PLOS ONE: High-manose Encadernação Antiviral lectina PFL de Pseudomonas fluorescens Pf0-1 promove a morte celular de celular Câncer Gástrico MKN28 através da interação com α2-integrina

Sumário

nova família de lectina anti-HIV, o que demonstra uma especificidade de ligação rígida para altas glicanos de manose foi encontrado em organismos inferiores. O ortólogo bacteriana foi identificado no genoma de Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 e o gene que codifica uma lectina putativo foi clonada, expressa em Escherichia coli
e purificado por uma filtração em gel passo. triagem matriz de glicanos da lectina recombinante, denominado PFL, revelou que PFL preferencialmente reconhece altas glicanos de manose com o homem α1-3 que foi altamente exposta na posição D2. Em contraste, mascarando desse Homem α1-3 com o homem α1-2 interações lectina-hidrato de carbono deteriorou de forma considerável. Reduzir dissacarídeo terminal, GlcNAc-GlcNAc de altas glicanos de manose também foi fundamental para PFL-vinculativo. PFL mostraram uma atividade do vírus anti-influenza potente inibindo a entrada do vírus nas células nas doses de baixa concentração nanomolar. Na concentração micromolar ou superior, PFL mostrou uma citotoxicidade que acompanha a perda da adesão celular contra células MKN28 câncer gástrico humanos. A molécula de superfície celular para o qual PFL ligado foi co-precipitada com PFL marcado com biotina e integrina identificada como α2 por impressões digitais da massa dos péptidos utilizando espectrometria de massa MALDI-TOF. Curiosamente, após tratamento com PFL exógeno, α2 integrina na superfície celular foram submetidos a internalização rápida para o citoplasma e acumulada para a região perinuclear, em conjunto com o PFL ligado. A resultante perda de adesão célula daria origem a uma via de sinalização que a morte celular induzida anoikis semelhante. Estes eventos foram efetivamente inibida pelo pré-tratamento do PFL com mannnan, indicando o envolvimento de altos glicanos de manose na morte celular induzida pelo PFL, que foi desencadeada por interações a2 PFL-integrina

Citation:. Sato Y, Morimoto K, Kubo T, Yanagihara K, Seyama T (2012) High-manose Encadernação antiviral lectina PFL de Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 promove a morte celular de celular Câncer gástrico MKN28 através da interação com α2-integrina. PLoS ONE 7 (9): e45922. doi: 10.1371 /journal.pone.0045922

Edição: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brasil

Recebido: 07 de maio de 2012; Aceito: 27 de agosto de 2012; Publicação: 20 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Sato et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado em parte por uma Grant-in-Aid para Jovens cientistas (B) da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) (Grant número 24.790.101). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

High lectinas de ligação a manose que visam glicanos específicos em uma superfície do vírus são promissores potenciais agentes virais de inativação de que poderiam ser usados ​​para a prevenção e controle de infecções por vírus [1], [2]. Numerosos lectinas que reconhecem especificamente elevados glicanos de manose encontram-se a partir de vários taxonomia incluindo bactérias, algas, plantas e animais, e alguns dos quais têm sido mostrados como exibindo actividade anti-HIV [3]. Temos recentemente encontrou uma nova família lectina anti-HIV distribuídos em organismos inferiores, incluindo bactérias, cianobactérias e algas marinhas [4]. Eles apresentam características comuns, tais como a multiplicação seqüência de altamente conservada do domínio N-terminal e altos reconhecimentos de oligossacarídeos de manose exclusivos. Algumas lectinas nesta família como OAA cianobactérias de Oscillatoria agardhii
[4] e de algas vermelhas ESA-2 a partir de Eucheuma serra
[5] têm demonstrado para inibir a entrada do HIV nas células hospedeiras com CE _{50s de baixa gama nanomolar por directamente vinculativa para envelope gp120. Além disso, uma alga vermelha lectina KAA-2 a partir de Kappaphycus alvarezii
, que também pertence a esta família inibe a infecção de várias estirpes de vírus influenza com CE 50 anos de baixos níveis nanomolares de uma forma independente de tensão, através o reconhecimento de alta oligossacarídeo manose na hemaglutinina viral envelope glicoproteína (HA) [6].}

para além da actividade antiviral potente, ESA-2 mostra várias atividades biológicas, tais como a actividade mitogénica para mouse e linfócitos humanos e
in vitro de inibição do crescimento de células tumorais [7], [8]. Embora as propriedades biológicas desta família lectina estão se tornando aparente, as propriedades de ortólogos bacterianos de Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 e Herpetosiphon aurantiacus
ainda devem ser esclarecidas.

