PLoS ONE: Noninvasive Visualisatie van MicroRNA-16 in de chemoresistance van maagkanker met een dual Reporter Gene Imaging System

Samenvatting

MicroRNAs (miRNAs) zijn geïmpliceerd een centrale rol bij de ontwikkeling van resistentie spelen in diverse maligniteiten. Er werden echter veel studies uitgevoerd aan de In vitro
niveau en kon de In vivo
informatie over de functies van miRNAs in het verzet tegen kanker drug niet te bieden. Hier hebben we introduceerde een dual reportergen beeldvorming systeem voor het niet-invasief bewaken van de kinetische expressie van miRNA-16 tijdens chemoresistance bij maagkanker beide In vitro Kopen en In vivo
. Human natriumjodide symporter (NIS) en vuurvlieg luciferase (Fluc) genen werden gekoppeld aan hNIS /Fluc dubbele fusie reporter-gen te vormen en vervolgens het genereren van menselijke maagkanker cellijn NF-3xmir16 en de multidrug resistance cellijn NF-3xmir16 /videorecorder. RaJ opname en Fluc luminescentie signalen In vitro
goed gecorreleerd met levensvatbare cel aantallen. De luciferase activiteiten en RaJ opname in NF-3xmir16 cellen werden opmerkelijk onderdrukt door exogene of endogene miRNA-16. De NF-3xmir16 /VCR cellen vertoonden een significante toename van ^{131I opname en luminescentie-intensiteit in vergelijking met NF-3xmir16 cellen. De radioactiviteit van In vivo
99mTc-pertechnetaat beeldvorming en de intensiteit van de bioluminescentie beeldvorming werden ook toegenomen in NF-3xmir16 /VCR in vergelijking met die in NF-3xmir16 tumor xenotransplantaten. Bovendien, het gebruik van dit reporter-gen systeem, vonden we dat etoposide (VP-16) en 5-fluorouracil (5-FU) geactiveerd miRNA-16 expressie In vitro Kopen en In vivo
, en de opwaartse regulatie van miRNA-16 is p38MAPK afhankelijk maar NF-KB onafhankelijk. Deze dubbele beeldvorming reportergen kan worden bediend als een nieuw instrument voor In vivo beeldvorming van
miRNA bij de chemoresistance kanker, evenals voor vroege detectie en diagnose in de kliniek}

Citation:. Wang F, Song X, Li X, Xin J, Wang S, Yang w, et al. (2013) Niet-invasieve Visualisatie van MicroRNA-16 in de chemoresistance van maagkanker met een dual Reporter Gene Imaging System. PLoS ONE 8 (4): e61792. doi: 10.1371 /journal.pone.0061792

Editor: Javier S. Castresana, Universiteit van Navarra, Spanje

Ontvangen: 21 november 2012; Geaccepteerd: 13 maart 2013; Gepubliceerd: 17 april 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door het Programma van de Nationale Basic Research and Development Program van China (973) onder Grant No. 2012CB518101, 2011CB707702, de National Natural Science Foundation of China onder Grant nr. 81090272, 81090274, 81227901, Innovation Team Development Grant door China Department Onderwijs (2010CXTD01), 863 Program van China (2012AA02A603) en de National Key Technology Support Program onder Grant No. 2012BAI23B06. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:. Co-auteur Xiaoyuan Chen dient als een editor voor dit tijdschrift. Dit betekent niet naleving van de auteurs te veranderen om alle PLoS ONE beleid op het delen van gegevens en materialen.

Introductie

Maagkanker blijft de eerste belangrijkste oorzaak van kanker overlijden in China en de vierde meest voorkomende maligniteit wereldwijd, ondanks een dramatische daling van de mortaliteit en morbiditeit in de afgelopen drie decennia [1]. Chemotherapie is op grote schaal gebruikt om zowel reseceerbaar en gevorderde maagkanker te behandelen, wat leidt tot verbeteringen in de totale overleving, alsmede de kwaliteit van leven voor patiënten [2], [3]. Echter, langdurige chemotherapie vaak niet alle tumorcellen door intrinsieke of verkregen multidrug resistentie (MDR), die de primaire oorzaak van tumorherval [4] elimineren. Op dit moment is de MDR beschouwd als een multifactoriële verschijnsel waarbij verscheidene belangrijke mechanismen, waaronder een verhoogd metabolisme van geneesmiddelen, verminderde opname van in water oplosbare geneesmiddelen, veranderd targets, verminderde intracellulaire geneesmiddelconcentratie door efflux pompen, veranderde celcyclus en geïnduceerde noodsituaties respons genen apoptoseroutes aantasten, etc
[5]. Hoewel de MDR mechanismen zijn uitvoerig onderzocht, de belangrijkste determinanten van dit fenomeen blijven grotendeels onduidelijk.

