PLoS ONE: Høj mannose-bindende Antiviral Lectin PFL fra Pseudomonas fluorescens Pf0-1 Fremmer Cell Death of Gastric Cancer Cell MKN28 via Interaktion med α2-Integrin

Abstrakte

Novel anti-HIV lektin familie, som viser en streng bindende specificitet for højt mannoseindhold glykaner er blevet fundet i lavere organismer. Den bakterielle ortholog er blevet identificeret i genomet af Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 og genet, der koder en formodet lectin blev klonet, udtrykt i Escherichia coli
og oprenset med et trin gelfiltrering. Glycan vifte screening af rekombinante lektin, betegnes PFL, har afsløret, at PFL fortrinsvis genkender høje mannose glycaner med α1-3 Man, der var stærkt eksponeret på D2 position. I modsætning hertil maskering af denne α1-3 Mand med α1-2 Man dramatisk svækket lektin-kulhydrat interaktioner. Reducerende terminal disaccharid, GlcNAc-GlcNAc højt mannoseindhold glycaner var også afgørende for PFL-binding. PFL viste en kraftig anti-influenzavirus aktivitet ved at hæmme virus indtrængen i celler ved doser på lav koncentration nanomolær. Ved mikromolære koncentration eller højere, viste PFL en cytotoksicitet ledsagende tab af celleadhæsion mod humane mavekræft MKN28 celler. Celleoverflademolekylet hvortil PFL bundet blev co-udfældet med biotinmærket PFL og identificeret som integrin α2 ved peptidmassefingeraftryk hjælp MALDI-TOF massespektrometri. Interessant nok efter behandling med exogent PFL, integrin α2 på celleoverfladen undergik hurtig internalisering til cytoplasmaet og akkumuleret til perinukleære region, sammen med det bundne PFL. Den resulterende tab af celle vedhæftning ville udløse en signalvej, der inducerede anoikis-lignende celledød. Disse hændelser blev effektivt inhiberet ved forbehandling af PFL med mannnan, hvilket indikerer deltagelse af højt mannoseindhold glycaner på PFL-induceret celledød, der blev udløst af PFL-integrin a2 interaktioner

Henvisning:. Sato Y, Morimoto K, Kubo T, Yanagihara K, Seyama T (2012) høj mannose-bindende Antiviral Lectin PFL fra Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 Fremmer Cell Death of Gastric Cancer Cell MKN28 via Interaktion med α2-Integrin. PLoS ONE 7 (9): e45922. doi: 10,1371 /journal.pone.0045922

Redaktør: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brasilien

Modtaget: May 7, 2012; Accepteret: August 27, 2012; Udgivet: 20 September, 2012

Copyright: © Sato et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev delvist understøttet af en Grant-in-Aid for Unge Forskere (B) fra Japan Society for fremme af Science (JSP'er) (Grant nummer 24.790.101). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Høje mannose-bindende lectiner, der er målrettet specifikke glycaner på en virus overflade er lovende potentielle virale-inaktiverende midler, der kan anvendes til forebyggelse og bekæmpelse af virusinfektioner [1], [2]. Talrige lectiner som specifikt genkender højt mannoseindhold glycaner er fundet fra forskellige taksonomi herunder bakterier, alger, planter og dyr, og hvoraf nogle er blevet vist at udvise anti-HIV-aktivitet [3]. Vi har for nylig fundet en hidtil ukendt anti-HIV lectin familien fordelt i lavere organismer, herunder bakterier, cyanobakterier og marine alger [4]. De udviser fælles kendetegn, såsom sekvens multiplikation af stærkt bevaret N-terminale domæne og eksklusive oligosaccharid med højt mannoseindhold anerkendelser. Nogle lektiner i denne familie, såsom cyanobakteriel OAA fra Oscillatoria agardhii
[4] og rød alge ESA-2 fra Eucheuma serra
[5] har vist sig at hæmme HIV indrejse i værten celler med EF _{50'erne med lav nanomolær rækkevidde ved direkte binding til kuvert gp120. Desuden er en rød alge lektin KAA-2 fra Kappaphycus alvarezii
, som også hører til denne familie hæmmer infektion af forskellige influenza-virusstammer med EF 50'erne med lave nanomolære niveauer i en stamme-uafhængig måde, gennem anerkendelse af oligosaccharid med højt mannoseindhold på den virale kappeglycoprotein hæmagglutinin (HA) [6].}

Udover den potente antivirale aktivitet, ESA-2 viser forskellige biologiske aktiviteter, såsom mitogen aktivitet for muse og humane lymfocytter og in vitro
vækstinhibering af tumorceller [7], [8]. Selvom biologiske egenskaber denne lektin familie bliver tilsyneladende, egenskaberne af bakterielle orthologer fra Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 og Herpetosiphon aurantiacus
stadig afklares.