no presente estudo, que clonaram o gene ortólogo lectina de P. fluorescens
Pf0-1 ea proteína lectina codificado (PFL) foi expressa em
Escherichia coli. Funcional PFL foi purificado com sucesso com um rendimento elevado e caracterizado em termos das suas actividades biológicas, tais como actividade anti-tumoral e anti-viral. Como previsto a partir da similaridade estrutural intensa de PFL com outros membros desta família de lectina, PFL exibiram especificidade exclusiva para alta oligossacárido manose e uma potente actividade antiviral contra o vírus da gripe. Além disso, PFL morte celular induzida por anoikis-like de células de câncer gástrico MKN28 através da interação com α2 integrina da superfície celular.

Materiais e Métodos

Materiais

cultura Stab de P. fluorescens
Pf0-1 foi generosamente fornecidos pelo Dr. Mark W. Silby (University of Massachusetts Dartmouth, EUA). Os vírus da gripe e células de Madin-Darby de rim canino (MDCK) foram generosamente fornecidos pelo Dr. T. Sakaguchi (Universidade de Hiroshima, Japão): Os vírus influenza foram cultivadas em fluido corioalantóica de ovos de galinha com 10 dias de idade. As células MDCK foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com soro fetal bovino a 10% e penicilina-estreptomicina. Uma linha de células de câncer de estômago, MKN28 foi gentilmente cedido pelo Prof. Suzuki (Fukushima Medical University, Fukushima, Japão). A linha celular foi mantida em meio RPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS, Gibco), 100 UI /mL de penicilina G de sódio, e 100 mg /ml de sulfato de estreptomicina. Outra linha de células de cancro do estômago, GCIY, foi adquirido a partir de RIKEN CELL BANK (Ibaraki, Japão) e mantido da mesma maneira como descrito acima. normal de células de hepatócitos primários humanos (ACBRI 3716) foi comprado de DS Pharma Biomédica (Osaka, Japão) e mantido em CS-C médio kit R (DS Pharma Biomédica).

Ensaio de Hemaglutinação

Hemaglutinação ensaio foi realizado utilizando uma suspensão a 2% (v /v) de eritrócitos de coelho tratados com tripsina, como descrito anteriormente [9]. Resumidamente, a suspensão de eritrócitos de coelho nativo foi tratado com 0,5% de tripsina em solução salina e a mistura foi incubada a 37 ° C durante 60 min. Após lavagem com solução salina, 2% de suspensão de eritrócitos tratada com tripsina foi preparada em solução salina. actividade de hemaglutinação foi expressa como um título, o recíproco da maior diluição de 2 vezes exibindo hemaglutinação positiva.

clonagem de genes e expressão de lectina PFL

O ADN genómico a partir de P. fluorescens
Pf0-1 foi utilizado como um molde para a clonagem do gene de gene PFL. Em primeiro lugar, um conjunto de iniciadores de oligonucleótido, 5'-GGCAGGTCTCCCGAAACTTCAAG-3 'e 5'-AGTCGAACGCCTGAACCTGTTGA-3', que hibridou com a montante e a jusante da região codificante de PFL, respectivamente, foram usadas, e a PCR foi realizada usando Prime DNA ESTRELA polimerase (TAKARA). Utilizando o fragmento amplificado por PCR como molde, a PCR subsequente foi realizada com um iniciador de sentido directo, 5'-CACCATGTCTAAATACGCAGTGGCA-3 ', que tinha a sequência adicional CACC codão de iniciação ATG do gene de PFL, e um primer reverso, 5'-TTACTCTATCTGCCCACGGAAG -3 '(TTA; correspondente ao codão de paragem do gene de RFL). Os fragmentos amplificados foram ligados ao vector de pET101 /D-TOPO. O plasmídeo recombinante foi transformado em Escherichia coli
células TOP10 (Invitrogen). Os clones recombinantes obtidos foram confirmadas como sendo uma construção correcta por sequenciação de ADN. Os clones funcionais foram transformados em Escherichia coli
BL21 Star (DE3) células para expressão indutível do gene PFL. IPTG com uma concentração final de 0,8 mM foi adicionado para a cultura transformada para induzir a expressão PFL. Após 6 horas de incubação a 37 ° C, as células foram colhidas por centrifugação a 8000 rpm durante 20 min.

