PLoS ONE: Aukštas manozės įrišimas Antivirusinis lėktino PFL iš Pseudomonas fluorescens Pf0-1 Skatina ląstelių mirtis skrandžio vėžio ląstelių MKN28 per Sąveika su α2-Integrin

Anotacija

Naujų anti-ŽIV lėktino šeimos, kuri rodo, griežtas specifiškai rišanti aukštos manozės glikanų buvo nustatyta, mažesnes organizmų. Bakterijų orthologue buvo nustatytas į genomo Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 ir genų kodavimo tariamą lėktino buvo klonuotas, išreikštas Escherichia coli parsisiųsti ir išgrynintas vienas žingsnis gelfiltraciją. Glikaną masyvo atranka rekombinantinio lėktino, vadinama PFL, parodė, kad PFL pirmenybė pripažįsta aukšti manozės glikanų su α1-3 žmogus, kuris buvo labai veikiamas D2 padėtį. Priešingai, maskavimo šio α1-3 Man su α1-2 Man žymiai sutrikusio lėktino angliavandenių sąveiką. Sumažinti terminalo disacharidą, GlcNAc-GlcNAc aukštų manozės glikanus taip pat buvo labai svarbus PFL-privalomas. PFL parodė stiprus anti-gripo viruso aktyvumą slopina viruso patekimą į ląsteles dozių mažo nanomoliniu koncentracijos. Tuo mikromolių koncentracijos arba didesnis, PFL parodė citotoksiškumo palydovams praradimą ląstelių sukibimą su žmogaus skrandžio vėžio MKN28 ląsteles. Ląstelės paviršiaus molekulė, kuriai PFL privalo buvo bendrai nusodinti biotinu žymėto PFL ir identifikuoti kaip integrino α2 peptidų masinio pirštų atspaudų naudojant MALDI-TOF masės spektrometrija. Įdomu, nuo gydymo egzogeninės PFL, integrinu α2 ant ląstelės paviršiaus patyrė sparčią internalizavimo į citoplazmą ir sukaupta perinuklearinę regione, kartu su surištu PFL. Gautas nuostolis ląstelių laikytis sukeltų signalizacijos kelią, kad sukeltas anoikis-kaip ląstelių žūtį. Šie įvykiai buvo efektyviai slopina parengiamojo apdorojimo PFL su mannnan, nurodant aukštų manozės glikanus dalyvavimą ant PFL sukelta ląstelių žūtį, kuris buvo paskatino PFL-integrino α2 sąveikos

nurodomoji dalis:. Sato Y Morimoto K Kubo T Yanagihara K Seyama T "(2012) Aukšto manozės įrišimas Antivirusinis lėktino PFL iš , Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 Skatina ląstelių mirtis skrandžio vėžio ląstelių MKN28 per Sąveika su α2-integrino. PLoS vieną iš 7 (9): e45922. Doi: 10,1371 /journal.pone.0045922

redaktorius: Rogeris Chammas, Universidade de São Paulo, Brazilija

Įstojo: Gegužės 7, 2012; Priimtas rugpjūčio 27, 2012 m Paskelbta rugsėjo 20, 2012

Visos teisės saugomos: © Sato et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis tyrimas buvo iš dalies remiamą dotacijos-in-pagalbos jaunųjų mokslininkų (b) nuo Japonijos visuomenė mokslo skatinimo (JSP) (dotacijos skaičius 24.790.101). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Aukšta manozės privalomas lektinai, kurie skirti konkrečioms glikanų ant viruso paviršiaus žada galimas virusinių-nukenksminti agentų, kurie galėtų būti naudojami prevencijos ir kontrolės virusinių infekcijų [1], [2]. Daugybė lektinai, specifiškai atpažįstantys aukštus manozės glikanų randama iš įvairių taksonomijos įskaitant bakterijų, dumblių, augalų ir gyvūnų, ir kai kurie iš jų buvo įrodyta, kad eksponuoti kovos su ŽIV veiklą [3]. Mes neseniai rado romaną kovos su ŽIV lektinų šeimą platinamas mažesnių organizmų, įskaitant bakterijų, melsvadumblių ir jūros dumblių [4]. Jie pasižymi bendromis savybėmis, pavyzdžiui, seka dauginimasis labai konservatyvia N-galo domeno ir išskirtinių aukštos manozės oligosacharidais pripažinimo. Kai Šiame lektinai pavyzdžiui, melsvadumblių aviacijos erdvė nuo Oscillatoria agardhii
[4] ir raudona dumblių EKA-2 iš Eucheuma Serra
[5] parodė, slopina ŽIV patekimas į šeimininko ląsteles su EB _{50s mažo nanomoliniu diapazone tiesiogiai jungiasi su voko gp120. Be to, raudona dumblių lėktino KAA-2 iš Kappaphycus alvarezii pervežimas, kuri taip pat priklauso šiai šeimai slopina infekcijos įvairių gripo viruso atmainų su EB 50s žemos nanomoliarindse lygių in a kamieno nepriklausomas būdu, per iš aukštos manozė oligosacharido pripažinimo virusinė apvalkalo baltymus hemagliutinino (HA) [6].}

Be stiprus antivirusinis aktyvumas, EKA-2 rodo įvairių biologinių veikla, pavyzdžiui, mitogeninę aktyvumui pele ir žmogaus limfocitai ir in vitro
augimo slopinimo vėžinių ląstelių [7], [8]. Nors biologinės savybės šio lėktino šeimos tampa aišku, kad šios bakterijos orthologues iš savybių, Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 ir Herpetosiphon aurantiacus
dar reikia patikslinti.

