v3514Stage0.501,27153,4680.50Table 2. der Verband der HOTAIR Ausdruck mit klinisch-pathologischen Eigenschaften in intestinalen Typ von Magenkrebs.
CSV CSV Download | HOTAIR low
HOTAIR hoch
P
Wert
Age59.250 ± 10.7566.35 ± 10.160.07Gender0.71male812female48T0.87T1, T212T3, T41118N0.043*N086N1,N2,N3414ly0.40ly067ly1,ly2,ly3613v0.0083*v0119v1,v2,v3111Stage0.311,2783,4512Table 3. Der Verband der HOTAIR Ausdruck mit klinisch-pathologischen Eigenschaften in diffusen Art von Magenkrebs.
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Generation von HOTAIR Up- und Down-regulierten Zellen und Korrelation mit der Lebensfähigkeit der Zellen

Zur Beurteilung der funktionelle Rolle von HOTAIR in der Entwicklung von Magenkrebs, haben wir einen MKN74 Zellen (MKN-HOTAIR) und stabil shHOTAIR exprimieren KATO III-Zellen (KATO-shHOTAIR) stabil HOTAIR Ausdruck zu bringen. qRT-PCR-Analyse ergab, dass MKN-HOTAIR Zellen ein Niveau von HOTAIR ausgedrückt 10 etwa, dass der EV falten ausdrückt (MKN-EV) oder die elterliche MKN74 Zellen und dass die Expression dieses Moleküls wurde von 30 bis 70% in KATO-shHOTAIR Zellen reduziert im Vergleich zu EV transduziert (KATO-EV) oder die elterliche KATO III (KATO-EV) Zellen (3A). Die Ergebnisse des MTT-Tests zeigten, dass weder die Hochregulierung noch Herunterregulierung der HOTAIR Magenkrebs-Zellproliferation (Abbildung S1) betroffen.

Soft-Agar-Koloniebildungstest

Um die Funktionen aufzuklären von HOTAIR in der Verankerung-unabhängiges Wachstum von Magenkrebszellen verwendeten wir einen Soft-Agar-Assay. MKN-HOTAIR Zellen, die eine größere Anzahl von Kolonien als MKN-EV Zellen gebildet ( P
= 0,009, 4A). In Übereinstimmung mit diesem Befund zeigte KATO-Zellen shHOTAIR signifikant weniger Kolonien als KATO-EV-Zellen (4B). Darüber hinaus bildeten die Magenkrebszellen mit ähnlichen HOTAIR Expressionsniveau (MKN-HOTAIR und shHOTAIR-3, 3B) eine ähnliche Anzahl von Kolonien, was darauf hinweist, dass verankerungsunabhängiges Wachstum von Magenkrebszellen wurde in einer HOTAIR abhängig geregelt.

HOTAIR Ausdruck und Magen Metastasierung von Krebszellen und Peritonealdialyse Verbreitung

Da HOTAIR verstärkt die Verankerung-unabhängige, aber nicht adhärenten Wachstum von Magenkrebszellen, wir nahmen an, dass HOTAIR zu Fernmetastasen beitragen könnten und /oder Peritonealdialyse Verbreitung statt durch direkte Invasion in benachbarte Organe. Um dieses Problem zu beheben beschäftigten wir Schwanzvene Assay und Peritonealdialyse Injektion von Zellen zu untersuchen, ob HOTAIR Ausdruck Blut -borne Metastasierung und Peritonealdialyse Verbreitung fördert, beziehungsweise. Wie erwartet, MKN-HOTAIR Zellen zeigten häufig Lebermetastasen ( P
= 0,01) im Vergleich zu MKN-EV-Zellen. Darüber hinaus wurden die Zahlen und Größen der metastatischen Lebertumoren signifikant größer mit MKN-HOTAIR Zellen als mit MKN-EV-Zellen ( P
= 0,03 und P
= 0,019 bzw. Zahlen 5A und B). Interessanterweise zeigte eine Maus injiziert MKN-HOTAIR Metastasen in der Niere und Nebenniere zusätzlich zu der Leber, während sie mit MKN-EV-Zellen erst in der Leber gebildet metastatischen Tumoren. Konsequent wurde Peritonealdialyse Verbreitung deutlich reduziert (1/5, P
= 0,009), wenn HOTAIR in KATO III-Zellen inaktiviert wurde, während alle Peritonealdialyse Verbreitung gebildet Kontrollzellen (5/5) (6A und B). Die metastasierten Tumoren wurden histologisch bestätigt und sie zeigten starke positive Färbung für den menschlichen Cytokeratin (5C und 6C).