Purificação de lectina PFL

As células bacterianas colhidas foram ressuspensas em tampão de fosfato 20 mM ( pH 7,0) contendo NaCl 0,15 M (PBS) e foram rompidas por sonicação. Após centrifugação a 8000 rpm durante 20 min, uma aliquota do sobrenadante foi submetido a coluna de Superose 12 (GE Healthcare), equilibrada com PBS. A coluna foi eluida com PBS a uma taxa de fluxo de 0,8 mL /min de um modo isocrático. O eluato foi monitorizado por absorção a 280 nm, e examinadas para actividade de hemaglutinação, e as fracções activas foram reunidas.

Determinação de Peso Molecular de PFL

O peso molecular de PFL foi determinado por MALDI-TOF a análise MS com um espectrômetro de massa Autoflex (Bruker, Japão) após a calibração com um kit padrão de massa peptídeo (Bruker, Japão) usando ácido sinapínico como uma matriz.

sequência de DNA análise
sequências

Nucleotide foram determinadas pelo método de terminador de cadeia de didesoxi utilizando uma versão 3.1 kit BigDye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems). A sequenciação de ADN foi realizada utilizando um Analisador Genético ABI 310 (Applied Biosystems).

análise matriz Glicano

PFL foi marcada com Alexa Fluor 488 de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen, Eugene, OR). especificidade de ligação glicanos de PFL foi determinada pelos microarrays glicano impressos (versão 5.0) de acordo com o procedimento padrão de CoreH do Consórcio para Glycomics funcionais (CFG) (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp ). A fluorescência relativa média em réplicas de seis foi calculada pela média quatro valores depois de remover os valores mais altos e mais baixos para eliminar alguns dos acertos falsos com pontos muito altas ou baixas. As barras de erro representam o erro padrão da média (EPM), e% CV é o coeficiente de variação (DP /média) calculado como%.

Actividade Anti-Influenza de PFL

In vitro
actividade anti-gripe de PFL foi determinada pelo ensaio de captação de corante vermelho neutro (NR). Várias concentrações de PFL foram preparados com DMEM contendo 10 ug /ml de tripsina em uma microplaca de 96 poços. Para cada poço, o vírus foi adicionado como uma multiplicidade de infecção de cerca de 0.001 partículas infecciosas por célula. Após incubação a 37 ° C durante 48 h, foram adicionados 100 uL de corante NR (150 ug /ml em DMEM) e ainda incubadas durante 2 h. NR corante incorporado nas células foi extraída pela adição de 100 ul de 1% /ácido acético 50% de etanol. Os poços foram medidos a 540 nm com um leitor de microplacas (1420 contra multilabel, PerkinElmer, MA, EUA) como um fator de sobrevivência do efeito citopático do vírus.

Imunofluorescência Microscopia

Imunofluorescência coloração foi realizada para visualizar a inibição da entrada do vírus da gripe por PFL. Resumidamente, as células MDCK cultivadas em vidro de cobertura foram infectadas com A /Udorn /72 a uma multiplicidade de infecção de cerca de 0.001 partículas infecciosas por célula, na presença ou ausência de 200 nM PFL em DMEM contendo 10 ug /ml de tripsina. Depois de 24 h após a infecção, as células infectadas foram fixadas com acetona a 80% durante 5 min. A seguir à lavagem com PBS, as células foram incubadas com anticorpo monoclonal de ratinho anti-HA (Hytest, Turku, Finlândia) a 37 ° C durante 1 h. Após lavagem com PBS, as células foram incubadas com anticorpo isotiocianato de fluoresceína (FITC) de IgG de caprino conjugado anti-rato (Anticorps secondaires, Compiègne, França) a 37 ° C durante 1 h. Após nova lavagem PBS, as células foram montadas com Vectashield com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) e foram observadas sob um microscópio com fluorescência (Olympus BX51 da Olympus, Japão).

