PLoS ONE: High Mannose-bindenden Lektin Antivirale PFL aus Pseudomonas fluorescens Pf0-1 Fördert Zelltod von Magenkrebszellen MKN28 über Wechselwirkungen mit α2-Integrin

Abstrakt

Neuartige Anti-HIV-Lektin-Familie, die eine strikte Bindungsspezifität für hohe Mannose Glykane zeigt hat in niederen Organismen gefunden worden. Die bakterielle Ortholog hat im Genom von identifiziert Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 und das Gen eine putative Lectin kodierende wurde kloniert, exprimiert in Escherichia coli Karten und gereinigt durch einen Schritt der Gelfiltration. Glycan Array-Screening des rekombinanten Lektin, genannt PFL, hat ergeben, dass PFL erkennt bevorzugt hohe Mannose Glykane mit α1-3 Mann, die stark an der D2-Position ausgesetzt war. Im Gegensatz dazu Maskierung dieser α1-3 Mann mit α1-2 Man dramatisch beeinträchtigt Lektin-Kohlenhydrat-Wechselwirkungen. Die Reduzierung Terminal Disaccharid, GlcNAc-GlcNAc hoher Mannose Glykane war auch wichtig für die PFL-Bindung. PFL zeigte eine starke Virusaktivität Anti-Influenza-Virus durch den Eintritt in die Zellen in Dosen von niedrigen nanomolaren Konzentration hemmen. Bei mikromolaren Konzentration oder höher, zeigte PFL eine Zytotoxizität einhergehende Verlust der Zelladhäsion gegen menschliche Zellen Magenkrebs MKN28. Die Zelloberflächenmolekül, an die PFL gebunden wurde co-präzipitiert mit Biotin-markiertem PFL und als Integrin-α2 durch Peptidmassenfingerabdruck unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie identifiziert. Intriguingly, bei Behandlung mit exogenen PFL, Integrin-α2 auf der Zelloberfläche unterzogen schnelle Internalisierung in das Zytoplasma und akkumuliert perinukleären Region zusammen mit dem gebundenen PFL. Der daraus resultierende Verlust der Zellhaftung würde einen Signalweg auslösen, der anoikis artigen induzierten Zelltod. Diese Ereignisse wurden effektiv durch eine Vorbehandlung von PFL gehemmt mit mannnan, was auf die Beteiligung von hoher Mannose Glykane auf PFL-induzierten Zelltod, der durch PFL-Integrin α2 Wechselwirkungen ausgelöst wurde

Citation:. Sato Y, K Morimoto, Kubo T, Yanagihara K, Seyama T (2012) Hohe Mannose-Bindung Antivirale Lektin PFL von Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 Zelltod von Magenkrebszellen MKN28 über Wechselwirkungen mit α2-Integrin fördert. PLoS ONE 7 (9): e45922. doi: 10.1371 /journal.pone.0045922

Herausgeber: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brasilien

Empfangen: 7. Mai 2012; Akzeptiert: 27. August 2012; Veröffentlicht am: 20. September 2012

Copyright: © Sato et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Forschung unterstützt wurde teilweise durch einen Zuschuss-in-Aid für junge Wissenschaftler (B) von der japanischen Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaft (JSPS) (Förderkennzeichen 24790101). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

High Mannose-bindende Lektine, die spezifische Glykane auf einer Virusoberfläche Ziel sind vielversprechende Potential viral-inaktivierenden Mittel, die für die Prävention und Bekämpfung von Virusinfektionen verwendet werden könnte [1], [2]. Zahlreiche Lectine, die eine hohe Mannose Glykane spezifisch erkennen sind aus verschiedenen Taxonomie einschließlich Bakterien, Algen, Pflanzen und Tiere, und einige davon zeigen anti-HIV-Aktivität gezeigt haben gefunden, [3]. Wir haben vor kurzem festgestellt, eine neue Anti-HIV-Lektin Familie in niederen Organismen wie Bakterien verteilt, Cyanobakterien und Meeresalgen [4]. Sie weisen eine gemeinsame Eigenschaften, wie Sequenz-Multiplikation von hochkonservierten N-terminalen Domäne und exklusiven mannosereichen Oligosaccharid Erkennungen. Einige Lektine in dieser Familie wie Cyanobakterien OAA von Oscillatoria agardhii
[4] und Rotalgen ESA-2 von Eucheuma serra
[5] haben gezeigt, die das Eindringen von HIV in die Wirtszellen zu hemmen mit EC _{50er Jahren des niedrigen nanomolaren Bereich durch direkte Bindung gp120 einzuhüllen. Weiterhin ist eine rote Algen Lektin KAA-2 von Kappaphycus alvarezii
, die ebenfalls zu dieser Familie gehört hemmt Infektion von verschiedenen Influenza-Virusstämme mit EC 50er Jahren des niedrigen nanomolaren Ebenen in einem Stamm-unabhängige Weise durch die Erkennung von mannosereichen Oligosaccharid auf der viralen Hüllglykoprotein Hämagglutinin (HA) [6].}