I den foreliggende undersøgelse har vi klonet ortholog lectin genet fra P. fluorescens
Pf0-1 og kodede lectin protein (PFL) blev udtrykt i Escherichia coli
. Funktionel PFL blev succesfuldt oprenses i højt udbytte og karakteriseret med hensyn til dets biologiske aktiviteter såsom antivirale og anti-tumor aktivitet. Som forudsagt ud fra intens strukturelle lighed PFL med andre medlemmer af denne familie lectin, PFL udviste eksklusiv specificitet for oligosaccharid med højt mannoseindhold og potent antiviral aktivitet mod influenzavirus. Desuden PFL induceret anoikis-lignende celledød af mavekræft celle MKN28 via interaktion med celleoverfladen integrin α2.

Materialer og metoder

Materialer

Stab kultur af P. fluorescens
Pf0-1 var generøst tilvejebragt af Dr. Mark W. Silby (University of Massachusetts Dartmouth, USA). Influenzavira og Madin-Darby hunde nyre (MDCK) -celler blev generøst leveret af Dr. T. Sakaguchi (Hiroshima University, Japan): De influenzavirus blev dyrket i chorionallantoinvæsken af ​​10 dage gamle hønseæg. MDCK-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum og penicillin-streptomycin. En mavekræft cellelinje, MKN28 blev venligst stillet til rådighed af professor Suzuki (Fukushima Medical University, Fukushima, Japan). Cellelinien blev holdt i RPMI-1640 medium (GIBCO, Grand Island, NY) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, GIBCO), 100 IU /ml penicillin G natrium og 100 mg /ml streptomycinsulfat. En anden mavekræft cellelinie, GCIY, blev købt fra RIKEN CELL BANK (Ibaraki, Japan) og holdt på samme måde som beskrevet ovenfor. Primær normal human hepatocyt celle (ACBRI 3716) blev købt fra DS Pharma Biomedical (Osaka, Japan) og vedligeholdes i CS-C medium kit R (DS Pharma Biomedical).

Hemagglutinations Prøve

Hæmagglutinering assay blev udført under anvendelse af en 2% (vol /vol) suspension af trypsinbehandlede kaninerythrocytter som tidligere beskrevet [9]. Kort fortalt blev kanin native erythrocytsuspension behandlet med 0,5% trypsin i saltvand og inkuberet ved 37 ° C i 60 min blanding. Efter vask med saltvand, blev 2% trypsin-behandlet erythrocyt suspension fremstillet i saltvand. Hæmagglutinering aktivitet blev udtrykt som en titer, det reciprokke af den højeste 2-fold fortynding udstiller positive hæmagglutinering.

Gene kloning og ekspression af lektin PFL

Genomisk DNA fra P. fluorescens Salg Pf0-1 blev anvendt som en skabelon til genkloning af PFL genet. I første omgang en oligonukleotidprimer sæt, 5'-GGCAGGTCTCCCGAAACTTCAAG-3 'og 5'-AGTCGAACGCCTGAACCTGTTGA-3', som hybridiserede med opstrøms og nedstrøms for PFL kodende region, henholdsvis blev anvendt, og PCR blev udført under anvendelse Prime STAR DNA polymerase (TAKARA). Brug af det amplificerede PCR-fragment som template blev den efterfølgende PCR udføres med en fremadrettet primer, 5'-CACCATGTCTAAATACGCAGTGGCA-3 ', som havde CACC yderligere sekvens til ATG startkodon af PFL genet, og en revers primer, 5'-TTACTCTATCTGCCCACGGAAG -3 '(TTA; svarende til stopkodon af RFL-genet). De amplificerede fragmenter blev ligeret ind i pET101 /D-TOPO ekspressionsvektor. Det rekombinante plasmid blev transformeret i Escherichia coli
TOP10-celler (Invitrogen). De opnåede rekombinante kloner blev bekræftet at være en korrekt konstruktion ved DNA-sekventering. De funktionelle kloner blev omdannet i Escherichia coli
BL21 Star (DE3) celler til inducerbar ekspression af PFL-genet. IPTG med en slutkoncentration på 0,8 mM blev tilsat til den transformerede kultur for at inducere PFL ekspression. Efter 6 timers inkubation ved 37 ° C blev cellerne høstet ved centrifugering ved 8000 rpm i 20 min.