MicroRNAs (miRNAs) zijn een nieuwe klasse van endogene kleine niet-coderende RNA's (19-23 nucleotiden) die negatief reguleren gen uitingen op post-transcriptioneel niveau door perfecte of imperfecte baseparing met de 3 'onvertaalde gebied (UTR) van doelwit mRNA en daardoor induceren mRNAs afbraak of translatierepressie [6]. Op dit moment zijn de opkomende studies het bestaan ​​en het belang van miRNAs in de evolutie van anti-drug resistentie en miRNAs expressie profilering voorgesteld kan worden gecorreleerd met de ontwikkeling van resistentie tegen geneesmiddelen [7] - [10], wat aangeeft dat de miRNAs gemedieerde vorm van resistentie tegen geneesmiddelen voegt een ander mechanisme van de MDR. In onze vorige studie, werd gemeld dat twee miRNAs, miRNA-15b en miRNA-16, werden differentieel tot expressie in een multiresistente menselijke maagkanker cellijn SGC7901 /videorecorder en haar ouderlijke cellijn SGC7901 [11]. Het was echter alleen uitgevoerd op de In vitro
niveau en kon niet overeen met de In vivo
informatie over de functies van miRNAs in het verzet tegen kanker drug.

Recente ontwikkelingen moleculaire beeldvormingstechnieken kan de niet-invasieve visualisatie van normale en abnormale cellulaire processen in levende patiënten op moleculair niveau in plaats van op het anatomische niveau [12]. Meerdere invasieve strategieën, zoals het gebruik van een fluorescerend eiwit, luciferase reportergen nucleoline aptameer of fluorescerende moleculaire beacon geconjugeerd nanodeeltjes, zijn ontwikkeld om de expressiepatronen van verschillende miRNAs tijdens carcinogenese, neurogenese of myogenesis in vitro Kopen en bewaken in vivo
[13] - [16]. De huidige studie was om een ​​niet-invasieve methode voor het monitoren van de invoering miRNA-16 in de chemoresistance van maagkanker door middel van een dubbele beeldvorming reportergen-systeem waarin de menselijke natriumjodide symporter (NIS) en vuurvlieg luciferase (Fluc) genen werden gekoppeld aan een fusie gen voor bioluminescentie beeldvorming en ^{99mTc-pertechnetaat gammacamera imaging in vivo
.}

Materialen en methoden

Dieren

Specifieke pathogeen-vrij 8-week -old vrouwelijke BALB /c naakt muizen werden verkregen uit de Shanghai Animal Center in China en getogen in de Vierde Militaire Medische Universiteit dier center, China. Alle proefdieren werden gehuisvest in specifieke pathogeen-vrije omstandigheden. Het dier protocollen die gebruikt worden in deze studie werden goedgekeurd door de Vierde Militaire Medische Universiteit Ethische Review Board. Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Vierde Militaire Medische Universiteit Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren opgesteld door de National Society for Medical Research.

reagentia en antilichamen

Mouse monoklonaal antilichaam tegen hNIS (ab17795) werd gekocht van Abcam. Konijn polyklonaal antilichaam specifiek voor Bcl-2 werd verkregen van Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Bay11-7082 (NF-KB-remmer) en SB203580 (p38 MAPK remmer) werden verkregen uit Beyotime Instituut voor Biotechnologie (Shanghai, China). De antikankergeneesmiddelen zoals vincristine (VCR), etoposide (VP-16), mitomycine C (MMC), cisplatina (CDDP), 5-fluorouracil (5-FU) en adriamycine (ADR) werden gekocht bij Wolsen Biotechnology (Xi'an, China). De GV260-Fluc-puro lentivirus plasmide werd verkregen uit Shanghai GeneChem Company (Shanghai, China). Alle celkweek media en serum werden gekocht bij Gibco (Grand Island, NY).