ensaio ELISA

interacção directa da PFL com envelope viral glicoproteína HA foi ensaiada utilizando um ensaio immnosorbent ligado a enzima (ELISA). PFL (5 ug /ml) em tampão de carbonato (pH 9,6) foi revestida sobre placas de ELISA de 96 poços (BD Biosciences, Bedford, MA). Os poços foram lavados três vezes com PBS contendo 0,1% de Tween20 (PBST) e bloqueado com leite magro 3% a 37 ° C durante 1 h. Após lavagem com PBST, concentrações variáveis ​​de preparação de vacina da gripe HA (Astellas, Tóquio, Japão) foram adicionados a cada poço e incubou-se a 37 ° C durante 1 h. Após lavagem com PBST, os poços foram incubados com murganho anti-HA anticorpo monoclonal (Hytest) a 37 ° C durante 1 h seguido de incubação com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo IgG de cabra anti-ratinho (GE Healthcare, Reino Unido ) a 37 ° C durante 1 h. Subsequentemente, 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) (Sigma-Aldrich, St Louis, MI) foi adicionado. A reacção foi parada utilizando o reagente TMB paragem (Sigma-Aldrich) e a absorvância a 450 nm foi medida utilizando um leitor de microplacas (1420 contador multilabel, PerkinElmer).

proliferação de células tumorais pela MTS ensaio

a proliferação celular foi quantificada por um ensaio MTS convencional utilizando CellTiter 96 ensaio de proliferação celular (Promega, Madison, WI). As células cultivadas em microplacas de 96 poços foram incubadas durante 72 h com várias concentrações de PFL em meio adequado, com 10% de FBS. As células foram então incubadas com 20 ul de reagente MTS durante 1 h a 37 ° C e medida com um leitor de microplacas (1420 contador multilabel, Perkin Elmer) a 490 nm. O efeito do manano de levedura de citotoxicidade de PFL foi determinada por incubação das células com 5 uM PFL na presença de várias concentrações de manano de levedura em meio RPMI 1640 com 10% FBS durante 72 h, e a viabilidade celular foi medida como descrito acima.

Isolamento de PFL se ligar à molécula (s) na célula
MKN28

PFL foi marcado com biotina usando kit de marcação de biotina (tecnologias moleculares Dojindo, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. Para confluentes MKN28 células em lamelas, biotinilado-PFL (200 ug) foi adicionado e incubado durante 2 h à temperatura ambiente. Após lavagem com PBS frio, as células foram raspadas e lisadas em 800 ul de tampão RIPA (Tris-HCl a 50, pH 7,6, NaCl 150 mM, 1% de Nonidet P40, 0,5% desoxicolato de sódio, mistura de inibidores de protease, 0,1% de SDS ). Subsequentemente, 100 ul de pérolas de captura de biotina-avidina (adar Biotech, Israel) foram adicionados ao lisado de células e incubadas durante a noite a 4 ° C com agitação suave. As esferas foram lavadas três vezes com Tris-HCl, pH 7,5 a 50. proteínas capturada em esférulas foram eluídas com 50 ul de tampão de amostra de SDS-PAGE (Tris 62,5 mM, pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerol, 1% de mercaptoetanol, 0,003% de azul de bromofenol) durante 15 min a 90 ° C e submetido a SDS-PAGE. A banda de proteína específico para tratamento PFL fracção foi analisada por MALDI-TOF MS após a digestão em gel com tripsina. Resumidamente, as bandas de proteína foram coradas CBB cortado e descorados com bicarbonato de amónio 25 mM contendo 50% de acetonitrilo. A alquilação redutora foi efectuada com 50 mM de TCEP (Tris [2-carboxietil] fosfina) em bicarbonato de amónio 25 mM, seguido por incubação com 50 mM de iodoacetoamide durante 1 h. Após desidratação com acetonitrilo, a proteína no gel foi digerido com 10 ul de tripsina TPCK-(100 ug /ml) em bicarbonato de amónio 50 mM. A digestão foi purificada com ponta de fecho de correr (Millipore, Japão) e mancha num alvo MALDI. Um ul de solução de matriz (α-ciano-4-hydroxycinnapic matriz de ácido [Bruker, Japão] em acetona-etanol [01:02]) foi então adicionada ao local. A análise MALDI-TOF MS foi realizada por um espectrómetro de massa Autoflex (Bruker, Japão), após a calibração com um kit padrão de massa péptido (Bruker, Japão). Os dados de impressão dedo massa peptídeo foi pesquisado pelo software Mascot (Matrix Ciência, Japão).