Oprensning af lectin PFL

De høstede bakterieceller blev resuspenderet i 20 mM phosphatbuffer ( pH 7,0) indeholdende 0,15 M NaCl (PBS) og blev sprængt ved sonikering. Efter centrifugering ved 8000 rpm i 20 minutter blev en alikvot af supernatanten underkastet Superose 12-søjle (GE Healthcare) ækvilibreret med PBS. Søjlen blev elueret med PBS ved en strømningshastighed på 0,8 ml /min af en isokratisk tilstand. Eluatet blev overvåget ved absorption ved 280 nm og undersøges for hæmagglutinering aktivitet, og de aktive fraktioner blev puljet.

Molekylvægt Bestemmelse af PFL

Molekylvægten af ​​PFL blev bestemt ved MALDI-TOF MS-analyse med en Autoflex massespektrometer (Bruker, Japan) efter kalibreringen med et peptid masse standard kit (Bruker, Japan) ved hjælp sinapininsyre som en matrix.

DNA-sekvens analyse

Nucleotidsekvenser blev bestemt ved dideoxy-kæde-terminator metoden i en BigDye Terminator version 3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems). DNA-sekventering blev udført under anvendelse af en ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

Glycan array analyse

PFL blev mærket med Alexa Fluor 488 ifølge producentens anvisninger (Invitrogen, Eugene, OR). Glycan bindingsspecificitet af PFL blev bestemt ved de trykte glycan mikroarrays (version 5.0) i henhold til den normale procedure for CoreH af konsortiet for Funktionelle Glycomics (CFG) (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp ). Den gennemsnitlige relative fluorescens i replikater af seks blev beregnet ved at tage gennemsnittet fire værdier efter fjernelse de højeste og laveste værdier for at eliminere nogle af de falske hits med meget høje eller lave punkter. De fejl repræsenterer standardafvigelsen på middelværdien (SEM), og% CV er variationskoefficienten (SD /middelværdi) beregnet som%.

Anti-influenza aktivitet af PFL

In vitro
anti-influenza aktivitet af PFL blev bestemt ved neutral rød (NR) farvestofoptagelse assay. Forskellige koncentrationer af PFL blev fremstillet med DMEM indeholdende 10 ug /ml trypsin i en 96-brønds mikroplade. Til hver brønd blev virus tilsat som en infektionsmultiplicitet på ca. 0,001 infektiøse partikler per celle. Efter inkubering ved 37 ° C i 48 timer blev 100 pi NR farvestof (150 ug /ml i DMEM) tilsat, og yderligere inkuberet i 2 timer. NR farvestof inkorporeret i cellerne blev ekstraheret ved tilsætning af 100 pi 1% eddikesyre /50% ethanol. Brøndene blev målt ved 540 nm med en mikropladelæser (1420 multilabel counter, PerkinElmer, MA, USA) som en faktor overlevende fra viruset cytopatisk virkning.

immunfluorescensmikroskopi

Immunfluorescensfarvning var udført for at visualisere optagelse inhibering af influenzavirus af PFL. Kort fortalt blev MDCK-celler dyrket på dækglas inficeret med A /Udorn /72 ved en infektionsmultiplicitet på ca. 0,001 infektiøse partikler per celle, i nærvær eller fravær af 200 nM PFL i DMEM indeholdende 10 ug /ml trypsin. Efter 24 timer efter infektion blev de inficerede celler fikseret med 80% acetone i 5 min. Efter vask med PBS blev cellerne inkuberet med monoklonalt muse anti HA-antistof (HyTest, Turku, Finland) ved 37 ° C i 1 time. Efter vask med PBS blev cellerne inkuberet med fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret gede-anti-muse-IgG-antistof (Anticorps Secondaires, Compiegne, Frankrig) ved 37 ° C i 1 time. Efter yderligere PBS vask blev cellerne monteret ved hjælp Vectashield med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) og blev observeret under et fluorescens-mikroskop (Olympus BX51 Olympus, Japan).