Neben der potent antivirale Aktivität, ESA-2 zeigt verschiedene biologische Aktivitäten, wie beispielsweise mitogene Aktivität für Maus und menschlichen Lymphozyten und in vitro
Wachstumshemmung von Tumorzellen [7], [8]. Obwohl biologische Eigenschaften dieser Lektinfamilie abzeichnen, von den Eigenschaften von bakteriellen Orthologe Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 und Herpetosiphon aurantiacus
noch geklärt werden bleiben.

In der vorliegenden Studie haben wir die Ortholog Lectingens von P geklont. fluorescens
Pf0-1 und das codierte Protein Lektin (PFL) wurde in Escherichia coli
ausgedrückt. Funktions PFL wurde in hoher Ausbeute erfolgreich gereinigt und hinsichtlich ihrer biologischen Aktivitäten, wie antivirale und Antitumor-Aktivität aus. Wie aus intensiven strukturellen Ähnlichkeit von PFL mit anderen Mitgliedern dieser Lektinfamilie vorhergesagt, zeigte PFL exklusive Spezifität für hohe Mannose-Oligosaccharid und starke antivirale Wirkung gegen Grippe-Viren. Darüber hinaus PFL anoikis ähnliche Zelltod von Magenkrebszelle MKN28 über eine Wechselwirkung mit Zelloberflächen-Integrin-α2 induziert.

Materialien und Methoden

Materialien

Stabkultur von P. fluorescens
Pf0-1 wurde von Dr. Mark W. Silby (University of Massachusetts Dartmouth, USA) großzügig zur Verfügung gestellt. Influenza-Viren und Madin-Darby-Hundenierenzellen (MDCK) wurden großzügig von Dr. T. Sakaguchi (Hiroshima University, Japan) zur Verfügung gestellt: Die Influenza-Viren wurden in der Chorioallantoisflüssigkeit von 10 Tage alten Hühnereiern gezüchtet. MDCK-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und Penicillin-Streptomycin gezüchtet. Eine Magenkrebs-Zelllinie, MKN28 wurde freundlicherweise von Prof. Suzuki (Fukushima Medical University, Fukushima, Japan) zur Verfügung gestellt. Die Zellinie wurde in RPMI-1640-Medium (GIBCO, Grand Island, NY), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS, GIBCO), 100 IU /ml Penicillin G-Natrium und 100 mg /ml Streptomycinsulfat gehalten. Ein weiterer Magenkrebs-Zelllinie, GCIY wurde von RIKEN CELL BANK (Ibaraki, Japan) und gepflegt in der gleichen Art und Weise erworben, wie oben beschrieben. Primäre normalen menschlichen Hepatozyten-Zelle (ACBRI 3716) wurde von DS Pharma Biomedical (Osaka, Japan) und gepflegt in CS-C-Medium-Kit R (DS Pharma Biomedical) erworben.

Hämagglutinationsassay

Hämagglutination Assay wurde unter Verwendung einer 2% (v /v) Suspension von Trypsin-behandelten Kaninchen-Erythrozyten durchgeführt, wie zuvor beschrieben [9]. Kurz gesagt, wurde Kaninchen nativer Erythrozyten-Suspension mit 0,5% Trypsin in Kochsalzlösung gegeben und das Gemisch bei 37 ° C für 60 min inkubiert, behandelt. Nach dem Waschen mit Kochsalzlösung, 2% Trypsin-behandelten Erythrozyten-Suspension wurde in Kochsalzlösung hergestellt. Hämagglutinations-Aktivität wurde als Titer, der Kehrwert der höchsten 2-fache Verdünnung zeigen positive Hämagglutination ausgedrückt.