Localização celular de PFL e integrina α2

MKN28 células foram cultivadas em lamelas em uma placa de 6 poços . As células que crescem em lamelas foram tratadas com 30 ug /ml de conjugado Alexa488-PFL em meio RPMI 1640 e incubou-se durante diferentes períodos de tempo. Após lavagem com PBS, as células foram fixadas com acetona a 80% durante 5 min. A seguir à lavagem com PBS, as células foram incubadas com anticorpo monoclonal de ratinho anti-integrina α2 /anticorpo CD49b (R & D Systems, MN) a 37 ° C durante 1 h. Após lavagem com PBS, as células foram incubadas com anticorpo conjugado com Alexa568-IgG de cabra anti-ratinho (Life technologies, Japão) a 37 ° C durante 1 h. Após nova lavagem PBS, as células foram montadas com Vectashield com DAPI (Vector Laboratories) e foram observadas sob microscópio confocal de varrimento a laser (IX70; Olympus, Japão). Ao empregar a outra linha celular de cancro gástrico GCIY e células de hepatócitos humanos normais ACBRI 3716, localizações celulares de α2 integrina e Alexa488-PFL foram examinados do mesmo modo como descrito acima, e observados sob um microscópio de fluorescência (Olympus BX51). O efeito do manano de levedura na localização celular da integrina PFL e α2 foi avaliada como se segue. MKN28 células confluentes cultivadas em lamelas numa placa de 6 poços foram tratadas com 20 ug /ml de Alexa488-PFL em meio RPMI 1640, na presença ou ausência de 700 ng /ml de manano de levedura durante 4 h. As células foram fixadas, visualizadas utilizando anticorpo anti-CD49b α2 integrina /tal como descrito acima, e observados sob um microscópio de fluorescência (Olympus BX51). Efeito de várias lectinas na localização celular da integrina α2 foi examinado de forma semelhante, através da incubação das células MKN28 com 20 ug /ml de cada lectina em meio RPMI 1640 durante 4 h.

Resultados

molecular clonagem, expressão e purificação de PFL

Temos anteriormente encontrados no genoma de P. fluorescens
Pf0-1 contém uma possível homólogo de anti-HIV família lectina que foi recentemente encontrado em organismos inferiores, incluindo bactérias, cianobactérias e algas marinhas [4]. Com base na sequência de nucleótidos de lectina hipotético de P. fluorescens
Pf0-1 na base de dados, conjuntos de iniciadores foram concebidos para amplificar o gene da lectina. gene da lectina putativo foi clonado com sucesso por um sistema de clonagem TOPO direccional, e a proteína heteróloga de codificação foi expressa em E. coli
BL21 (DE3). A proteína lectina expressa foi purificada até à homogeneidade através de um único passo de filtração em gel em Superose 12 coluna (Fig. 1A). O pico activo com a actividade de hemaglutinação deu uma única banda de proteína de 13 kDa em SDS-PAGE (Fig. 1B). Finalmente, a partir de 1 de maca E. coli foi obtido
cultura, elevado rendimento de lectina purificado (240 mg). A lectina purificada foi nomeado PFL e utilizados para uma análise mais aprofundada. A massa molecular de PFL (13883,7) determinado por MALDI-TOF MS estava de acordo com a massa calculada (13881,1) a partir da sequência de aminoácidos deduzida e que o valor estimado pela mobilidade em SDS-PAGE.