ELISA-assay

Direkte interaktion PFL med viral kappeglycoprotein HA blev analyseret under anvendelse af et enzymbundet immnosorbent assay (ELISA). PFL (5 ug /ml) i carbonatbuffer (pH 9,6) blev overtrukket på 96 brønds ELISA-plader (BD Biosciences, Bedford, MA). Brøndene blev vasket tre gange med PBS indeholdende 0,1% Tween20 (PBST) og blokeret med 3% skummetmælk ved 37 ° C i 1 time. Efter vask med PBST, varierende koncentrationer af præparatet influenza HA-vaccine (Astellas, Tokyo, Japan) blev tilsat til hver brønd og inkuberet ved 37 ° C i 1 time. Efter vask med PBST blev brøndene inkuberet med muse-anti-HA monoklonale antistof (HyTest) ved 37 ° C i 1 time efterfulgt af inkubering med peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret gede-anti-muse-IgG-antistof (GE Healthcare, UK ) ved 37 ° C i 1 time. Efterfølgende 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) substrat (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MI) blev tilsat. Reaktionen blev stoppet ved hjælp TMB stop-reagens (Sigma-Aldrich) og absorbans ved 450 nm blev målt under anvendelse af en mikropladelæser (1420 multilabel counter, PerkinElmer).

tumorcelleproliferation af MTS-assay

celleproliferation blev kvantificeret ved en konventionel MTS assay under anvendelse CellTiter 96 celleproliferationsassay (Promega, Madison, WI). Celler podet på 96-brønds mikroplade blev inkuberet i 72 timer med forskellige koncentrationer af PFL i passende medium med 10% FBS. Cellerne blev derefter inkuberet med 20 pi MTS-reagens i 1 time ved 37 ° C og målt med en mikropladelæser (1420 multilabel counter, PerkinElmer) ved 490 nm. Virkningen af ​​gær mannan på cytotoksiciteten af ​​PFL blev bestemt ved at inkubere cellerne med 5 pM PFL i nærvær af forskellige koncentrationer af gær mannan i RPMI 1640 med 10% FBS i 72 timer, og cellelevedygtighed blev målt som beskrevet ovenfor.

Isolering af PFL bindende molekyle (r) på MKN28 celle

PFL blev mærket med biotin under anvendelse af biotin mærkning kit (Dojindo molekylære teknologier, Japan) ifølge producentens instruktioner. Til sammenflydende MKN28 celler på dækglas, biotinyleret-PFL (200 ug) blev tilsat og inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur. Efter vask med kold PBS blev cellerne skrabet af og lyseret i 800 pi RIPA buffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P40, 0,5% natriumdeoxycholat proteaseinhibitorcocktail, 0,1% SDS ). Efterfølgende blev 100 pi biotin-capture avidinperler (Adar Biotech, Israel) tilsat til cellelysatet og inkuberet natten over ved 4 ° C under forsigtig omrøring. Perlerne blev vasket tre gange med 50 mM Tris-HCl, pH 7,5. Indfangede proteiner på perler blev elueret med 50 pi SDS-PAGE-prøvebuffer (62,5 mM Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol, 1% mercaptoethanol, 0,003% bromphenolblåt) i 15 minutter ved 90 ° C og underkastet SDS-PAGE. Proteinbåndet specifikt for PFL fraktion behandling blev analyseret ved MALDI-TOF MS efter i-gel fordøjelse med trypsin. Kort fortalt blev CBB farvede proteinbånd udskåret og affarvet med 25 mM ammoniumbicarbonat indeholdende 50% acetonitril. Den reduktive alkylering blev udført med 50 mM TCEP (Tris [2-carboxyethyl] phosphin) i 25 mM ammoniumbicarbonat, efterfulgt af inkubation med 50 mM iodoacetoamide i 1 time. Efter dehydrering med acetonitril blev proteinet i gelen spaltet med 10 pi TPCK-trypsin (100 ug /ml) i 50 mM ammoniumbicarbonat. Fordøjelsen blev oprenset med Zip spids (Millipore, Japan) og spottet på en MALDI target. En pi matrixopløsning (α-cyano-4-hydroxycinnapic acid matrix [Bruker, Japan] i acetone-ethanol [1:02]) blev derefter tilsat til stedet. MALDI-TOF MS-analyse blev udført af en Autoflex massespektrometer (Bruker, Japan) efter kalibreringen med et peptid masse standard kit (Bruker, Japan). Peptid masse fingeraftryk data blev gennemsøgt af Mascot software (Matrix Science, Japan).

