PLOS ONE: Factor de Crecimiento Epidérmico-Al igual que contiene el dominio de proteína 7 (EGFL7) Mejora el receptor EGF-AKT señalización, epitelio-mesenquimal transición, y la metástasis de células de cáncer gástrico

Extracto

similar al factor de dominio que contienen proteínas-7 (EGFL7) de crecimiento epidérmico es aumentada en tumores epiteliales humanas y por lo tanto es un biomarcador potencial de malignidad. De hecho, estudios previos han demostrado que la expresión de alto EGFL7 promueve la infiltración y metástasis de carcinoma gástrico. La transición epitelio-mesenquimal (EMT) inicia la cascada metastásica y dota a las células cancerosas con capacidad invasiva y migratoria; sin embargo, no se sabe si EGFL7 promueve la metástasis mediante la activación de EMT. Se encontró que EGFL7 se sobreexpresa en múltiples líneas celulares de cáncer gástrico humano (GC) y que la sobreexpresión promovió la invasión celular y la migración según lo revelado por herida de cero y los ensayos de migración transwell. Por el contrario, shRNA mediada desmontables EGFL7 reducida invasión y migración. Además, las células que sobreexpresan EGFL7 se convirtieron en los tumores más grandes y tenían más probabilidades de producir metástasis en el hígado en comparación con las células underexpressing CG después de la inyección subcutánea en ratones. EGFL7 sobreexpresión protegida contra líneas celulares GC anoikis, proporcionando un mecanismo plausible para esta capacidad metastásica mejorada. En los tumores gástricos humanos extirpados, la expresión de EGFL7 se correlacionó positivamente con los niveles de expresión de vimentina el marcador mesenquimal y la transcripción de EMT-represor asociado caracol, y negativamente correlacionada con la expresión de la célula epitelial marcador de E-cadherina. En líneas celulares de GC, EGFL7 caída invierte signos morfológicos de la EMT y la disminución tanto de vimentina y la expresión de Snail. Además, la sobreexpresión EGFL7 promovido receptor EGF (EGFR) y la proteína quinasa B (AKT) fosfo-activación, efectos marcadamente suprimida por el EGFR tirosina quinasa AG1478. Por otra parte, AG1478 también redujo la capacidad invasiva y migratoria elevado de líneas celulares que sobreexpresan GC EGFL7. En conjunto, estos resultados sugieren fuertemente que EGFL7 promueve la metástasis mediante la activación de EMT a través de una vía de señalización de EGFR-AKT-caracol. La interrupción de la señalización de EGFL7-EGFR-AKT-Snail puede una estrategia terapéutica prometedora para el cáncer gástrico

Visto:. Luo B-H, Xiong F, Wang J-P, Li J-H, Zhong M, Liu Q-L, et al. (2014) Protein 7 (EGFL7) Factor de Crecimiento Epidérmico-Al igual que contiene el dominio de Mejora receptor EGF-AKT señalización, epitelio-mesenquimal transición, y la metástasis de células de cáncer gástrico. PLoS ONE 9 (6): e99922. doi: 10.1371 /journal.pone.0099922

Editor: Claudia D. Andl, Universidad de Vanderbilt, Estados Unidos de América

Recibido: 15 Noviembre 2013; Aceptado: 19-may de 2014; Publicado: 19 Junio ​​2014

Derechos de Autor © 2014 Luo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81.001.080) y el Fondo de Open-End para los valiosos instrumentos de precisión y de la Universidad central del Sur (núm JJ3121). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer gástrico (CG) es el cuarto tumor maligno más común y la segunda causa principal de muerte por cáncer en todo el mundo [1], [2]. Aproximadamente la mitad de todos los casos de CG se producen en países de Asia oriental, en particular con una alta incidencia en Japón, Corea y China [3], [4]. Los avances en el tratamiento sistémico de GC se ha incrementado en gran medida la supervivencia a corto plazo; Sin embargo, la tasa de supervivencia a cinco años de pacientes con cáncer gástrico sigue siendo baja debido a la recaída y la metástasis [5]. Por otra parte, los pacientes recién diagnosticados más de GC ya muestran la enfermedad metastásica, que constituye un importante reto terapéutico para los oncólogos [6].

similar al factor de dominio que contienen proteínas-7 (EGFL7) de crecimiento epidérmico, también conocido como estatina endotelial vascular , es un factor secretado por células endoteliales derivado que regula la formación del tubo vascular. Parker et al. [7] demostró que EGFL7 es crucial para la angiogénesis durante la embriogénesis pez cebra [8]. Estudios recientes han informado de la expresión elevada de EGFL7 en varios tumores y líneas celulares de cáncer, incluyendo tumores renales, gliomas malignos, carcinomas hepatocelulares, cánceres de colon y [7] - [10]. Hemos demostrado anteriormente que EGFL7 también se sobreexpresa en el carcinoma gástrico [11], y la expresión se correlacionó significativamente con las características patológicas, la progresión clínica, mal pronóstico y la metástasis [10], [12]. Por lo tanto, EGFL7 es un factor predictivo candidato para la progresión del cáncer y la metástasis. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a los efectos tumorigénicos de EGFL7 no están claros.