O deduzida sequência de aminoácidos de PFL abrigava dois domínios homólogos, consistindo cada uma das metades N- e C-terminal com 62% de identidade de sequência entre si. PFL apresentaram alta homologia de sequência com OAA lectina de cianobactérias de Oscillatoria agardhii
, algas vermelhas lectina ESA-2 a partir de Eucheuma serra
e lectina bacteriana MBHA de Myxococcus xanthus
(Fig . 2B), que constituem uma família nova lectina anti-HIV. A massa molecular de PFL e OAA foram semelhantes, e 13883,7 13924,1, respectivamente, e ambas as lectinas foram compostos de 132 aminoácidos. Ambos PFL e OAA tem uma propriedade comum na sua duplicação sequência OAA mas apresenta um maior grau de identidade de sequência interna com 75% entre os dois domínios repetidos. Em contraste, a ESA-2 e MBHA são compostos por quatro domínios homólogos repetidos em tandem de 67 aminoácidos. Os graus de similaridade de OAA, esa-2 e MBHA com PFL em suas porções N-terminais (cada 132 resíduos) das sequências de aminoácidos foram 62,1, 61,4, e 62,1% de aminoácidos idênticos, respectivamente.

especificidade carboidratos vinculativo do PFL

para determinar a especificidade de ligação de hidratos de carbono de PFL, análise de matriz de glicanos foi realizada no Consórcio para Glycomics funcionais usando matriz impressa versão 5.0. Dos 611 tipos de oligossacáridos testados, PFL (10 ug /ml) mostraram especificidade exclusiva para altas glicanos do tipo manose como mostrado na Fig. 3. A lista inteira de oligossacarídeos testados e os resultados podem ser encontrados on-line em (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp).

PFL fortemente ligado a glicano M6 (216 ) e glicano M8 (212), sendo que ambos têm uma Homem α1-3 exposta no braço D2, com os níveis semelhantes de valores RFU elevadas, 43471 e 40759, respectivamente. Em contraste, mascaramento deste homem α1-3 com Man α1-2 prejudicado drasticamente a interacção entre PFL e os glicanos. Isto foi mais evidente através da comparação da M6 glicano (216) e glicano M7 (211), onde o Homem α1-2 adicional no braço D2 diminuição da potência de ligação a cerca de 53%. Do mesmo modo, a potência de ligação de PFL para glicano M9 (213) foi diminuída (RFU = 8,535), em comparação com o seu homólogo de glicano M8 (212) falta o terminal D2 α1-2 Homem, que mostra apenas 21% da potência. Curiosamente, a remoção do dissacárido terminal susceptível de redução, GlcNAc-GlcNAc da glicanos de manose elevados muito drasticamente diminuída PFL de ligação. Por exemplo, a potência de ligação PFL foi quase completamente abolido para os glicanos 316 e 317 que têm nenhuma sequência GlcNAc-GlcNAc ao passo que aqueles homólogo glicanos 212 e 213, respectivamente, exibiram potência muito mais elevada. A importância do terminal de GlcNAc-GlcNAc foi ainda confirmada pela comparação dos glicanos 217 e 315, embora o grau de insuficiência de PFL de ligação era limitado. Esta lectina era desprovida de incluindo manose-obrigatório monossacarídeos. Além disso, PFL não interagir com Man Man α1-6 (314) e mannotriose (214), que são constituintes da porção ramificada de altas glicanos de manose. Pentassacárido do núcleo de N-glicano (50) não foi reconhecida pela PFL mas o seu homólogo fucosilada (485) apresentada interacção fraca (RFU = 746). Estes perfis de ligação do oligossacárido PFL eram muito semelhantes aos de OAA, SEC-2 e KAA-2, que pertencem a uma nova família de lectina anti-HIV em organismos inferiores [4] - [6].

Anti- influenza Virus atividade do PFL

atividade do vírus Anti-influenza do PFL foi avaliada com duas cepas do vírus influenza, a /Udorn /72 (H3N2) e a /Beijing /262/95 (H1N1) pela absorção do corante NR ensaio. PFL efeito citopático efetivamente inibiu causada por ambas as estirpes de vírus da gripe, com CE _{50 anos de 19,4 ± 1,5 nM e 4,5 ± 0,4 nM, respectivamente (Fig. 4A). Para confirmar que PFL inibiu o passo inicial de entrada do vírus da gripe em células, observou-se a distribuição de antigénios virais nas células infectadas na presença ou na ausência de PFL utilizando microscopia de imunofluorescência. FIG. 4B mostra a distribuição do antigénio virai após 24 h após a infecção com A /Udorn /72 detectada por um anticorpo anti-hemaglutinina específica. PFL eficientemente inibida a entrada do vírus da gripe em células enquanto que os vírus foram capazes de penetrar e replicar nas células hospedeiras na ausência de PFL. Um PNA galactose lectina específica de Arachis hypogaea
não conseguiu inibir a entrada do vírus nas células. Estes resultados sugerem a presença de glicanos de manose altos na superfície do vírus na posição crítica para a entrada do vírus nas células. Para testar se PFL ligaria directamente ao envelope viral glicoproteína HA, um ensaio de ELISA foi realizado com a preparação da vacina disponível comercialmente que contêm HA de A /Califórnia /7/09 (H1N1), A /Victoria /210/09 (H3N2), e B /Brisbane /60/08 como um componente principal. Como demonstrado na Fig. 4C, observou-se dependente da dose ligação de HA ao PFL.}