Šiame tyrime mes klonuotas į orthologue lektinų geną iš P. fluorescens
Pf0-1 ir koduojami lėktino baltymų (PFL) buvo išreikšta Escherichia coli
. Funkcinis PFL buvo sėkmingai išgrynintas didelėmis išeigomis ir besiskiriantis tuo, atsižvelgiant į jo biologiniu aktyvumu, kai, pavyzdžiui, antivirusinis ir jų priešnavikinis poveikis. Kaip prognozuojama nuo intensyvios struktūrinio panašumo PFL su kitais nariais šios lėktino šeima, PFL eksponuojami išskirtinę specifiką aukštos manozė oligosacharido ir stiprus antivirusinis aktyvumas prieš gripo virusų. Be to, PFL sukeltas anoikis-kaip ląstelių žūtį skrandžio vėžio ląstelių MKN28 per sąveikos su ląstelės paviršiaus integrino α2.

Medžiagos ir metodai

Medžiagos

Stab kultūra, p fluorescens
Pf0-1 buvo dosniai jeigu Dr Mark W. Silby (University of Massachusetts Dartmouth, JAV). Gripo virusai ir Madin-Darby šunų inkstų (MDCK) ląstelės buvo dosniai jeigu Dr. T. Sakaguchi (Hirosimos universiteto, Japonija): gripo virusai buvo auginami chorioalantojo skystyje 10 dienų senumo vištienos kiaušinių. MDCK ląstelės buvo auginamos Dulbecco modifikuota Eagle terpė (DMEM), papildytoje 10% vaisiaus galvijų serumo ir penicilino-streptomicino deriniai. Skrandžio vėžio ląstelių linija, MKN28 buvo maloniai pateikė prof Suzuki (Fukušimos medicinos universitetas, Fukušimos, Japonija). Ląstelių linija, buvo palikta RPMI-1640 terpėje (GIBCO, Grand Island, NY), papildytoje su 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS, GIBCO), 100 TV /ml penicilino G natrio druska, ir 100 mg /ml streptomicino sulfato. Kitą skrandžio vėžys ląstelių linija, GCIY, pirktas iš RIKEN ląstelių banko (Ibaraki, Japonija) ir palaikoma tuo pačiu būdu, kaip aprašyta aukščiau. Pirminis normalus žmogaus hepatocitų ląstelių (ACBRI 3716) buvo įsigytas iš DS Pharma biomedicininių (Osaka, Japonija) ir prižiūrimi CS-C vidutinio komplektas R (DS Pharma Biomedicininių).

hemagliutinacijos Analizės

tirtas atliekant hemagliutinacijos tyrimas buvo vykdomas, naudojant 2% (v /v) suspensiją tripsino gydytų triušių eritrocitų, kaip aprašyta anksčiau [9]. Trumpai, triušių gimtoji eritrocitų suspensija buvo gydomi 0,5% tripsino fiziologiniame tirpale, ir mišinys inkubuojamas 37 ° C temperatūroje 60 min. Po plovimo su fiziologiniu tirpalu, 2% tripsino gydytų eritrocitų suspensija buvo paruošti fiziologiniame tirpale. Hemagliutinacijos veikla buvo išreikštas titras, aukščiausio 2 kartus praskiedus, pasižymintys teigiamą hemagliutinacijos abipusė.

Genų klonavimas ir išraiška lėktino PFL

genomo DNR iš P. fluorescens
Pf0-1 buvo naudojamas kaip genų klonavimas PFL geno šabloną. Ne pirma, oligonukleotidas pradmenų rinkinio, 5'-GGCAGGTCTCCCGAAACTTCAAG-3 'ir 5'-AGTCGAACGCCTGAACCTGTTGA-3', kuris hibridizuoti su prieš srovę ir pasroviui nuo PFL koduojančios srities, atitinkamai, buvo naudojami, ir PGR buvo atliekama naudojant Ryškiausia renginio žvaigžde DNR polimerazė (TAKARA). Naudojant sustiprintą PCR fragmentą kaip šabloną, paskesnis PGR buvo atliekama kartu su į priekį gruntas, 5'-CACCATGTCTAAATACGCAGTGGCA-3 ', kuris turėjo CACC papildomą seka, skirta pateikti ATG pradžios kodono PFL geno, ir atbulinės eigos gruntas, 5'-TTACTCTATCTGCCCACGGAAG -3 '(TTA; atitinkantis sustabdyti kodoną RFL geno). Amlifikuoti fragmentai buvo susiūta į pET101 /D-TOPO ekspresijos vektorių. Rekombinantinis plazmidės buvo pertvarkyta į Escherichia coli
top10 ląsteles (Invitrogen). Gautos rekombinantinės klonai buvo patvirtinta, kad teisingas konstruktas pagal DNR sekos. Funkciniai klonai buvo transformuota , Escherichia coli
BL21 Star (DE3) ląstelių indukuojamo išraiška PFL geno. IPTG su kad galutinė koncentracija būtų 0,8 mM buvo pridėta į transformuotos kultūroje, kad būtų sukelti PFL išraiška. Po to, kai 6 h inkubacijos 37 ° C temperatūroje, ląstelės buvo surenkamos centrifuguojant 8000 apsisukimų per minutę 20 min.