Dual reportergen plasmideconstruct

De coderende sequentie van NIS-gen werd geamplificeerd met PCR uit een plasmide vriendelijk verschaft door Dr. Yang Weidong (Vierde Militaire Medische Universiteit, China) met de volgende primers:

hNIS-Fw: 5'-CGGGATCCCGCCACCATGGAGGCCGTGGAGACC-3 '

hNIS-Rev: 5'-CGGGTACCGGTACGAGGTTTGTCTCCTGCTGGTC-3 '

Voor de constructie van een dubbele expressievector, het cDNA van hNIS gen ingevoegd in de
BamH I en Age
I restrictie-enzymplaatsen van een lentivirale vector GV260 -Fluc-puro (Shanghai GeneChem, China) dat een Fluc gen codeert onder de controle van de ubiquitine promoter. De resulterende dual expressie construct GV260-hNIS /Fluc werd verder gebruikt om GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 plasmide te genereren. Drie exemplaren van complementaire sequenties tegen miRNA-16 (3xmir16) werden ingevoegd na het stopcodon van de hNIS /Fluc fusiegen naar GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 (Figuur 1A) te genereren. Een scrambled nucleotidesequentie van gelijke lengte 3xmir16 werd ook opgenomen in het 3'UTR van hNIS /Fluc fusiegen met een controle construct te verkrijgen (GV260-hNIS /Fluc-scramble. De 3xmir16 sequentie of scramble sequentie werden verkregen door het gloeien van de volgende oligonucleotiden :

3xmir16-Fw: 5'-CGCCAATATTTACGTGCTGCTACGCCAATATTTACGTGCTG-CTACGCCAATATTTACGTGCTGCTA-3 '

3xmir16-Rev: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCGTAGCAGCACGTAAATAT-TGGCGTAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3'

Scramble-Fw: 5 '- TCGTGGCGTCATTTCTTCAGAATCCGTCCTCCCAAGTACT-CAGTGTGCTAATGTCTATCGATACAA-3'

Scramble-Rev: 5'-TTGTATCGATAGACATTAGCACACTGAGTACTTGGGAGG-ACGGATTCTGAAGAAATGACGCCACGA

maagkanker celcultuur en stabiele cellijn generatie

Human maagkanker cellijn SGC7901 en de multidrug-resistente variant SGC7901 /VCR (vastgesteld en gehandhaafd laboratoriumwaarden zoals eerder beschreven [11]) werden gekweekt in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum en 100 eenheden penicilline en 100 ug /ml streptomycine (Invitrogen ). Om de MDR-fenotype, vincristine (met een uiteindelijke concentratie van 1 ug /ml) te houden werd aan het kweekmedium voor SGC7901 /VCR cellen toegevoegd. Om stabiele cellijn, lentivirus vector GV260-hNIS /Fluc of GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 werd voor het eerst gecotransfecteerd in 293T cellen met het verpakken van plasmiden ( gag, pol, VSV-G-
) te genereren. Groeimedium werd gewijzigd 6 uur na transfectie en lentivirus supernatant werd 48 uur na transfectie geoogst. Geoogste supernatanten werden gecentrifugeerd bij 4000 g gedurende 10 min celresten pelleteren. Geconcentreerd virus werd getitreerd op 293T-cellen. SGC7901 cellen en SGC7901 /VCR-cellen werden getransduceerd met GV260-hNIS /Fluc en GV260-hNIS /Fluc-3xmir16 virus respectievelijk een veelvoud van infectie (MOI) van 10. Dan is de cellen werden gescreend met puromycine voor 3 weken en cell kolonies waren verzameld om uitgebreid voor de volgende stap experimenten

RNA-oligo's en transfectie

de miRNA-16 en negatieve controle (NC) RNA-oligo's werden gesynthetiseerd (Shanghai GenePharma, China) met behulp van de volgende sequenties.:

miRNA-16 sense: 5'-UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG-3 '

miRNA-16 anti-sense: 5'-CGCCAAUAUUUACGU-GCUGCUA-3'

NC sense: 5 '-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3'

NC anti-sense: 5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3 '

Voor transfectie SGCC7901 cellen werden gezaaid op 1 × 10 ^{5 cellen per putje in een 24-well plaat en kweken gedurende 24 uur. Transfectie werd uitgevoerd met Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen) volgens het protocol van de fabrikant. Alle transfectie werden in drievoud uitgevoerd.}

Kwantitatieve real time PCR (qRT-PCR) -analyse

Totaal RNA werd geïsoleerd uit de gekweekte cellen met behulp van Trizol (Invitrogen). RT werd uitgevoerd met PrimerScript RT Regent Kit (TaKaRa, Japan) en qPCR werd uitgevoerd met Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) en ABI StepOne Plus real-time PCR-systeem (Applied Biosystems) volgens het protocol van de fabrikant . PCR-producten werden geanalyseerd op 3% agarose gels. De relatieve hoeveelheid miRNA-16 werd genormaliseerd naar U6 snRNA. En de relatieve hoeveelheid Fluc werd genormaliseerd op GAPDH gen. De veelvoudverandering voor miRNA-16 of Fluc gen uit experimentgroep opzichte van de controlegroep werd berekend met de 2 ^{-ΔΔCt werkwijze waarbij ΔΔCt = ACt experiment - ACt controle en ACt = Ct miRNA - Ct U6 of ACt = Ct Fluc - Ct GAPDH. PCR werd uitgevoerd in drievoud. De primers gebruikt voor stam-loop RT-PCR voor miR-16 zijn als volgt weergegeven:}