PFL morte celular induzida de célula de câncer gástrico humano MKN28

In vitro
efeito anti-tumoral do PFL na células de cancro gástrico MKN28 foi avaliada por ensaio de MTS convencional. Como mostrado na Fig. 5A (painel da esquerda), PFL mostrou um efeito dependente da dose sobre a proliferação de células MKN28. Às 72 horas pós-tratamento PFL, a viabilidade celular foi significativamente diminuída em doses de 0,5 uM ou superior. Em contraste, as baixas doses de 0,1-0,3 uM, a proliferação celular foi ligeiramente estimulados. A morte celular induzida por PFL de células MKN28 foi acompanhado por uma perda da adesão celular para o fundo da placa de cultura, como mostrado na Fig. 5B, onde evertido aglomerado de células foram observados como linhas acastanhadas. A morte celular induzida por PFL foi eficazmente inibida na presença de manano de levedura, uma glicoproteína de rolamento de alta oligossacarídeos de manose (Fig. 5A, painel da direita). Isto indica os glicanos de manose elevada em células MKN28 são envolver na sinalização celular induzida por PFL que, em última análise conduzindo à morte celular. Em contraste, as células de hepatócitos humanos normais (ACBRI 3716) foram relativamente resistentes ao tratamento em comparação com PFL MKN28 células (FIG. 5A, painel esquerdo).

Isolamento de molécula (s) de ligação PFL em células de cancro gástrico humano MKN28

para abordar o mecanismo molecular pelo qual PFL induz a morte celular de células MKN28, molécula (s) da superfície celular ao qual PFL ligadas foram investigados. Biotinilado PFL foi incubada durante 2 h com células MKN28 e as células foram lisadas com tampão RIPA contendo 0,1% de SDS. A molécula (s) da superfície celular ao qual biotina-PFL ligadas foram co-precipitada com esferas revestidas com avidina. As proteínas aprisionadas em esferas foram subsequentemente eluída com tampão de amostra de SDS-PAGE e analisados ​​em SDS-PAGE (Fig. 6A). Embora várias bandas não específicas foram detectadas, observou-se uma banda de 150 kDa que especificamente detectado na fracção PFL tratada. Esta banda foi ainda submetido a digestão em gel de tripsina seguido por análise por espectrometria de massa MALDI-TOF. Os peptídeos obtidos dados de impressões digitais de massa (Fig. 6B) foram pesquisados ​​para banco de dados e a proteína foi identificada como integrina α2, com pontuação com base na probabilidade de 57 (p < 0,05).

localização celular da adicionado exogenamente PFL e integrina α2

Os comportamentos de si PFL e α2 integrina após tratamento com PFL foram examinadas utilizando um microscópio de fluorescência confocal. Nesta experiência, marcado com fluorescência PFL (Alexa488-PFL) foi usada para rastrear PFL localização. Um Alexa488-PFL foi incubado com células MKN28 de 1, 5 e 24 horas a doses de 30 ug /ml. α2 integrina foram detectados com o anticorpo monoclonal anti-integrina α2 /CD49b, seguida por 2-Alexa568 anticorpo conjugado. Curiosamente, Alexa488-PFL ligada à superfície da célula e para o citoplasma internalização iniciado no prazo de 1 h (Fig. 7). Integrina α2 que foi predominantemente localizada na superfície da célula em estado estável também foi submetido a internalização, e mais importante, a localização das α2 integrina coincide bem com PFL. Após 5 h de incubação, tanto PFL e integrina α2 foram co-localizados e acumulado na região perinuclear e incubação adicional, basicamente, não alterou a localização de ambas as proteínas. É, portanto, provável que, uma vez ligado a integrina PFL α2, ambas as proteínas têm nunca foi reciclado de volta para a superfície da célula. tráfico intracelular rápida do complexo integrina-α2 PFL ocorreu lamelas mesmo em colagénio I revestidos (dados não mostrados). Do mesmo modo, foi observada a redistribuição de integrina α2 após tratamento com PFL noutra linha celular de cancro gástrico, GCIY, mas não em células de hepatócitos humanos normais, ACBRI 3716 (Fig. 8). Em ACBRI 3716 células, internalização do PFL não foi observado, possivelmente pela menor expressão de integrina α2 na superfície da célula.