gryninimas lektinų PFL

nuimami bakterinės ląstelės buvo resuspenduotos 20 mM fosfato buferio ( pH 7,0), kurių sudėtyje yra 0.15 M NaCl (PBS) ir buvo suardomos ultragarsu. Po centrifugavimo 8000 rpm 20 min, kad, virš nuosėdų alikvotinė buvo atliktas Superose 12 kolonėlė (GE Healthcare) Pusiausvyrą su PBS. Kolonėlė eliuuojama su PBS esant srauto greičiui esant maždaug 0,8 ml /min AN izokratinis režimu. Eliuatas buvo stebimas pagal absorbcijos bangos ilgiui 280 nm ir tikrinama, ar hemagliutinacija veiklos, ir veikliosios frakcijos sujungiamos.

molekulinė masė nustatymas PFL

molekulinė masė PFL buvo nustatomas pagal MALDI-TOF VN analizė su Autoflex masės spektrometru (Bruker, Japonija) po kalibravimo su peptidas masė standartinės Kit (Bruker, Japonija), naudojant sinapinic rūgštį kaip matrica.

DNR sekos analizė

nukleotidų sekos lėmė dideoksi grandinės terminatoriaus metodu, naudojant BigDye Terminatorius versija 3.1 Cycle Sequencing rinkinį (Applied BIOSYSTEMS). DNR sekos buvo atliktas naudojant ABI 310 Genetinis analizatorius (taikomoji BIOSYSTEMS).

glikaną masyvo analizė

PFL buvo paženklinti Alexa Fluor 488 pagal gamintojo nurodymus (Invitrogen, Eugene, OR). Glikaną privalomas specifiškumas PFL nulėmė spausdintų glikaną mikrogardelių (versija 5.0) pagal standartinę procedūrą CoreH konsorciumo funkciniam Glycomics (CFG) (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp~~HEAD=pobj ). Vidutinis santykinis fluorescencijos kartotinių iš šešių buvo apskaičiuojamas vidutiniškai keturių verčių nuėmus aukščiausius ir mažiausias reikšmes pašalinti kai kuriuos klaidingus hitai su labai aukštos arba žemos kiekis. Klaidų barai atstovauti standartinė paklaida vidurkio (SEM) ir% CV variacijos (SD /vidutinis), apskaičiuotas kaip% koeficientas.

Anti-Gripo aktyvumas PFL

in vitro
kovos gripo aktyvumas PFL nulėmė neutrali raudona (NR) dažų sunaudojimo analizę. Įvairios koncentracijos PFL buvo paruoštas su DMEM, kurių sudėtyje yra 10 mikrogramai /ml tripsinas yra 96 ​​šulinėlių mikroplokštelę. Į kiekvieną šulinėlį, virusas buvo įtraukta kaip infekcijos maždaug 0,001 infekcinių dalelių vienoje ląstelėje darinys. Po to, kai inkubuojant 37 ° C temperatūroje 48 h, 100 pL NR dažų (150 mkg /ml DMEM) buvo pridėta ir toliau inkubuojami 2 h. NR dažų įtrauktas į ląsteles buvo ekstrahuojamas naudojant 100 pL 1% acto rūgšties /50% etanolio. Šuliniai buvo matuojamas 540 nm mikroplokštelių skaitytuvas (1420 multilabel skaitiklis, PERKINELMER, MA, JAV), kaip išgyventi nuo viruso citopatinio poveikio faktorius.

IMUNOFLUORESCENCIJOS mikroskopija

imunofluorescenciniam buvo atliekama siekiant vizualizuoti įvežimo slopina gripo viruso pagal PFL. Trumpai, MDCK ląstelės auginamos padengti stiklo, buvo infekuoti A /Udorn /72, esant infekcijos maždaug 0,001 infekcinių dalelių vienoje ląstelėje darinys, į buvimo ar nebuvimo 200 nM PFL DMEM, kurių sudėtyje yra 10 g /ml tripsino. Po to, kai 24 valandas po infekcijos, infekuotų ląstelių buvo nustatyti su 80% acetono 5 min. Taip plovimo su PBS, ląstelės buvo inkubuojamos su pelių monokloninius kovos su HA antikūnų (HyTest, Turku, Suomija), esant 37 ° C temperatūroje 1 val. Po plovimo su PBS, ląstelės buvo inkubuojamos su fluoresceino izotiocianatu (FITC) konjuguoto ožkos anti-pelės IgG antikūnų (Anticorps Secondaires, Compiègne, Prancūzija), esant 37 ° C temperatūroje 1 val. Po tolesnio PBS plovimo, ląstelės buvo sumontuoti naudojant Vectashield su 4 ", 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ir buvo stebima fluorescencija mikroskopu (OLYMPUS BX51, Olympus, Japonija).