U6 Fw: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 '

U6 Rev: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3 '

miR-16 RT 5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGG-ATACGACCGCCAAT-3'

miR-16 Fw: 5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3 '

miR-16 Rev: 5 '-TGCGTGTCGTGGAGTC-3'

Fluc-Fw: 5'-GGTCCTATGATTATGTCCGGTTATG-3 '

Fluc-Rev: 5'-ATGTAGCCATCCATCCTTGTCAAT-3'

GAPDH-Fw: 5'-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3 '

GAPDH-Rev: 5'-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3'

Western blotanalyse

SGC7901 cellen werden driemaal gewassen met PBS en vervolgens gelyseerd in koude lysisbuffer (20 mM NaCl, 200 mM Tris-HCl [pH 7,4], 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride, 1% Triton X-100 en 1% aprotinine) gedurende 30 min op ijs. Cellysaten werden vervolgens gecentrifugeerd bij 12.000 rpm gedurende 15 min bij 4 ° C. Het supernatant werd verzameld en gelijke hoeveelheden eiwit werden gescheiden door 8% SDS-PAGE en overgebracht naar nitrocellulose membranen. De membranen werden geïncubeerd in blokkeeroplossing die 5% BSA gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en vervolgens aan immunoblotting met antilichamen aangegeven. Immunoreactieve banden werden zichtbaar gemaakt onder toepassing van een versterkte chemiluminescentie (Amersham Pharmacia Corp., Piscataway, NJ).

MTT assay

De groei van NF-lege bepalen NF-3xmir16 en NF-3xmir16 /VCR cellen, deze drie typen cellen werden geënt in 96-well platen met dezelfde nummers (5000 cellen) per putje. Op verschillende tijdstippen (24, 48, 72, 96 uur), 25 pl 5,0 mg /ml steriel gefiltreerd 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromide (MTT; Sigma) werd aan elk putje toegevoegd. De ongereageerde kleurstof werd na 4 uur incubatie, en de onoplosbare formazan-kristallen werden opgelost in 100 gl dimethylsulfoxide (DMSO). De absorptie bij 570 nm (referentie golflengte 630 nm) werd gemeten met een Synergy II multimode microplaatlezer (Biotech Instruments, VT).

Radioactieve jodide opname assay

De relatie tussen jodide identificeren opname en het aantal cellen, een verdunningsreeks van cellen werden geënt in 24-wells platen. Na 12 uur incubatie werd het ^{131I opname niveau onderzocht. Het jodide opname werd bepaald door het incuberen van de cellen met 500 pl Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) die 0,5% runderserumalbumine bij 37 kBq van dragervrije Na 131I en 10 mM NaI gedurende 30 min. Na incubatie werden de cellen tweemaal zo snel mogelijk gewassen met 1 ml ijskoude HBSS buffer. De cellen werden losgemaakt met 200 pi trypsine, en de radioactiviteit werd gemeten met een γ-counter (Perkin-Elmer). De functionele expressie van NIS in reportergen te evalueren, werden NF-3xmir16 cellen geënt in 1 x 10 5 cellen per putje in een 24-wells plaat de dag voor transfectie, dan miRNA-16 en NC oligo getransfecteerd . 24 h later werden de jodide opname gemeten zoals hierboven beschreven.}

In vitro
bioluminescentie assay

De relatie tussen luminescentiesignalen en celaantallen identificeren, een verdunningsreeks cellen werden geënt in 24-wells platen. Na 12 uur incubatie, werd elk putje gewassen met fosfaat beffered zoutoplossing (PBS). Dan D-Luciferine (Xenogen) bij een concentratie van 0,5 mmol /l werd onmiddellijk vóór assay toegevoegd. Bioluminescentie werd gemeten met een IVIS 100 Imaging System (Xenogen) en geanalyseerd met behulp van de Living Image software versie 2.50 (Xenogen). De functionele expressie van Fluc in reportergen te evalueren, werden NF-3xmir16 cellen geënt in 1 x 10 ^{5 cellen per putje in een 24-wells plaat de dag voor transfectie, dan miRNA-16 en NC oligo getransfecteerd . 24 uur later werd de bioluminescentie assay zoals hierboven beschreven gemeten.}