O envolvimento de altos glicanos de manose na interação α2 PFL-integrina

Para testar se celular redistribuição de integrina α2 causada pelo PFL pode surgir a partir de uma interação específica do PFL com altos glicanos de manose no integrina molécula α2, nós avaliamos o efeito de manana levedura na internalização integrina α2-induzida PFL usando MKN28 células. Na ausência de manano de levedura, ambas as proteínas foram submetidos a internalização significativa (Fig. 9A, painéis superiores). Em contraste, na presença de manano de levedura, PFL falhou para ligar a superfície da célula, e o tráfico intracelular subsequente de PFL foi completamente abolida (Fig. 9A, inferior direito). Concordando com esta observação, integrina α2 não alterar a sua localização na presença de levedura a manana (Fig. 9A, canto inferior esquerdo). Estes resultados indicam claramente que as PFL ligada a integrina α2 através do reconhecimento de glicanos de manose elevada em α2 integrina. Para confirmar ainda mais a exigência de elevados glicanos de manose para integrina α2 redistribuição, nós testamos o efeito de diversas lectinas sobre a localização celular de α2 integrina. Como mostrado na Fig. 9B, outras lectinas com diferentes especificidades, tais como PNA da Arachis hypogaea
, AOL a partir de ligação fucose Aspergillus oryzae
, MAM de ligação de ácido siálico de Maackia amurensis
, D-GlcNAc de ligação UDA de Urtica dioica
não afetou a localização de integrina α2. Curiosamente, mesmo alta manose lectinas como uma lectina manose monocotiledôneas (Man) liga�o ao, GNA de Galanthus nivalis
não mostrou nenhuma mudança significativa na integrina α2. Em contraste, a ligação de alta manose lectina legume concanavalina a (ConA) distorcido o arranjo de integrina α2 como PFL fez.

Discussão

Neste estudo, nós avaliamos a atividade biológica da nova lectina bacteriana PFL de P. fluorescens
Pf0-1 que pertence a recente descobriu família lectina anti-HIV em organismos inferiores. Ocorrência de aumentar as estirpes de vírus da gripe resistentes aos medicamentos, bem como a emergir estirpes de vírus de alta patogenicidade, tal como H5N1 aviária nos levou a explorar PFL como um agente anti-influenza romance. PFL mostrou actividade anti-vírus da gripe potente e o mecanismo pelo qual PFL inibiu a replicação do vírus foi inibição do passo inicial de entrada do vírus nas células. É mais provável que as PFL exercida actividade anti-gripe por se ligar selectivamente a altas glicanos de manose no envelope viral HA, tal como demonstrado no ensaio de ELISA [9]. De facto, o local específico de ocorrência alta oligossacárido manose mostrou na região de HA perto do local de ligação do receptor [10].

Para explorar o efeito anti-tumoral de PFL, que empregue linha celular de cancro gástrico humano que MKN28 é originado a partir de um tumor tipo intestinal moderadamente diferenciado. O algal lectina vermelho ESA-2, que pertence à mesma família lectina com PFL exibiu efeito anti-tumoral tanto in vitro
e in vivo
[7], [8]. SEC-2 é uma proteína derivada de algas comestíveis e que possa exercer efeito anti-tumor no cancro do tracto gastrointestinal por administração oral. É notável que PFL promoveu morte celular das células MKN28, exclusivamente através de um reconhecimento do alto glicanos de manose na molécula integrina α2, que predominantemente localizadas na superfície da célula em estado estacionário. integrinas heterodiméricas actuar não só como molécula de ancoragem para fixar as células a uma matriz extracelular apropriado (ECM), mas também como sensores de ECM o ambiente [11].

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