IFA

Tiesioginis sąveika PFL su virusinės apvalkalo baltymus HA buvo tiriami naudojant fermentais susijusį immnosorbent analize (ELISA). PFL (5 mikrogramų /ml) karbonatas buferio (pH 9,6) buvo padengta 96 bei ELISA plokštelės (BD biomokslai, Bedford, MA). Šulinius, tris kartus buvo plaunamos PBS, kurių sudėtyje yra 0,1% Tween20 (PBST) ir užblokuotas su 3% lieso pieno 37 ° C temperatūroje 1 val. Po plovimo su PBST, įvairių koncentracijų tipo gripo viruso HA vakcinos gamybai (Astellas, Tokijas, Japonija) buvo pridėta į kiekvieną šulinėlį ir inkubuojamos 37 ° C temperatūroje 1 val. Po plovimo su PBST, šulinius, buvo inkubuojamos su pelės anti-HA monokloninis antikūnas (HyTest) 37 ° C temperatūroje 1 valandą, o po to inkubacijos su krieno peroksidaze (HRP) konjuguoto ožkos anti-pelės IgG antikūną ( "GE Healthcare, Jungtinė Karalystė ) 37 ° C temperatūroje 1 valandą, o. Vėliau 3,3 ', 5,5'-buvo įtraukta tetramethylbenzidine (TKK) substratas (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MI). Reakcija buvo sustabdytas naudojant TMB langelio reagento (Sigma-Aldrich) ir absorbcija 450 nm buvo matuojamas naudojant microplate skaitytuvas (1420 multilabel skaitiklis PERKINELMER).

naviko ląstelių proliferaciją iki MTS bandymo

ląstelių proliferacija buvo įvertintas įprastiniu MTS tyrimą naudojant CellTiter 96 ląstelių proliferaciją bandymo (Promega, Madison, WI). Ląstelės sėklomis dėl 96 šulinėlių mikroplokštelę buvo inkubuojamos 72 h su įvairios koncentracijos PFL į tinkamoje terpėje su 10% FBS. Po to ląstelės buvo inkubuojamos su 20 pL MTS reagentu 1 valandą, o esant 37 ° C ir matuojamas su mikroplokštelės skaitytuvą (1420 multilabel skaitiklis, PerkinElmer), esant 490 nm bangos ilgiui. Mielių manano poveikis cytotoxity iš PFL buvo nustatomas pagal ląstelės inkubuojamos su 5 mkm PFL įvairių koncentracijos mielių manano buvimo RPMI 1640 su 10% FBS už 72 h, ir ląstelių gyvybingumas buvo matuojamas kaip aprašyta aukščiau.

išskyrimas PFL rišančioji molekulė (-os) MKN28 ląstelių

PFL buvo paženklinti biotinas naudojant biotinas ženklinimo rinkinį (Dojindo molekulinius technologijas, Japonija) pagal gamybos instrukcijas. Norėdami susiliejantis MKN28 ląsteles dangtelis apatinukai, biotinilinta-PFL (200 mikrogramų) buvo pridėta ir inkubuojami 2 val kambario temperatūroje. Po plovimo su šaltu PBS, ląstelės buvo nubraukiamas ir lizuojamos 800 pL Ripa buferiniu tirpalu (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P40, 0,5% natrio deoksicholato, proteazių inhibitorius kokteilio, 0,1% SDS ). Vėliau, 100 pL biotinas-surinkimo avidino karoliukų (Adarā Biotech, Izraelis) buvo pridėta prie ląstelių lizato ir inkubuojami per naktį 4 ° C su švelnaus. Granulės tris kartus buvo plaunamos su 50 mM Tris-HCl, pH 7,5. Sugautus baltymai apie karoliukų buvo eliuojami 50 pL SDS-PAGE pavyzdžių buferio (62,5 mM Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerolio, 1% merkaptoetanolio, 0,003% bromfenolio mėlyna) 15 min 90 ° C temperatūroje ir veikiamas SDS-PAGE. Baltymų juosta specifinis PFL gydymo frakcija buvo analizuojami MALDI-TOF MS po in-gelis virškinimo su tripsino. Trumpai tariant, CBB tamsintas baltymų juostos buvo iškirpti ir destained su 25 mm amonio bikarbonatas, kurių sudėtyje yra 50% acetonitrilo. Redukcinis alkilinimo buvo atliktas su 50 mm TCEP (Tris [2-karboksietilo] fosfino) 25 mM amonio hidrokarbonato, po inkubacijos su 50 mm iodoacetoamide 1 val. Po dehidratacijos su acetonitrilo, į gelio baltymas suvirškinamas 10 įxL TPCK-tripsino (100 mikrogramų /ml) 50 mm amonio hidrokarbonato. Virškinimo buvo išvalytas su "Zip galiuko (miliporų, Japonija) ir pastebėjo ant MALDI taikinį. Vienas mikrol, iš matricos tirpalo (α-ciano-4-hydroxycinnapic rūgšties matricos [Bruker, Japonija] acetone-etanolio [01:02]) buvo po to pridedama į vietą. MALDI-masių spektrometras analizė buvo atlikta kurį Autoflex masės spektrometru (Bruker, Japonija) po to, kai kalibravimo su peptido masės standartinio rinkinio (Bruker, Japonija). Peptidas masė pirštu spausdinimas duomenys buvo ieškoma pagal Mascot programinė įranga (Matrica mokslo, Japonija).