bioluminescente en 99mTc-pertechnetaat beeldvorming in naakt muizen

Gelijke aantallen (5 x 10 ^{6 cellen) van NF-leeg en NF-3xmir16 of NF-3xmir16 /VCR en NF-3xmir16 cellen waren xenotransplantatie subcutaan in de linker en rechter achterste flank van elke naakt muis zoals aangegeven in de resultaten. Bioluminescent beeldvorming werd een dag na cel injectie gekregen. Alle muizen werden verdoofd met 2,5% isofluraan in zuurstof gas met een stroomsnelheid van 1,5 l /min. Een waterige oplossing van D-luciferine (150 mg /kg lichaamsgewicht) geïnjecteerd percutaan 10 minuten voor de beeldvorming. Het hele lichaam beelden voor Fluc signalen werden verworven gedurende 2 minuten en Living Image software (Xenogen) liep aan bioluminescentie beelden te verkrijgen. Een ROI werd met de hand geselecteerd over de intensiteit van het signaal. Bioluminescentie signalen worden uitgedrukt als fotonen per seconde per kubieke centimeter per steradiaal (p /sec /cm 2 /sr) binnen een ROI.}

Voor nucleaire beeldvorming, de tumor-dragende muizen werden intraperitoneaal geïnjecteerd met 18,5 MBq van ^{99mTc-pertechnetaat in 2 weken na cel injectie. 30 min na injectie werd het dier in een gespreide liggende positie op het bed van de SPECT scanner (Symbia T2, Siemens). Anesthesie werd uitgevoerd met 1% -2% isofluraan in 100% O _{2 tijdens injectie en beeldvorming. Alle beelden werden gereconstrueerd met een 2-dimensionale besteld-subsets verwachting maximaal algoritme. Activiteit werd gekwantificeerd door het bekijken van de gebieden van belang (ROI) in de tumoren en het gebied van de ROI was constant voor alle nucleaire en optische beelden bewaard. Na bioluminescente en 99mTc-pertechnetaat beeldvorming werden de tumoren verzameld en gewogen.}}

Statistische analyse

De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Gegevens die vergelijkingen tussen twee groepen werden beoordeeld met behulp van t-test van de student. Vergelijkingen tussen meer dan twee groepen werden bepaald middels variantieanalyse (ANOVA) met het geschikte posthoc test. P-waarden. ≪ 0,05 werden beschouwd als statistisch significant

Resultaten

Oprichting van maagkanker cellijnen die stabiel tot expressie hNIS en Fluc genen

Om een ​​fusie reportergen (genereren GV260- hNIS /Fluc, aangeduid NF-leeg), de hNIS cDNA werd gekloneerd in een lentivirus vector (GV260-Fluc-puro) codeert een Fluc gen een fusie-eiwit, dat onder de controle van ubiquitine promoter genereren. Dan drie exemplaren van complementaire sequenties tegen miRNA-16 (3xmir16) na het stopcodon van de hNIS /Fluc fusiegen naar een ander construct te genereren werden geplaatst (GV260-hNIS /Fluc-3xmir16, aangeduid NF-3xmir16) (Figuur 1A). Een scrambled nucleotidesequentie van gelijke lengte 3xmir16 werd ook opgenomen in het 3'UTR van hNIS /Fluc fusiegen met een controle construct te verkrijgen (GV260-hNIS /Fluc-scramble, aangeduid NF-scramble). In vitro
bioluminescentie beeldvorming bleek dat Fluc genactiviteit van NF-lege cellen was vergelijkbaar met dat van NF-scramble cellen (figuur S1A). Dus kiezen we de NF-lege construct in verdere studie. Twee cellijnen, een MDR menselijke maagkanker cellijn SGC7901 /videorecorder en haar ouderlijke cellijn SGC7901 werden getransduceerd met de lentivirus met het NF-leeg of NF-3xmir16 gen respectievelijk drie stabiele cellijnen NF-leeg /SGC7901, NF vast -3xmir16 /SGC7901 en NF-3xmir16 /SGC7901 /VCR (aangeduid NF-lege, NF-3xmir16 en NF-3xmir16 /VCR). Eerst uitgevoerd we MTT test om de groeicijfers van deze drie cellijnen (figuur S1B) te meten. Dan perfomed we qPCR assay de geïntegreerde kopieën van reporter constructen te onderzoeken in de drie cellijnen (figuur S1C). In vitro
bioluminescentie imaging (Figuur 1B) en western blotting (Figuur 1C) werden verder uitgevoerd om de succesvolle expressie van Fluc en hNIS genen aan te tonen in deze drie cellijnen.