Cellulær lokalisering af PFL og integrin α2

MKN28 celler blev dyrket på dækglas i en 6-brønds plade . Cellerne vokser på dækglas behandlet med 30 ug /ml Alexa488 konjugeret-PFL i RPMI 1640 og inkuberet i forskellige tidsrum. Efter vask med PBS blev cellerne fikseret med 80% acetone i 5 min. Efter vask med PBS blev cellerne inkuberet med monoklonalt muse-anti-integrin α2 /CD49b-antistof (R &D Systems, MN) ved 37 ° C i 1 time. Efter vask med PBS blev cellerne inkuberet med Alexa568-konjugeret gede-anti-muse-IgG-antistof (Life technologies, Japan) ved 37 ° C i 1 time. Efter yderligere PBS vask blev cellerne monteret ved hjælp Vectashield med DAPI (Vector Laboratories) og blev observeret under konfokal laser scanning mikroskop (IX70, Olympus, Japan). Ved at anvende den anden gastrisk cancercellelinie GCIY og normale humane hepatocytceller ACBRI 3716, blev cellulære lokaliseringer af integrin α2 og Alexa488-PFL undersøgt på samme måde som beskrevet ovenfor, og observeret under et fluorescensmikroskop (Olympus BX51). Virkningen af ​​gær mannan på cellulær lokalisering af PFL og integrin α2 blev evalueret som følger. Konfluente MKN28 celler dyrket på dækglas i en plade med 6 brønde blev behandlet med 20 ug /ml Alexa488-PFL i RPMI 1640 i nærvær eller fravær af 700 ug /ml gær mannan i 4 timer. Cellerne blev fikseret, visualiseret under anvendelse af anti-integrin α2 /CD49b antistof som beskrevet ovenfor, og observeret under et fluorescensmikroskop (Olympus BX51). Virkningen af ​​forskellige lektiner på cellulær lokalisering af integrin α2 blev undersøgt på lignende måde, ved at inkubere MKN28 celler med 20 ug /ml af hver lectin i RPMI 1640 i 4 timer.

Resultater Salg

Molekylær kloning, ekspression og oprensning af PFL

Vi har tidligere fundet genom P. fluorescens
Pf0-1 indeholder en mulig homolog af anti-HIV lectin familie, der for nylig blev fundet i lavere organismer, herunder bakterier, cyanobakterier og alger marine [4]. Baseret på nukleotidsekvensen af ​​hypotetisk lectin af P. fluorescens
Pf0-1 på databasen, blev primersæt designet til at amplificere lectin genet. Formodede lectin genet blev klonet med held ved retningsbestemt TOPO kloning systemet, og den kodende proteinet blev heterologt udtrykt i E. coli
BL21 (DE3). Det udtrykte lectin protein blev oprenset til homogenitet ved en enkelt trin gelfiltrering på Superose 12-søjle (fig. 1A). Den aktive top med hæmagglutination aktivitet gav et enkelt proteinbånd på 13 kDa på SDS-PAGE (fig. 1B). Endelig fra en kuld E. coli
kultur, højt udbytte af oprenset lectin (240 mg) blev opnået. Den rensede lectin blev opkaldt PFL og anvendt til yderligere undersøgelse. Den molekylære masse af PFL (13883,7) bestemt af MALDI-TOF MS var i overensstemmelse med den beregnede masse (13881,1) fra den udledte aminosyresekvens og den anslåede værdi af mobilitet på SDS-PAGE.