Mobilieji lokalizacija PFL ir integrinu α2

MKN28 ląstelės buvo auginamos ant coverslips į 6 šulinėlių plokštelės , Auginti coverslips ląstelės buvo gydomi 30 mikrogramų /ml, Alexa488 konjuguoto-PFL į RPMI 1640 ir inkubuojami skirtingais laikotarpiais. Po plovimo su PBS, ląstelės buvo nustatyti su 80% acetono 5 min. Taip plovimo su PBS, ląstelės buvo inkubuojamos su pelės monokloninis anti-integrino α2 /CD49b antikūno (R & D Systems, MN) 37 ° C temperatūroje 1 val. Po plovimo su PBS, ląstelės buvo inkubuojamos su Alexa568-konjuguoto ožkos anti-pelės IgG antikūnų (Life "technologijas, Japonija), esant 37 ° C temperatūroje 1 val. Po tolesnio PBS plovimo, ląstelės buvo sumontuoti naudojant Vectashield su DAPI (Vector Laboratories) ir buvo stebima confocal skenavimo lazeriu mikroskopu (IX70; Olympus, Japonija). Pasitelkus kitą skrandžio vėžio ląstelių linijos GCIY ir normalus žmogaus hepatocitų ląsteles ACBRI 3716, mobilieji lokalizacijos integrinų α2 ir Alexa488-PFL buvo nagrinėjami tuo pačiu būdu, kaip aprašyta aukščiau, ir stebima fluorescencija mikroskopu (OLYMPUS BX51). Mielių manano poveikis ląstelių lokalizacijos PFL ir integrinų α2 buvo įvertintas taip. Susiliejantis MKN28 ląstelės auginamos coverslips į 6-šulinėlių plokštelės buvo gydomi nuo Alexa488-PFL 20 mikrogramų /ml RPMI 1640 į buvimo ar nebuvimo 700 mikrogramų /ml mielių manano 4 h. Ląstelės buvo fiksuota, ryškinamos naudojant anti-integrino α2 /CD49b antikūnus, kaip aprašyta aukščiau, ir stebima fluorescencija mikroskopu (OLYMPUS BX51). Poveikis įvairių lectins apie mobiliojo ryšio lokalizacijos integrino α2 buvo nagrinėjama panašiu būdu, inkubuojant MKN28 ląsteles kiekvieno lėktino į RPMI 1640 20 mikrogramai /ml 4 val.

Rezultatai

Molekulinė klonavimas, išraiška ir valymas PFL

Mes jau anksčiau nustatė, kad p genomą. fluorescens
Pf0-1 yra galimas homologą anti-ŽIV lėktino šeimos, kuri neseniai buvo rastas mažesnes organizmams, įskaitant bakterijų, melsvadumblių ir jūros dumblių [4]. Remiantis nukleotidų sekos hipotetinis lėktino iš P. fluorescens
Pf0-1 duomenų bazėje, gruntas rinkiniai buvo sukurta siekiant sustiprinti su lektinų geną. Spėjamas lėktino genas buvo sėkmingai klonuotas krypties TOPO klonavimo sistemą ir kodavimo baltymas heterologously išreikštas E. coli
BL21 (DE3). Išreikštas lektino baltymas gryninamas homogeniškumą pagal vieną žingsnis gelfiltracijos Superose stulpelio 12 (Fig. 1A). Veiklioji piko su hemagliutinacija veiklos davė vieną baltymų juosta 13 kDa ant SDS-PAGE (1B pav.). Galiausiai, nuo 1 vada El. buvo gautas coli
kultūra, didelis derlius išgryninto lėktino (240 mg). Išvalytas lėktino buvo pavadintas PFL ir naudojamas tolesniam tyrimui. Molekulinė masė PFL (13883,7) nustatomas pagal MALDI-TOF MS buvo susitarusi su apskaičiuotu masė (13881.1) nuo išvesta aminorūgščių sekoje ir kad sąmatinė vertė pagal mobilumo apie SDS-PAGE.