De lineariteit correlatie van Fluc en hNIS transgene activiteiten met mobiele nummers in vitro

Om te beoordelen de Fluc en hNIS transgene activiteiten in cellen, voerden we in vitro
bioluminescentie beeldvorming en ^{131I radioactief jodium opname assays in een verdunningsreeks van de NF-3xmir16 cellijnen. Zoals getoond in figuur 1D, volgens toename in het aantal cellen, de accumulatie van luminescentie toegenomen. Bioluminescentie signalen werden gevonden om goed te correleren met het aantal cellen (γ 2 = 0,9990) (Figuur 1E). Ondertussen werd 131I opname ook verhoogd met mobiele nummers (Figuur 1F). De RaJ opname werd gezien goed gecorreleerd (γ 2 = 0,9543) met mobiele nummers (figuur 1G). Omdat de Fluc werd gefuseerd met hNIS levert een correlatie tussen bioluminescentie intensiteit en 131I radioactiviteit werd opgemerkt in cellen volgens de lineaire regressieanalyse (γ 2 = 0,9339) (Figuur 1H).}

validatie van miRNA-16 activiteiten via of the reporter-gen systeem

om te testen of NF-3xmir16 reporter vector die miRNA-16 doelsequenties werd onderdrukt door exogeen miRNA-16, onderzochten we de Fluc en hNIS activiteit na de invoering van miRNA-16. In vergelijking met de cellen die met NC oligo's werden de bioluminescentie signaal afgenomen met 35% in de cellen getransfecteerd met miRNA-16 (Figuur 2A en 2B). En ^{131I RaJ opname in miRNA-16 getransfecteerde cellen was ongeveer 70% van die in NC getransfecteerde cellen gekwantificeerd door radioactieve telling (figuur 2C). En Fluc en hNIS activiteit werden afgenomen op een dosis afhankelijke wijze (Figuur S1D-F). Deze gegevens gaven aan dat de NF-3xmir16 reporter construct kan worden gemoduleerd door miRNA-16.}

Detectie van endogene miRNA-16 expressie In vitro Kopen en In vivo

Om de endogene miRNA-16 expressie in de maag kankercellen op te sporen in vitro
, gelijke aantallen (1 x 10 ^{6) van NF-leeg en NF-3xmir16 cellen werden gezaaid en dan de Fluc en hNIS activiteit werden onderzocht. Zoals getoond in figuur 2D en 2E, werd Fluc activiteit gevolg van NF-3xmir16 cellen daalde met ongeveer 50% door endogene miRNA-16 vergeleken met die van NF-lege cellen. En hNIS activiteit van NF-3xmir16 cellen werd verminderd met ongeveer 40% in reactie op endogene miRNA-16 anders dan die van NF-lege cellen (figuur 2F). Het gebrek aan onderdrukking van Fluc of hNIS activiteiten die worden waargenomen in NF-lege cellen is ten aanzien dat er geen miRNA-16 doelplaatsen in NF-lege construct.}

De dubbele beeldvorming reportergen-systeem ingeschakeld in vivo
visualisatie van endogene miRNA-16 expressie in maagkanker cellen. Gelijke aantallen (1 x 10 ^{7) van NF-leeg en NF-3xmir16 cellen werden xenotransplantatie subcutaan in de linker en rechter achterste flanken van elke naakt muizen (n = 6) en vervolgens bioluminescente beeldvorming en 99mTc-pertechnetaat gamma camera imaging werden verworven. Zoals getoond in figuur 2G, luminescentie-intensiteit van geïmplanteerde NF-3xmir16 cellen waren ongeveer 55% lager dan die van NF-lege cellen, hetzelfde geldt voor het verschil in luciferase activiteiten gemeten in vitro
(figuur 2D en 2E). Na de intraperitoneale injectie van 99mTc-pertechnetaat op 18,5 MBq, werd gamma camera imaging uitgevoerd. In tegenstelling tot de NF-lege tumoren, die prominent opname getoonde 99mTc-pertechnetaat, NF-3xmir16 tumoren toonde verwaarloosbare opname (figuur 2H), met vermelding van endogene miRNA-16 verminderde de hNIS expressie. Fysiologische opname werd ook waargenomen op de plaatsen van de schildklier, maag en blaas, waarbij hNIS normaal tot expressie wordt gebracht. Regio's van belang (ROI) analyse bleek dat hNIS activiteit aanzienlijk NF-3xmir16 xenotransplantaten gedaald in vergelijking met die in NF-lege xenotransplantaten (figuur 2H). Na beeldvorming, we verzameld en gewogen de NF-leeg en NF-3xmir16 tumoren (figuur S1G). De resultaten toonden aan dat ze hadden dezelfde gewichten, gaf aan dat de verschillen in signaalintensiteit zijn inderdaad te wijten aan endogene miRNA-16 functie, maar nummers niet cel.}