Gene Klonierung und Expression von Lektin PFL

Genomic DNA von P. fluorescens
Pf0-1 wurde als Matrize für die Gen-Klonierung von PFL Gens verwendet. Zunächst wird ein Oligonucleotid-Primer-Set, 5'-GGCAGGTCTCCCGAAACTTCAAG-3 'und 5'-AGTCGAACGCCTGAACCTGTTGA-3', die mit stromaufwärts und stromabwärts des PFL codierende Region hybridisiert, wurden jeweils verwendet, und die PCR wurde unter Verwendung von Prime STAR-DNA durchgeführt Polymerase (TAKARA). Verwendung des amplifizierten PCR-Fragments als Templat wurde die nachfolgende PCR mit einem Vorwärtsprimer, 5'-CACCATGTCTAAATACGCAGTGGCA-3 ', die zu ATG Startcodon des Gens PFL CACC zusätzliche Sequenz hatte, und eine Reverse-Primer, 5'-TTACTCTATCTGCCCACGGAAG -3 '(TTA; entsprechenden Codon des RFL-Gens zu stoppen). Die amplifizierten Fragmente wurden in pET101 /D-TOPO-Expressionsvektor ligiert. Das rekombinante Plasmid wurde in transformierten Escherichia coli
TOP10-Zellen (Invitrogen). Die erhaltenen rekombinanten Klone wurden bestätigt eine korrekte Konstrukt durch DNA-Sequenzierung ist. Die funktionellen Klone wurden in transformierten Escherichia coli
BL21 Star (DE3) -Zellen für die induzierbare Expression des Gens PFL. IPTG mit einer Endkonzentration von 0,8 mM wurde in die transformierte Kultur hinzugefügt, um den PFL-Expression zu induzieren. Nach 6 h Inkubation bei 37 ° C wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 8000 Upm für 20 min geerntet.

Reinigung von Lektin PFL

Die geernteten Bakterienzellen in 20 mM Phosphatpuffer resuspendiert ( pH 7,0), enthaltend 0,15 M NaCl (PBS) und wurden durch Beschallung aufgebrochen. Nach Zentrifugation für 20 min bei 8000 rpm wurde ein Aliquot des Überstands wurde einer 12-Säule (GE Healthcare), äquilibriert mit PBS Superose. Die Säule wurde bei einer Flussrate von 0,8 mit PBS eluiert ml /min durch einem isokratischen Modus. Das Eluat wurde durch Absorption bei 280 nm überwacht und auf Hämagglutination-Aktivität untersucht, und die aktiven Fraktionen wurden gepoolt.

Molekulargewichtsbestimmung von PFL

Das Molekulargewicht des PFL wurde durch MALDI-TOF bestimmt MS-Analyse mit einem Autoflex-Massenspektrometer (Bruker, Japan) nach der Kalibrierung mit einem Peptidmasse Standard-Kit (Bruker, Japan) unter Verwendung von Sinapinsäure als Matrix.

DNA-Sequenzanalyse

Nucleotid-Sequenzen Verwendung einer Version BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit 3,1 wurden durch das Didesoxy-Kettenabbruchmethode bestimmt (Applied Biosystems). DNA-Sequenzierung wurde unter Verwendung eines ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) durchgeführt.

Glycan Array Analyse

PFL mit Alexa Fluor 488 markiert wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen, Eugene, OR). Glycan Bindungsspezifität von PFL wurde für Funktionelle Glycomics (CFG) durch die bedruckten Glycan-Mikroarrays (Version 5.0) nach dem Standardverfahren von CoreH des Konsortiums bestimmt (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp ). Die durchschnittliche relative Fluoreszenz in Replikaten von sechs wurde von durchschnittlich vier Werte berechnet, nachdem die höchsten und niedrigsten Werte Entfernung mit sehr hohen oder niedrigen Punkte einige der falsche Treffer zu beseitigen. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung des Mittelwerts (SEM) und% CV ist der Variationskoeffizient (SD /Mittelwert) in% berechnet.

Anti-Influenza-Aktivität von PFL

In-vitro-
Anti-Influenza-Aktivität von PFL wurde von der neutralen roten (NR) Farbstoff-Aufnahmetest bestimmt. Verschiedene Konzentrationen von PFL wurden hergestellt mit DMEM, enthaltend 10 &mgr; g /ml Trypsin in einer 96-Well Mikrotiterplatte. Zu jeder Vertiefung wurde das Virus als eine Vielzahl von Infektionen von etwa 0,001 infektiösen Partikeln pro Zelle gegeben. Nach 48 h bei 37 ° C inkubiert, 100 ul NR Farbstoff (150 ug /ml in DMEM) zugegeben und weitere 2 h inkubiert. NR Farbstoff in die Zellen eingebaut wurde durch die Zugabe von 100 ul 1% Essigsäure /50% Ethanol extrahiert. Die Vertiefungen wurden bei 540 nm mit einem Mikroplattenleser gemessen (1420 Multilabel Counter, PerkinElmer, MA, USA) als Faktor der Effekt aus dem Virus zytopathischen überleben.