išvadą amino rūgščių seka PFL harbored du homologines sritis, kurių kiekvienas susideda iš N-ir C-terminalo pusių su 62% sekos identiškumą tarp jų. PFL eksponuojami Homologija į melsvadumblių lėktino aviacijos erdvė iš Oscillatoria agardhii
, raudona dumblių lėktino EKA-2 iš Eucheuma Serra
ir bakterijų lėktino MBHA iš Myxococcus Xanthus
(pav . 2B), kuris yra nauji kovos su ŽIV lektinų šeimą. Molekulinė masė PFL ir aviacijos erdvė buvo panašus, 13883,7 ir 13924,1, atitinkamai, ir abi lektinų buvo sudarytas iš 132 amino rūgščių. Tiek PFL ir aviacijos erdvė turi bendrą nuosavybę savo sekos dubliavimo, bet aviacijos erdvė rodo didesnį vidaus sekos identiškumą su 75% tarp dviejų pakartotinių srityse. Priešingai, EP-2 ir MBHA yra sudarytas iš keturių tandemiškai pakartotinių homologinių sričių 67 amino rūgščių. Panašumo aviacijos erdvė laipsnių, EK-2 ir MBHA su PFL, esantys jų N-terminalas porcijomis (kiekvienas 132 liekanos) iš aminorūgščių sekų buvo 62,1, 61,4, ir 62,1% už tokius pačius amino rūgščių, atitinkamai.

Angliavandeniai-privalomas specifiškumas PFL

Norėdami nustatyti angliavandenių privalomas specifiškumą PFL, glikaną masyvo analizė buvo atlikta konsorciumo funkciniam Glycomics naudojant spausdintą masyvo versija 5.0. Iš 611 rūšių tirtų oligosacharidų, PFL (10 mikrogramai /ml) parodė, išskirtinį specifiškumą aukštos manozės tipo glikanų, kaip parodyta Fig. 3. Visas sąrašas su oligosacharidais išbandė ir rezultatus galima rasti internete adresu (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp).

PFL stipriai susijungęs su M6 glikano (216 ) ir M8 glikaną (212), iš kurių abu turi veikiamo α1-3 žmogus D2 rankos, su panašaus lygio aukštųjų RFU vertybių, 43471 ir 40759, atitinkamai. Priešingai, maskavimo šio α1-3 Man su α1-2 Man žymiai sumažėja tarp PFL ir glikanus sąveiką. Tai buvo labiausiai akivaizdus pagal M6 glikano (216) ir M7 glikano (211), kur papildomas α1-2 Žmogus ne D2 rankos sumažėjo privalomas stiprumas maždaug 53%, palyginti. Be to, privalomas stiprumas PFL į M9 glikano (213) buvo sumažėjęs (RFU = 8535), palyginti su jo kolega M8 glikaną (212) trūksta D2 terminalo α1-2 vyras, rodantis tik 21% potenciją. Įdomu tai, kad pašalinimas redukcinės terminalo disacharido, GlcNAc-GlcNAc aukštų manozės glikanus daug drastiškai sumažėjo PFL-privalomas. Pavyzdžiui, PFL privalomas stiprumas buvo beveik visiškai panaikino į glikanus 316 ir 317, neturinčių GlcNAc-GlcNAc seka o tie kolega glikanų 212 ir 213 atitinkamai eksponuojama daug didesnę potenciją. Iš terminalo GlcNAc-GlcNAc svarba taip pat patvirtina ir glikanus 217 315 ​​Palyginimui, nors vertės sumažėjimo PFL-privalomas apimtis buvo ribota. Tai lėktino nesukėlė sacharidams surišančio įskaitant manozQ. Be to, PFL nebuvo bendrauti su žmogumi α1-6 Man (314) ir mannotriose (214), kurie sudedamosios šakotas dalis aukštųjų manozės glikanus. Pentasacharidas šerdis N-glikaną (50) nebuvo pripažintas PFL bet jos fucosylated kolega (485) rodomas silpna sąveika (RFU = 746). Šie oligosacharidai įrišimo profiliai PFL buvo glaudžiai panašūs į aviacijos erdvė, EKA-2 ir KAA-2, kad priklauso naują anti-ŽIV lėktino šeimos apatinių organizmų [4] - [6].

kovos gripo viruso aktyvumas PFL

Anti-gripo virusas veikla PFL buvo įvertintas dviem gripo virusų padermių, A /Udorn /72 (H3N2) ir A /Pekinas /262/95 straipsnis (H1N1) pagal NR dažų įsisavinimą tyrimas. PFL efektyviai slopino citopatinis poveikis sukelia tiek gripo viruso štamai, su EB _{50s 19,4 ± 1,5 cm, ir 4,5 ± 0,4 cm, atitinkamai (pav. 4A). Patvirtinti, kad PFL slopina pirmas žingsnis gripo viruso patekimo į ląsteles, buvo pastebėta, paskirstymas virusinių antigenų užkrėstų ląstelių buvimo ar nebuvimo PFL naudojant imunofluorescencinį mikroskopijos. Pav. 4B rodo pasiskirstymą viruso antigeno po 24 h po užsikrėtimo A /Udorn /72 aptiktą specialų kovos su hemagliutinino antikūnų. PFL efektyviai slopinamas gripo viruso patekti į ląstelių kadangi virusai pasižymi gali prasiskverbti ir pasidaugina ląstelių-šeimininkių į PFL nesant. Galaktozės specifinis lėktino PNA iš , Arachis hypogaea
nepavyko slopina virusų patekimą į ląsteles. Šie rezultatai rodo, kad aukštos manozės glikanų buvimą viruso paviršiaus T padėtyje, kritinės viruso patekimo į ląsteles. Norėdami patikrinti, ar PFL tiesiogiai jungiasi prie virusinės apvalkalo baltymus HA, ELISA tyrimas buvo atliktas su komerciniu vakcina preparato sudėtyje yra HA, gauto iš A /California /7/09 (H1N1), A /Victoria /210/09 (H3N2), ir B /Brisbane /60/08 kaip pagrindinis komponentas. Kaip parodyta Fig. 4C, buvo pastebėtas nuo dozės priklausomas privalomas ha iki PFL.}