Visualisatie van meningsuiting verandering van de miRNA-16 in MDR maagkanker cellen in vitro Kopen en in vivo

de expressie verandering van de miRNA-16 in resistente maagkanker cellen werd ontdekt via of the Fluc en hNIS activiteit door bioluminescentie beeldvorming en ^{131I radioactief jodium opname assays. Zowel Fluc activiteit (figuur 3A en 3B) en hNIS activiteit (figuur 3C) met ongeveer 1,5 maal in NF-3xmir16 /VCR-cellen in vergelijking met die in NF-3xmir16 cellen die suggereerde dat miRNA-16 was downgereguleerd in NF-3xmir16 /VCR cellen. De resultaten verkregen door reportergen-systeem te verifiëren, kwantitatieve RT-PCR (Q-PCR) werd uitgevoerd met analyse beide cellijnen de differentiële expressie van miRNA-16. Overeenkomstig het reportergen systeemgegevens, Q-PCR vertoonden verlaagde miRNA-16 niveaus in NF-3xmir16 /VCR opzichte van zijn tegenhanger NF-3xmir16 cellen (Figuur 3D).}

Voor invasieve kwantitatieve controle van miRNA- 16 differentiële expressie in MDR maagkanker cellen in vivo
, bioluminescente beeldvorming en ^{99mTc-pertechnetaat gammacamera imaging werden uitgevoerd. De bioluminescent imaging aangetoond dat luminescentiesignalen waren ongeveer 1,7-voudige toename van de NF-3xmir16 /VCR xenotransplantaten versus NF-3xmir16 xenotransplantaten (Figuur 3E), overeenkomstig de toename van luciferaseactiviteit gemeten
in vitro (Figuur 3A en 3B). De injectie van 99mTc-pertechnetaat en de overname van gammacamera imaging aangegeven dat een significant hogere ophoping van 99mTc-pertechnetaat werd waargenomen in NF-3xmir16 /VCR xenotransplantaten dan die NF-3xmir16 xenotransplantaten. Fysiologische 99mTc-pertechnetaat ophopingen werden ook waargenomen in de schildklier, blaas en maag (figuur 3F). En de NF-3xmir16 en NF-3xmir16 /VCR tumoren hadden dezelfde gewichten (figuur S1H).}

VP-16 en 5-FU opregulatie van miRNA-16 expressie noninvasively afgebeeld door het duale systeem reportergen

om te bepalen of andere geneesmiddelen tegen kanker miRNA-16 expressie profiel kunnen veranderen, vijf klinische geneesmiddelen voor maagkanker werden toegevoegd aan NF-3xmir16 cellen, gevolgd door in vitro
bioluminescentie beeldvorming en ^{131I radioactief jodium opname assays. Uit de resultaten bleek dat de luminescentie-intensiteit (Figuur 4A en 4B) of de cellulaire jodide opname (Figuur 4E) aanzienlijk verlaagd blootstelling aan VP-16, 5-FU en CDDP, maar niet MMC en ADR behandeling vergeleken met de onbehandelde cellen.}

de redenen voor de verminderde signaal waargenomen in VP-16, 5-FU en behandeling CDDP zou kunnen zijn dat de medicijnen geactiveerde endogene miRNA-16 expressie of geremd celgroei zelfs celdood veroorzaakt. Om de laatste mogelijkheid uit te sluiten, werden de vijf drugs toegevoegd aan NF-lege cellen, die geen miRNA-16 doelplaatsen in het construct bevatten. in vitro
bioluminescentie resultaten toonden aan dat VP-16 en 5-FU had geen remmend effect op de luminescentie-intensiteit, terwijl toch de CDDP luminescentiesignaal (figuur 4C en 4D) verminderd, wat aangeeft dat CDDP cellen kunnen remmen groei, maar niet geactiveerd endogene miRNA-16 expressie. Anderzijds, MMC en ADR bleken iets verhoging van de luminescentie-intensiteit in zowel NF-3xmir16 en NF-lege cellen (Figuur 4A-D), die kunnen voortvloeien uit het bevorderen van celproliferatie.

Controleren of miRNA-16 activatie deel in antikanker effecten van VP-16 en 5-FU, Q-PCR uitgevoerd om het miRNA-16 niveau NF-3xmir16 cellen belichting antikanker drugs behandelingen. Dienovereenkomstig werd miRNA-16 expressie significant opgereguleerd na VP-16 of 5-FU behandelingen SGC7901 cellen vergeleken met de onbehandelde controlecellen, terwijl MMC, ADR en CDDP gering effect op miRNA-16 expressie (Figuur 4F) was.