Den udledte aminosyresekvens af PFL husede to homologe domæner, der hver består af de N- og C-terminale halvdele med 62% sekvensidentitet mellem dem. PFL udstillet høj sekvenshomologi til cyanobakteriel lektin OAA fra Oscillatoria agardhii
, rød alge lektin ESA-2 fra Eucheuma serra
, og bakteriel lektin MBHA fra Myxococcus xanthus
(Fig . 2B), som er et hidtil ukendt anti-HIV lectin familien. Den molekylære masse af PFL og OAA var ens, 13883,7 og 13924,1 henholdsvis og begge lectiner var sammensat af 132 aminosyrer. Både PFL og OAA har en fælles egenskab i sin sekvens dobbeltarbejde men OAA viser højere grad af intern sekvens identitet med 75% mellem de to gentagne domæner. I modsætning hertil er ESA-2 og MBHA består af fire tandem gentagne homologe domæner af 67 aminosyrer. Graden af ​​lighed mellem OAA ESA-2 og MBHA med PFL i deres N-terminale portioner (hver 132 rester) af aminosyresekvenserne var 62,1, 61,4 og 62,1% for identiske aminosyrer.

kulhydrat-bindende specificitet PFL

for at bestemme kulhydrat-bindende specificitet PFL blev glycan array analyse udføres på konsortiet for Funktionelle Glycomics hjælp trykt matrix-version 5.0. Af de 611 slags testede oligosaccharider, PFL (10 ug /ml) viste eksklusiv specificitet for højt mannoseindhold typen glycaner som vist i fig. 3. Hele liste over oligosaccharid testet og kan findes resultaterne online på (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp).

PFL stærkt bundet til M6 glycan (216 ) og M8 glycan (212), som begge har en udsat α1-3 Man on the D2 arm, med de tilsvarende niveauer af høje RFU værdier, 43471 og 40759, henholdsvis. I modsætning hertil maskering af denne α1-3 Mand med α1-2 Man dramatisk svækket interaktionen mellem PFL og glycaner. Dette var mest tydeligt ved en sammenligning af M6 glycan (216) og M7 glycan (211), hvor den yderligere α1-2 Man ved D2 arm faldt den bindingspotens omtrent til 53%. Tilsvarende blev bindende styrke af PFL til M9 glycan (213) faldt (RFU = 8535) i forhold til sin modpart M8 glycan (212) mangler D2 terminal α1-2 Man, viser kun 21% af styrken. Interessant, fjernelse af det reducerende terminal disaccharid, GlcNAc-GlcNAc højt mannoseindhold glycaner meget drastisk formindsket PFL-binding. For eksempel blev PFL bindingspotens næsten helt afskaffet til glykaner 316 og 317 ikke har nogen GlcNAc-GlcNAc-sekvens hvorimod dem modstykke glycaner 212 og 213, henholdsvis, udviste meget højere potens. Betydningen af ​​terminal GlcNAc-GlcNAc blev yderligere bekræftet ved sammenligning af glycaner 217 og 315, selv om omfanget af nedskrivninger på PFL-bindende var begrænset. Denne lektin var blottet for monosaccharid-bindende herunder mannose. Desuden har PFL ikke interagerer med Man α1-6 Man (314) og mannotriose (214), som er bestanddele af den forgrenede del af højt mannoseindhold glycaner. Pentasaccharidkerne af N-glycan (50) blev ikke genkendt af PFL men dens -fucosylerede modstykke (485), der vises svage vekselvirkning (RFU = 746). Disse oligosaccharid bindende profiler af PFL var nøje ligner dem af OAA, ESA-2 og KAA-2, der hører til en hidtil ukendt anti-HIV lectin familien i lavere organismer [4] -. [6]

Anti- influenza virus aktivitet af PFL

Anti-influenzavirus aktivitet PFL blev evalueret med to influenzavirus stammer, A /Udorn /72 (H3N2) og A ved NR farvestof optagelsen /Beijing /262/95 (H1N1) assay. PFL effektivt hæmmede cytopatisk effekt forårsaget af både influenza virusstammer, med EF _{50'erne på 19,4 ± 1,5 nM, og 4,5 ± 0,4 nM (fig. 4A). For at bekræfte at PFL inhiberede det indledende trin af influenzavirus indtræden i cellerne, blev fordelingen af ​​virale antigener i inficerede celler observeret i nærvær eller fravær af PFL hjælp immunofluorescensmikroskopi. Fig. 4B viser fordelingen af ​​det virale antigen efter 24 timer efter infektion med A /Udorn /72 detekteret ved specifikke anti-hæmagglutinin-antistof. PFL hæmmede effektivt influenzavirus indrejse i cellerne mens vira var i stand til at trænge ind og formere sig i værten celler i fravær af PFL. En galactose specifikke lektin PNA fra Arachis hypogaea
undladt at hæmme virus indrejse i cellerne. Disse resultater antyder tilstedeværelsen af ​​højt mannoseindhold glycaner på virus overfladen ved positionen kritisk for virus indtrængen i celler. For at teste, om PFL direkte ville binde til viral kappeglycoprotein HA, blev et ELISA-assay udført med kommercielt tilgængeligt præparat vaccine, som indeholder HA fra A /California /7/09 (H1N1), A /Victoria /210/09 (H3N2), og B /Brisbane /60/08 som en vigtig komponent. Som vist i fig. 4C, dosisafhængig binding af HA til PFL blev observeret.}