PFL sukelta ląstelių mirtis žmogaus skrandžio vėžio ląstelių MKN28

In vitro pervežimas priešnavikinis poveikis PFL apie skrandžio vėžio ląstelių MKN28 buvo įvertintas įprastiniu MTS tyrimu. Kaip parodyta Fig. 5A (kairėje skydelis), PFL parodė dozės priklausomą poveikį MKN28 ląstelių proliferaciją. 72 h po PFL-gydymo, ląstelių gyvybingumas buvo gerokai sumažėjo dozėmis 0,5 mikromolių arba didesnis. Priešingai, ne mažomis dozėmis 0,1-0,3 mikromolių, ląstelių proliferacija buvo šiek tiek stimuliuojama. PFL-sukeltas ląstelių mirtis MKN28 ląstelių buvo kartu su ląstelių sukibimą nuostolių kultūros lėkštelės dugną, kaip parodyta Fig. 5B, kur everted klasteris ląstelių buvo pastebėtas kaip rusvos linijas. PFL sukelta ląstelių mirtis buvo efektyviai slopinamas mielių manano, glikoproteino guolis aukštus manozės oligosacharidai (. 5A pav, tiesa skydelio) buvimą. Tai rodo aukštus manozės glikanų apie MKN28 ląstelių įtraukti į PFL sukelta ląstelių signalizacijos, kad galiausiai vedantis į mobiliuosius mirtį. Priešingai, normali žmogaus hepatocitų ląstelių (ACBRI 3716) buvo gana atsparus PFL gydymui, palyginus su MKN28 ląstelių (. 5A pav, kairė skydo).

išskyrimas PFL-rišančioji molekulė (-ų) žmogaus skrandžio vėžio ląstelių MKN28

Jei spręsti molekulinę sistemą, pagal kurią PFL indukuoja ląstelių mirtį MKN28 ląstelių, ląstelės paviršiaus molekulė (-ai), į kurį buvo ištirtas PFL įsipareigoti. Biotinilinto PFL buvo inkubuojami 2 h su MKN28 ląstelės ir ląstelės buvo lizuojamos Ripa buferio, kurio sudėtyje yra 0,1% SDS. Ląstelės paviršiaus molekulė (-ai), į kurį biotinas-PFL Rasta susijusių buvo bendrai nusodinamas avidino dengtos granulėmis. Įstrigusių ant granulių baltymai vėliau buvo eliuojami SDS-PAGE pavyzdžių buferio ir analizuojama SDS-PAGE (6A pav.). Nors buvo aptikta keletas nespecifiniai juostos, mes nustatėme, 150 kDa juostoje, kuri specialiai aptikta PFL elgiamasi frakcija. Ši grupė buvo labiau atlikti in-gelis virškinimo tripsino po MALDI-TOF masės spektrometrijos analizei. Gautą peptidų masė atspaudus duomenis (. 6B pav) buvo ieškoma duomenų bazėje ir baltymų buvo nustatyta, integrino α2, su tikimybių pagrindu balai iš 57 (p < 0,05).

Mobilieji lokalizacija išoriškai pridūrė PFL ir integrino α2

išnagrinėjo pačios PFL ir integrinų α2 ant gydymo PFL elgesys naudojant confocal fluorescencinis mikroskopas. Šiame eksperimente, fluorescencinė žymėto PFL (Alexa488-PFL) buvo naudojama stebėti PFL lokalizacija. Alexa488-PFL buvo inkubuojami su MKN28 ląstelių už 1, 5 ir 24 h dozėmis 30 mikrogramų /ml. Integrino α2 buvo aptikta su anti-integrino α2 /CD49b monokloninis antikūnas po Alexa568 konjuguoto 2nd antikūnų. Įdomu tai, kad Alexa488-PFL jungiasi su ląstelės paviršiaus ir inicijavo internalizaciją į citoplazmą per 1 valandą (7 pav.). Integrino α2, kuri buvo daugiausia lokalizuojasi ant ląstelių paviršiaus, esant pastoviai taip pat buvo internalizavimo ir svarbiau, kad integrinų α2 lokalizacija gerai sutapo su PFL. Po 5 h inkubacijos tiek PFL ir integrino α2 buvo bendrai lokalizuota ir sukaupta perinuklearinę regione ir toliau inkubacijos iš esmės nepakeitė tiek baltymais vietą. Todėl yra tikimybė, kad kai PFL privalo integrinu α2, abu baltymai niekada nebuvo vėl perdirbama į ląstelės paviršiaus. Greitas ląstelėje prekyba PFL-integrinų α2 komplekso įvyko net kolageno Aš dengtos padengti lapeliai (duomenys neparodyti). Panašiai ir perskirstymas, integrino α2 ant gydymo su PFL buvo pastebėtas kitoje skrandžio vėžys ląstelių linija, GCIY, bet ne įprastomis žmogaus hepatocitų ląstelių, ACBRI 3716 (8 pav.). Be ACBRI 3716 ląstelių, internalizacija ir PFL nebuvo pastebėta galbūt mažesnio išraiška integrinu α2 ant ląstelių paviršiaus.