La metástasis es un proceso de múltiples etapas que implica una transición epitelial-mesenquimal (EMT) en el que las células epiteliales polarizadas se convierten en células mesenquimales [13], un fenotipo de mayor capacidad invasiva y migratoria [14]. La EMT es también un proceso reversible que a menudo se produce en la parte delantera invasiva de muchos cánceres metastásicos [15]. Varios estudios han demostrado que el EGF promueve la migración de células de cáncer y la invasión concomitante con la activación de EMT [16] - [18]. De manera significativa, EGFL7 contiene dos dominios similares a EGF, lo que sugiere cierta homología funcional [9], [12]. Sin embargo, si EGFL7 hace realmente mejorar la EMT y promover la metástasis del cáncer gástrico aún no se ha determinado. Por otra parte, los mecanismos moleculares por los que se regula EMT en GC siguen siendo en gran medida desconocido. El dedo de zinc represor transcripcional Snail es crítica para la reprogramación de la expresión génica durante la EMT, en particular para la represión de la endotelial proteína de adhesión célula-célula (E) -cadherin, la pérdida de la cual se considera un evento temprano importante en EMT y necesaria para la metástasis posterior [ ,,,0],19].

El presente estudio tuvo como objetivo determinar si EGFL7 promueve la metástasis mediante la activación de la EMT. Se encontró que la sobreexpresión EGFL7 activa la vía EGFR-AKT, desencadena la EMT, y promueve la invasión de células GC in vitro
y metástasis in vivo
.

Materiales y Métodos

pacientes y Recogida de tejido

tejidos de carcinoma gástrico se obtuvieron de 79 pacientes GC (58 hombres y 21 mujeres) tratados mediante resección quirúrgica en el Departamento de Cirugía, hospital Xiangya, Universidad central del Sur (República Popular china). Las cirugías se llevaron a cabo desde Jan 2010 a diciembre de 2012. Los pacientes fueron 54,7 años de edad en promedio (rango: 28 a 82 años). Y recibieron ni quimioterapia ni radioterapia antes de la cirugía

Los pacientes fueron informados de que los especímenes quirúrgicos haría ser utilizado para el diagnóstico patológico convencional y que los tejidos restantes se podrían utilizar para la investigación. No se requirió datos personales de pacientes para este estudio y los protocolos lleva a ningún riesgo, por lo que sólo se requería el consentimiento informado verbal de los pacientes. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Xiangya, Universidad Central del Sur (Permiso Número: 201 311 389).

estadificación de la enfermedad se define de acuerdo con la sexta edición del sistema de estadificación TNM del Comité Conjunto sobre el Cáncer [ ,,,0],20], [21]. Los tumores fueron bien diferenciadas adenocarcinoma gástrico en 12 casos, moderadamente diferenciados en 34 casos, y pobremente diferenciados en 33 casos. Todas las muestras se fijaron inmediatamente con formalina al 10%, se deshidrataron, y embebido en parafina. información clínica precisa y diagnóstico patológico estaban disponibles para todos los pacientes.

La inmunohistoquímica

Para la inmunohistoquímica, las muestras preparadas se incubaron a 60 ° C durante 15 h y se cortaron en secciones de 4 micras de espesor, en deparaffinized trementina, se seca y rehidrata en un etanol decreciente: destilada gradiente de agua. La actividad peroxidasa endógena se inactivó mediante incubación durante 30 minutos en peróxido de hidrógeno 0,3% en solución salina 0,01 M tamponada con fosfato (PBS). Las rebanadas se incubaron durante 15-20 min en tampón de citrato (pH 6,0) a 95 ° C para la recuperación de antígeno, se bloquearon con suero de cabra normal 5% en 0,01 M PBS durante 15 min a 37 ° C, y se incubaron con anticuerpos primarios diluidos en solución de bloqueo durante la noche a 4 ° C en una cámara humidificada. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpos anti-EGFL7 de anticuerpo de ratón monoclonal (Abcam, EE.UU., 1:400) y monoclonales de conejo generados contra la E-cadherina (CST, EE.UU., 1:1000), vimentina (CST, EE.UU., 1:1000 ), Caracol (Proteintech, EE.UU., 1:1000), y CD34 (Boster, china, 1:500). Después del lavado, las muestras se incubaron sucesivamente con solución de trabajo de avidina biotinilado y estreptavidina-anticuerpo secundario de rábano picante peroxidasa (HRP). Immunolabeling se visualizó usando el kit de sustrato DAB de Zhongshan puente Golden Company (China) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Por último, las secciones se counterstained con hematoxilina (Vector Laboratories, USA), se deshidrataron en una mezcla de etanol ascendente: gradiente de agua destilada, y se montaron en portaobjetos usando Permount medios de montaje (Fisher Scientific, EE.UU.)

La cuantificación de las señales de inmunohistoquímica.