PFL induceret celledød af human mavekræft celle MKN28

In vitro
anti-tumor effekt af PFL på gastrisk cancer cell MKN28 blev evalueret ved traditionel MTS assay. Som vist i fig. 5A (venstre panel) viste PFL en dosisafhængig virkning på proliferation af MKN28 celle. Ved 72 timer efter PFL-behandling blev cellelevedygtighed faldt betydeligt ved doser på 0,5 uM eller højere. I modsætning hertil ved lave doser af 0,1-0,3 uM, celleproliferation var lidt stimuleret. PFL-induceret celledød af MKN28 celler blev ledsaget af et tab af celleadhæsion til bunden af ​​dyrkningspladen, som vist i fig. 5B hvor udkrængede klynge af celler blev observeret som brunlige linier. PFL-induceret celledød blev effektivt inhiberet i nærvær af gær mannan, et glycoprotein, der bærer oligosaccharider med højt mannoseindhold (fig. 5A, højre panel). Dette indikerer de højt mannoseindhold glycaner på MKN28 celler involvere i PFL-induceret cellesignalering der i sidste ende fører til celledød. I modsætning hertil normale humane hepatocytceller (ACBRI 3716) var relativt resistente over for PFL behandling sammenlignet med MKN28 celler (fig. 5A, venstre panel).

Isolering af PFL-bindende molekyle (r) på human gastrisk cancercellelinie MKN28

for at løse den molekylære mekanisme, ved hvilken PFL inducerer celledød af MKN28 celle, celleoverflademolekylet (er), som PFL bundet blev undersøgt. Biotinyleret PFL blev inkuberet i 2 timer med MKN28 celler og cellerne blev lyseret med RIPA-buffer indeholdende 0,1% SDS. Celleoverflademolekylet (er), som biotin-PFL bundne blev co-udfældet med avidinovertrukne perler. Proteinerne fanget på perler blev efterfølgende elueret med SDS-PAGE-prøvebuffer og analyseret på SDS-PAGE (fig. 6A). Selv blev opdaget flere ikke-specifikke bånd, observerede vi en 150 kDa bånd, som specifikt påvist i PFL behandlede fraktion. Dette bånd blev yderligere udsat for i-gel fordøjelse af trypsin efterfulgt af MALDI-TOF massespektrometrianalyse. De opnåede peptidmassefingeraftryk data (. Fig 6B) blev søgt efter database og proteinet blev identificeret som integrin α2, med sandsynligheden baserede snesevis af 57 (p < 0,05).

Cellulær lokalisering af eksogent tilsat PFL og integrin α2

De adfærd af PFL selv og integrin α2 ved behandling med PFL blev undersøgt ved hjælp af et konfokalt fluorescerende mikroskop. I dette eksperiment fluorescensmærket PFL (Alexa488-PFL) blev anvendt til at spore PFL lokalisering. En Alexa488-PFL blev inkuberet med MKN28 celler for 1, 5 og 24 timer ved doser på 30 ug /ml. Integrin- α2 blev påvist med anti-integrin α2 /CD49b monoklonalt antistof efterfulgt af Alexa568-konjugeret 2nd antistof. Interessant Alexa488-PFL bundet til celleoverfladen og indledte internalisering til cytoplasmaet inden for 1 h (fig. 7). Integrin α2 som overvejende blev lokaliseret på celleoverfladen ved steady state undergik også internalisering, og vigtigere, lokalisering af integrin α2 faldt sammen godt med PFL. Efter 5 timers inkubation, både PFL og integrin α2 blev co-lokaliseret og akkumuleres i perinukleær region og yderligere inkubation dybest set ændrede ikke placeringen af ​​begge proteiner. Det er derfor sandsynligt, at når PFL bundet til integrin α2, begge proteiner er aldrig blevet recirkuleret tilbage til celleoverfladen. Hurtig intracellulær handel med PFL-integrin α2 kompleks indtraf selv på kollagen I belagt dækglas (data ikke vist). Tilsvarende omfordeling af integrin α2 efter behandling med PFL blev observeret i en anden gastrisk cancercellelinie, GCIY, men ikke i normale humane hepatocytceller, ACBRI 3716 (fig. 8). I ACBRI 3716 celler, blev internalisering af PFL ikke observeret eventuelt ved den mindre ekspressionen af ​​integrin α2 på celleoverfladen.