Verhoogde miRNA-16 uitingen van VP-16 en 5-FU zijn betrokken bij p38 MAPK maar NF-kB signaling pathway

Net als de modulatie van eiwit-coderende RNA-genen, transcriptie van genen miRNA lijkt worden gereguleerd door meerdere signaalroutes. Activering van de NF-KB of MAPK signaalwegen een gemeenschappelijke respons na chemotherapeutische middelen [17], [18]. Daarom hebben we de hypothese dat de opregulatie van miRNA-16 een gevolg van de toegenomen NF-KB of MAPK activering na VP-16 of 5-FU behandeling zou kunnen zijn. Om de rol van deze signaalwegen in VP-16 en 5-FU-geïnduceerde transactivatie van miRNA-16 te belichten we eerst gemeten de luminescentie-intensiteit in NF-3xmir16 cellen in reactie op VP-16 en 5-FU in de aanwezigheid of afwezigheid farmacologische remmers NF-kB p38 of MAPK. Behandeling van cellen met een specifieke NF-KB-remmer Bay 11-7082, had geen invloed op de luminescentie signaal vergeleken met geneesmiddel behandelde cellen zonder remmers (figuur S2).

In tegenstelling behandeling met een specifieke p38 MAPK remmer, SB203850, aanzienlijk redde de afname van bioluminescentie (figuur 5A en 5B) of jodide opname (figuur 5C) van VP-16 en 5-FU vergeleken met de behandelde controlecellen. Het miRNA-16 expressieniveau in aanwezigheid van SB203850 bevestigen, real time PCR werd uitgevoerd en de resultaten toonden dat remmende p38 MAPK drastisch onderdrukt VP-16 en 5-FU-geïnduceerde miRNA-16 opregulatie (figuur 5D), hetgeen aangeeft dat de verhoogde miRNA-16 expressie door VP-16 en 5-FU is betrokken bij p38 MAPK-signaalroute.

Onze vorige studie heeft aangetoond dat Bcl-2 eiwit een directe doelgen van miRNA-16 in de ontwikkeling van MDR in SGC7901 maagkanker cellen [11]. Testen of Bcl-2 is betrokken bij het VP-16 en 5-FU stimulatie van miRNA-16 via
p38 MAPK route bepaalden wij Bcl-2 eiwitniveau door Western blotanalyse. Zoals getoond in figuur 5E en 5F, VP-16 en 5-FU significant verminderde de Bcl-2 eiwitniveau met ongeveer 50% vergeleken met onbehandelde controle cellen bij afwezigheid van SB203850. Na behandeling met SB203850 was de daling van Bcl-2 eiwit drastisch verzwakt Dit suggereert dat p38 MAPK activatie in VP-16 en 5-FU-geïnduceerde neerwaartse regulatie van Bcl-2 eiwit.

in vivo
monitoring van verbeterde miRNA-16 expressie door VP-16 en 5-FU

Voor niet-invasieve monitoring van verbeterde miRNA-16-expressie geïnduceerd door VP-16 en 5-FU, NF-leeg en NF -3xmir16 cellen werden geënt op de linker en rechter achterpoot van elke muis (n = 6), respectievelijk. De bioluminescentie signaal van NF-lege interfereren met die van NF-3xmir16 tijdens behandeling met geneesmiddelen, verschillende aantallen voorkomen NF-lege (1 x 10 ^{5 cellen) en NF-3xmir16 (1 x 10 7 cellen) werden geënt. Zoals getoond in figuur 6, was significant verminderd bioluminescentie intensiteit waargenomen in NF-3xmir16 xenotransplantaten na VP-16 of 5-FU behandeling in vergelijking met de nontreatment. Vooral in muizen behandeld met VP-16, de bioluminescentie signaal verminderd met ongeveer 40% in NF-3xmir16 xenotransplantaten dat licht in NF-lege xenotransplantaten versus voorbehandelde beelden (figuur 6A en 6B), hetzelfde geldt voor het verschil in luminescentie-intensiteit veroorzaakte toegenomen door VP-16 in vitro
(Figuur 4A-D).}

• PLoS ONE: MicroRNA 219-2-3p functies als een tumor suppressor bij maagkanker en wordt gereguleerd door DNA Methylation
• PLoS ONE: associatie tussen Glutathion S-transferase T1 Null Genotype en Gastric Cancer Risk: een meta-analyse van 48 Studies