Immunfluoreszenz-Mikroskopie

Immunfluoreszenzfärbung war geführt, um den Eintrag Hemmung der Influenza-Virus durch PFL sichtbar zu machen. Kurz gesagt, auf Deckglas gezüchtet MDCK-Zellen wurden bei einer Multiplizität der Infektion von etwa 0.001 infektiösen Partikeln pro Zelle, in der Gegenwart oder Abwesenheit von 200 nM PFL in DMEM, enthaltend 10 &mgr; g /ml Trypsin mit A /Udorn /72 infiziert. Nach 24 h nach der Infektion wurden die infizierten Zellen für 5 min mit 80% Aceton fixiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit monoklonalen Maus-anti- HA-Antikörper (HyTest, Turku, Finnland) bei 37 ° C für 1 h inkubiert. Nach Waschen mit PBS wurden die Zellen mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) -konjugierte Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper (anticorps second, Compiegne, Frankreich) bei 37 ° C für 1 h inkubiert. Nach weiteren PBS Waschen wurden die Zellen unter Verwendung von Vectashield mit 4 'montiert, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) und wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus BX51, Olympus, Japan) beobachtet.

ELISA Assay

direkte Wechselwirkung von PFL mit viralen Hüll-Glycoprotein HA wurde unter Verwendung eines enzymgebundenen getestet immnosorbent Assay (ELISA). PFL (5 ug /ml) in Carbonatpuffer (pH 9,6) wurde auf 96-Well-ELISA-Platten (BD Biosciences, Bedford, MA) beschichtet. Die Vertiefungen wurden dreimal mit PBS 0,1% Tween 20 (PBST) und blockiert mit 3% Magermilch bei 37 ° C für 1 h enthält. Nach dem Waschen mit PBST, variierenden Konzentrationen von Influenza-HA-Impfstoff-Präparat (Astellas, Tokyo, Japan) wurden in jede Vertiefung gegeben und bei 37 ° C für 1 h inkubiert. Nachdem mit PBST Waschen wurden die Vertiefungen mit Maus-anti-HA monoklonaler Antikörper (HyTest) bei 37 ° C für 1 h durch Inkubation mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugierten Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper (GE Healthcare, UK inkubiert, gefolgt at) 37 ° C für 1 h. Anschließend 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) -Substrat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) wurde zugegeben. Die Reaktion wurde TMB Stop-Reagenz (Sigma-Aldrich) und die Absorption bei 450 nm gestoppt Verwendung wurde mit einem Mikroplattenleser (1420 Multilabel Counter, PerkinElmer) gemessen.

Tumorzellproliferation durch MTS-Assay

Zellproliferation wurde durch ein herkömmliches MTS Assay CellTiter 96 Zellproliferationsassay unter Verwendung quantifiziert (Promega, Madison, WI). Zellen beimpft auf 96-well Mikrotiterplatten wurden für 72 h mit verschiedenen Konzentrationen von PFL in geeigneten Medium mit 10% FBS inkubiert. Die Zellen wurden dann mit 20 &mgr; l MTS-Reagens für 1 h bei 37 ° C und gemessen mit einem Mikroplatten-Lesegerät (1420 Multilabel Counter, PerkinElmer) bei 490 nm inkubiert. Die Wirkung von Hefe-Mannan auf Zytotoxizität von PFL wurde 72 h durch Inkubation der Zellen mit 5 &mgr; M PFL in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Hefe-Mannan in RPMI 1640 mit 10% FBS bestimmt und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde wie oben beschrieben gemessen.