Diskussion

In dieser Studie wurde die Expression von HOTAIR bei Magenkrebs untersucht und untersuchen ihre Korrelation mit den klinisch-pathologischen Eigenschaften einschließlich Patienten Prognose. Unsere Ergebnisse zeigten deutlich verstärkte Expression von HOTAIR in Krebsgewebe im Vergleich zu nicht-krebsartigen Gewebe des Magens und dass die starke Expression dieses Moleküls mit Lymphknotenmetastasen venöse Invasion und schlechte Überleben im diffusen Art von Magenkrebs in Verbindung gebracht wurde. Diese Befunde sind konsistent mit der aktuellen Studie zeigen, dass die Hochregulierung von HOTAIR wird in Magenkrebs im Vergleich zu normalen Geweben und ist mit dem Tumorstadium und Lymphknotenmetastasen korreliert [17]. Darüber hinaus ist die Verstärkung der verankerungsunabhängigen Zellwachstum Magenkrebszellen HOTAIR exprimierenden zeigten in vitro Karten und Metastasen in der Leber in vivo
während verminderte Expression HOTAIR in Zellen Magenkrebs ergab verankerungsunabhängiges Wachstum und Peritonealdialyse Verbreitung verringert, was darauf hindeutet, dass HOTAIR eine zentrale Rolle bei Magenkrebs Progression spielt.

höhere Expression von HOTAIR wurde in Krebszellen als in den entsprechenden nicht-Tumorzellen in verschiedenen Krebsarten, einschließlich Brust-, Dickdarm-, Leber, Bauchspeicheldrüse und Nasen-Rachen-Krebs erkannt [9-11,18-20]. In dieser Krebsarten, mit Metastasen und /oder schlechte Prognose HOTAIR wurde auch in Verbindung gebracht werden gezeigt. Darüber hinaus wurde hohe HOTAIR Ausdruck mit kurzen krankheitsfreie Überleben bei Lungenkrebs korreliert [12]. Daher sind unsere vorliegenden Ergebnisse stimmen mit früheren Studien, die zeigen, dass die Expression HOTAIR in der verbesserten Aggressivität von verschiedenen Typen von Krebszellen beteiligt ist. Auf der anderen Seite konnten wir keine negativen prognostischen Effekt von HOTAIR im Darm Art von Magenkrebs zu finden, obwohl die Hoch HOTAIR-Gruppe im Vergleich insgesamt kürzere Überleben zu zeigen tendenziell die Low-HOTAIR Gruppe. Dies könnte aufgrund der geringen Anzahl der Patienten in der aktuellen Studie, da erzwungene Expression von HOTAIR in einer Darm-Magenkrebs-Zelllinie (MKN74), um den aggressiven Phänotyp gewonnen In-vitro-
und in vivo
. Weitere Untersuchungen mit einer großen Anzahl von Proben neben der experimentellen Studie andere Darm-Magen-Krebs-Zelllinien unter Verwendung erforderlich wäre, um dieses Problem zu beheben.

In der aktuellen Studie wurde kein Zusammenhang zwischen HOTAIR Ausdruck und das Zellwachstum gefunden in Magenkrebs. In Brust-, Darm- und Leberkrebs hat die Beteiligung von HOTAIR beim Zellwachstum nicht nachgewiesen worden [9,10,18], während HOTAIR gefördert und Reduzierung der Zellproliferation bei Bauchspeicheldrüsenkrebs [11] und Lungenkrebs [12] auf. Ferner wurde kein signifikanter Unterschied in subkutane Tumorwachstum in Mäusen NOG zwischen HOTAIR-exprimierenden und Kontrollzellen in der aktuellen Studie (Daten nicht gezeigt wurden). Basierend auf diesen Ergebnissen ist es wahrscheinlich, dass die Verbindung zwischen HOTAIR Expression und Zellproliferation von der Art von Krebs abhängt. Im Gegensatz dazu wurde das verankerungsunabhängige Wachstum von Magenkrebszellen in einem HOTAIR abhängigen Weise deutlich verbessert. Darüber hinaus verursacht HOTAIR Expression mehr Metastasen in der Leber und anderen Organen, und ein Defekt HOTAIR die peritoneale Verbreitung von Magenkarzinomzellen unterdrückt. Diese Beobachtungen, zusammen mit der Tatsache, dass HOTAIR Expression zur Metastasierung in verschiedenen Karzinomen trägt [9-12,18], legen nahe, dass HOTAIR in dem metastatischen Prozeß hauptsächlich beteiligt ist und nicht in das Wachstum des Primärtumors.

Abschließend verbesserte HOTAIR Ausdruck im diffusen Art von Magenkrebs wurde mit dem Auftreten von venösen Invasion und einer schlechten Prognose assoziiert unabhängig von T-Faktor und gezwungen, die Expression von HOTAIR in Magenkrebszellen gefördert Verankerung-unabhängige Zellwachstum in-vitro-
und Metastasen der Leber in vivo
. Diese Ergebnisse zeigen, dass HOTAIR wahrscheinlich ist, in der Entwicklung von Magenkrebs beteiligt zu sein und kann auch ein therapeutisches Ziel bei der Behandlung von Magenkrebs.

Grundinformationen
Abbildung S1.
Die Vereinigung der Zellproliferation mit HOTAIR Ausdruck. Die Ergebnisse des MTT-Assay nach 72 Stunden bewertet wurden bei 24 Stunden, dass normalisiert. Keine Beziehung zwischen HOTAIR Ausdruck und Magenkrebs-Zellproliferation gefunden
doi:. 10.1371 /journal.pone.0077070.s001
(TIF)

Acknowledgments

Wir danken Professor Kitamura (The University of Tokyo, Tokyo, Japan) zur Bereitstellung von Platin-A-Zellen.

• PLoS ONE: Natural History von bösartigen Knochenkrankheit bei Magenkrebs: Finale Ergebnisse einer multizentrischen Knochenmetastasierung Umfrage
• PLoS ONE: Aktivierung von STAT3 in menschlichen Magenkrebszellen über Interleukin (IL) -6-Typ Cytokine Signaling korreliert mit der klinischen Implikationen