dalyvavimas aukšto manozės glikanus ant PFL-integrinų α2 sąveikos

Norėdami patikrinti, ar ląstelių perskirstymas integrinu α2 sukelia PFL gali atsirasti tam tikro sąveikos PFL su aukštos manozės glikanus apie integrinu α2 molekulę, mes įvertino mielių manano poveikį PFL sukeltos integrino α2 internalizacijos naudojant MKN28 ląsteles. Be mielių manano nėra, abu proteinai patyrė didelę internalizavimo (pav. 9A, viršutinės plokštės). Priešingai, iš mielių manano akivaizdoje, PFL nepavyko jungiasi prie ląstelių paviršiaus, ir po to ląstelės viduje prekyba PFL buvo visiškai panaikinta (. 9A pav, apatiniame dešiniajame). Sutikdamas šią pastabą, integrinu α2 nepakeitė savo lokalizavimo mielių MANANO akivaizdoje (. 9A pav, apatinė kairėje). Šie rezultatai aiškiai rodo, kad PFL privalo integrinu α2 per aukštos manozės glikanus apie integrinu α2 pripažinimo. Siekiant dar labiau patvirtina, kad aukštos manozės glikanus reikalavimą integrinu α2 perskirstymą, mes išbandėme įvairių lectins apie mobiliojo ryšio lokalizacijos integrinų α2 poveikį. Kaip parodyta Fig. 9B, kiti lektinai su skirtingais ypatumus, pavyzdžiui, galaktozės privalomos PNA iš , Arachis hypogaea
, fukozė privalomos AOL iš Aspergillus oryzae
, Seilių rūgšties privalomas MAM iš makija amurensis
D-GlcNAc privalomos UDA iš , didžioji dilgėlė
nebuvo paveikti integrinu α2 vietą. Įdomu tai, kad net didelės manozės privalomas lektinai pavyzdžiui, vienaskilčių manozėje (MAN) -binding lėktino, GNA Baltoji snieguolė
neparodė jokių reikšmingų pokyčių dėl integrinu α2. Priešingai, aukštos manozėje privalomas ankštinių lėktino ConcanavalinA (cona) iškreipė sutvarkome integrinu α2 kaip PFL padarė.

Diskusijos

Šiame tyrime mes įvertino biologinį aktyvumą romano bakterijų lėktino PFL iš P. fluorescens
Pf0-1, kuri priklauso neseniai rastas anti-ŽIV lėktino šeimos apatinių organizmams. Sugedus didėja vaistams atsparios gripo viruso padermių, taip pat atsiranda labai patogeniško viruso padermių, tokių kaip paukščių H5N1 privertė mus ieškoti PFL kaip naują kovos su gripo agentas. PFL parodė stiprus anti-gripo viruso aktyvumą ir mechanizmą, pagal kurį PFL slopina virusų replikaciją buvo slopinimas pradiniame žingsnyje viruso įvežimo į ląsteles. Tai labiausiai tikėtina, kad PFL darė prieš gripo aktyvumą selektyviai jungiasi prie aukštų manozės glikanus nuo virusų voko HA, kaip parodė ELISA [9] tyrimu. Tiesą sakant, svetainė konkretus įvykis didelės manozė oligosacharido parodė ne iš HA regione netoli receptorių svetainėje [10].

Jei ištirti Priešnavikinio poveikį PFL, mes įdarbinti žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijos MKN28 kuri yra kilęs iš vidutiniškai diferencijuotam žarnyno tipo naviko. Raudona dumblių lėktino EKA-2, kuris priklauso tai pačiai lėktino šeimai su PFL eksponuojami Priešnavikinio poveikį tiek in vitro parsisiųsti ir vivo
[7], [8]. EP-2 yra baltymas, gautas iš valgomų jūros dumblių ir tikimasi, kad daryti priešnavikinį poveikį virškinimo trakto vėžio per burną. Pažymėtina, kad PFL skatinamas ląstelių mirtį MKN28 ląstelių, tik per aukštai manozės glikanus apie integrinų α2 molekulės, kuri daugiausia esančio ląstelių paviršiuje, esant pastoviai pripažinimo. Heterodimerinės integrinų veikti ne tik kaip tvirtinimo įtaisas molekulė pridėti ląsteles į atitinkamą matriksą (ECM), bet taip pat kaip daviklių ECM aplinkai [11].

• PLoS ONE: Honokiol Skatina kalpainas tarpininkaujant Gliukozė reguliuojama Baltymų-94 Įskilimai ir apoptozę žmogaus skrandžio vėžio ląsteles ir sumažina naviko augimą
• Tipai skrandžio vėžio