Inddragelse af høj mannose glycaner på PFL-integrin α2 interaktion

For at teste, om cellulære omfordeling af integrin α2 forårsaget af PFL kan opstå fra en bestemt interaktion af PFL med højt mannoseindhold glycaner på integrin α2 molekyle, har vi vurderet effekten af ​​gær mannan på PFL-induceret integrin α2 internalisering hjælp MKN28 celler. I fravær af gær mannan, begge proteiner blev underkastet en omfattende internalisering (fig. 9A, øvre paneler). I modsætning hertil i nærværelse af gær mannan, PFL undladt at binde til celleoverfladen, og den efterfølgende intracellulær transport af PFL blev fuldstændigt ophævet (fig. 9A, nederst til højre). Acceptere denne observation, integrin α2 ændrede ikke dens lokalisering i nærvær af gær mannan (fig. 9A, nederst til venstre). Disse resultater viser tydeligt, at PFL bundet til integrin α2 gennem anerkendelse af høje mannose glycaner på integrin α2. For yderligere at bekræfte kravet om højt mannoseindhold glycaner for integrin α2 omfordeling, har vi testet effekten af ​​forskellige lektiner på cellulær lokalisering af integrin α2. Som vist i fig. 9B, andre lektiner med forskellige specificiteter såsom galactose-bindende PNA fra Arachis hypogaea
, fucose-bindende AOL fra Aspergillus oryzae
, sialsyre-bindende MAM fra Amur-Maackia
, D-GlcNAc-bindende UDA fra stor nælde
påvirkede ikke placeringen af ​​integrin α2. Interessant, selv høj mannose bindende lektiner såsom en enkimbladet mannose (Man) -bindende lektin, GNA fra almindelig vintergæk
viste ikke nogen signifikant ændring på integrin α2. I modsætning hertil høj mannose bindende bælgplanter lectin ConcanavalinA (ConA) forvrænget arrangementet af integrin α2 ligesom PFL gjorde.

Diskussion

I denne undersøgelse har vi vurderet den biologiske aktivitet af romanen bakteriel lektin PFL fra P. fluorescens
Pf0-1, der hører til de seneste fundet anti-HIV lektin familie i lavere organismer. Forekomst af stigende lægemiddelresistente influenzavirusstammer samt nye højpatogene virusstammer såsom aviær H5N1 førte os til at udforske PFL som et nyt anti-influenza middel. PFL viste kraftig anti-influenzavirus aktivitet og den mekanisme, hvormed PFL inhiberede virusreplikation var inhibering af det indledende trin af virus indtrængen i celler. Det er mest sandsynligt, at PFL udøvede anti-influenza-aktivitet ved selektiv binding til højt mannoseindhold glycaner på viruskappen HA, som påvist i ELISA [9] assay. Faktisk har stedspecifik forekomst af oligosaccharid med højt mannoseindhold vist ved området af HA nær receptorbindingsstedet [10].

At udforske antitumorvirkning af PFL anvendte vi human gastrisk cancercellelinie MKN28 som er stammer fra et moderat differentieret intestinal typen tumor. Den røde alge lektin ESA-2, som hører til den samme lektin familie med PFL udstillet anti-tumor effekt både in vitro
in vivo
[7], [8]. ESA-2 er et protein afledt af den spiselige tang og forventes at udøve antitumor-effekt på gastrointestinal cancer-tarmkanalen ved oral administration. Det er bemærkelsesværdigt, at PFL fremmet celledød af MKN28 celle, udelukkende gennem en anerkendelse af højt mannoseindhold glycaner på integrin α2-molekyle, som overvejende er placeret på celleoverfladen ved steady state.

• PLoS ONE: honokiol inducerer Calpain-medieret glukose-regulerede Protein-94 spaltning og apoptose i Human Gastric Cancer Cells og Reducerer Tumor Growth
• Typer af mavekræft