Isolierung von PFL Bindungsmolekül (e) auf MKN28 Zelle

PFL mit Biotin unter Verwendung von Biotin Labeling Kit (Dojindo molekularen Technologien, Japan) gemäß den Herstellerangaben beschriftet wurde. Zu konfluent MKN28-Zellen auf Deckgläser, biotinyliertem PFL (200 ug) wurde zugegeben und 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nachdem mit kaltem PBS Waschen wurden die Zellen abgekratzt und in 800 ul RIPA-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P40, 0,5% Natriumdesoxycholat, Proteaseinhibitorcocktail, 0,1% SDS lysiert ). Anschließend wurden 100 &mgr; l Biotin-capture Avidin-Kügelchen (Adar Biotech, Israel) wurde zu dem Zell-Lysat gegeben und über Nacht bei 4 ° C unter leichtem Schütteln inkubiert. Die Kügelchen wurden dreimal mit 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 gewaschen. Gefangenen Proteine ​​auf Kügelchen wurden mit 50 &mgr; l SDS-PAGE-Probenpuffer (62,5 mM Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% Glycerin, 1% Mercaptoethanol, 0,003% Bromphenolblau) eluiert für 15 min bei 90 ° C und einer SDS-PAGE. Das Protein band spezifisch für PFL Behandlungs Fraktion wurde nach Verdau mit Trypsin im Gel durch MALDI-TOF MS analysiert. Kurz gesagt wurden die CBB gefärbten Proteinbanden ausgeschnitten und entfärbt mit 25 mM Ammoniumbicarbonat 50% Acetonitril enthält. Die reduktive Alkylierung wurde Iodacetamid 1 h mit 50 mM mit 50 mM TCEP (Tris [2-Carboxyethyl] phosphin) in 25 mM Ammoniumbicarbonat, gefolgt von einer Inkubation durchgeführt. Nach der Dehydratisierung mit Acetonitril wurde das Protein in dem Gel mit 10 ul Trypsin-TPCK-(100 ug /ml) in 50 mM Ammoniumbicarbonat verdaut. Die Verdauung wurde mit Zip Spitze (Millipore, Japan) gereinigt und auf ein MALDI-Target. Ein ul Matrixlösung (α-cyano-4-hydroxycinnapic Säurematrix [Bruker, Japan] in Aceton-ethanol [01.02]) wurde dann zu der Stelle. MALDI-TOF MS-Analyse wurde mit einem Autoflex-Massenspektrometers (Bruker, Japan) nach der Kalibration mit einem Peptidmasse Standard-Kit (Bruker, Japan) durchgeführt. Die Peptidmassenfingerdruckdaten wurde durch die Mascot-Software (Matrix Science, Japan) durchsucht.

zelluläre Lokalisation von PFL und Integrin-α2

MKN28-Zellen wurden auf Deckgläsern in einer 6-Well-Platte . Die Zellen auf Deckgläsern wachsen wurden mit 30 &mgr; g /ml behandelt Alexa488-konjugiertem PFL in RPMI 1640 und für verschiedene Zeiträume inkubiert. Nach Waschen mit PBS wurden die Zellen für 5 min mit 80% Aceton fixiert. bei 37 ° C für 1 h, nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit monoklonalen Maus-Anti-Integrin-α2 /CD49b-Antikörper (D Systems, MN R &) inkubiert. Nach Waschen mit PBS wurden die Zellen mit Alexa568-konjugiertem Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper (Life Technologies, Japan) bei 37 ° C für 1 h inkubiert. Nach weiteren PBS Waschen wurden die Zellen unter Verwendung von Vectashield mit DAPI (Vector Laboratories) montiert ist und unter der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop beobachtet (IX70, Olympus, Japan). Durch den Einsatz in gleicher Weise die andere Magenkrebszelllinie GCIY und normalen humanen Hepatozyten Zellen ACBRI 3716, zelluläre Lokalisationen von Integrin α2 und Alexa488-PFL wurden wie oben beschrieben untersucht und unter einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus BX51) beobachtet. Die Wirkung von Hefe-Mannan auf die zelluläre Lokalisation von PFL und Integrin-α2 wurde wie folgt bewertet. Konfluente MKN28-Zellen auf Deckgläsern in einer Platte mit 6 Vertiefungen gezüchtet wurden für 4 h mit 20 &mgr; g /ml von Alexa488-PFL in RPMI 1640 in Gegenwart oder Abwesenheit von 700 &mgr; g /ml Hefe-Mannan behandelt. Die Zellen wurden fixiert, sichtbar gemacht mit Anti-Integrin-α2 /CD49b Antikörper, wie oben beschrieben, und unter einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus BX51) beobachtet. Wirkung von verschiedenen Lectinen auf die zelluläre Lokalisation von Integrin-α2 wurde in ähnlicher Weise untersucht, indem die MKN28-Zellen inkubiert mit 20 ug /ml jedes Lectins in RPMI 1640 für 4 h.

Ergebnisse

• PLoS ONE: Honokiol Induziert Calpain-vermittelter Glucose-regulierten Protein-94-Spaltung und Apoptose in menschlichen Magenkrebszellen und reduziert Tumor Growth
• Arten von Magen cancer