Todo GC y tejidos gástricos no neoplásicas que rodean fueron confirmados histopatológicamente por dos patólogos independientes (K.-SW y J.-HL) ciegas para el diagnóstico original. La inmunotinción se clasificó por un método semi-cuantitativo que considera tanto la intensidad como la distribución de la tinción [22]. En resumen, cinco campos fueron seleccionados al azar a baja magnificación (× 100, Olympus BX51, Tokio, Japón), y 200 células tumorales contados a partir de cada campo. La intensidad de la tinción se puntuó como sigue: 0, sin tinción; 1, tinción de color amarillo débil; 2, la tinción de color amarillo; 3, la tinción marrón. Las células positivas se caracterizaron por una frontera clara y la tinción de color amarillo o marrón distinta de la de fondo. El porcentaje de células positivas (PP) se obtuvo de la siguiente manera: 0, 0%; 1, 1% -25%; 2, 26% -50%; 3, 51% -75%; 4, 76% -100%. Las dos puntuaciones se combinaron para obtener la siguiente clasificación: tinción negativa, las muestras con puntuación inmunorreactiva (IRS) de 0 a 2; débilmente tinción positiva, las muestras con IRS de 3 a 5; fuerte tinción positiva, las muestras con el IRS de 6 a 7. Las muestras que mostraban débilmente y fuertemente tinción positiva se incluyeron en el análisis estadístico.

Líneas celulares y cultivo

líneas celulares GC humana SGC7901 (moderadamente diferenciadas adenocarcinoma), BGC823 (pobremente diferenciadas adenocarcinoma), MKN28 (adenocarcinoma bien diferenciado), y MKN45 (adenocarcinoma pobremente diferenciado), así como normales de la mucosa gástrica GES-1 epiteliales células fueron adquiridos de la Colección de Cultivos Tipo de la Academia china de Ciencias (Shanghai, China). Todas las células fueron cultivadas y mantenidas en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Gibco Biocult, Paisley, UK) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Gibco Biotechnology), 100 U /ml de penicilina, y 100 g /ml estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO _2.

corto horquilla RNA (shRNA) y Expresión plásmido recombinante Pex-2-EGFL7

Para generar líneas celulares que sobreexpresan o underexpressing EGFL7, las líneas de células nativas fueron transfectadas establemente con un vector de expresión o específica shRNA. Las secuencias shRNA de EGFL7 humana fueron diseñados de acuerdo a la secuencia de ADN EGFL7 humana (GenBank NM_016215.3 NO.) Por software Designer 3.0 (Genepharma, http://www.genepharma.com) y las búsquedas BLAST (http: //www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Las secuencias diana se compararon con la base de datos del genoma humano por una búsqueda BLAST para asegurar que no alta homología con otras secuencias de codificación. Las secuencias EGFL7-homo-333 y EGFL7-homo-887 fueron identificados como sitios diana para un EGFL7 shRNA específico. Además, una secuencia no específica (scramble shRNA) fue diseñado como un control negativo, y la secuencia de GAPDH fue diseñado como un control interno. Las secuencias shRNA fueron los siguientes:

EGFL7-shRNA1 contra EGFL7-homo-333: sentido, 5'-CACCGGTGCTGCTGATGTGGCTTTCAAGAGAAGCCACATCAGCAGCACCTTTTTTG-3 '; antisentido, 5'-GATCCAAAAAAGGTGCTGCTGATGTGGCTTCTCTTGAAAGCCACATCAGCAGCACC-3 '; EGFL7-shRNA2 contra EGFL7-homo-887: sentido, 5'-CACCGAGTGGACAGTGCAATGAATTCAAGAGATTCATTGCACTGTCCACTCTTTTTTG-3 '; antisentido, 5'-GATCCAAAAAAGAGTGGACAGTGCAATGAATCTCTTGAATTCATTGCACTGTCCACTC-3 '; sentido no específico, 5'-CACC GTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3 '; antisentido, 5'-GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC-3 '; GAPDH sentido, 5'-CACCGTATGACAACAGCCTCAAGTTCAAGAGA CTTGAGGCTGTTGTCATACTTTTTTG-3 '; antisentido, 5'-GATCCAAAAAAGTATGACAACAGCCTCAAGTCTCTTGAACTTGAGGCTGTTGTCATAC-3 '. El vector pGPU6 /GFP /Neo (proteína fluorescente verde, neomicina) (Genepharma Company, Shanghai, China) se utilizó para la construcción del plásmido. Los nucleótidos se hibridaron y se insertaron en los sitios BamHI y HindIII y se transformaron en E. coli DH5a-competentes. Se seleccionaron colonias kanamicina /Dual resistentes a la neomicina y las secuencias del vector confirmaron por digestión de restricción y secuenciación de ADN.

El ADNc EGFL7 que codifica la secuencia de ácido amino 533-1353 se subclonó en un plásmido vector pEX-2 (Genepharma, Shanghai, china) por BglII /EcoRI doble digestión y se designaron pEX-2-EGFL7. El plásmido recombinante se amplificó en DH5a competentes E. coli y la secuencia del vector amplificado por PCR. La secuenciación de ADN confirmó que el plásmido recombinante contenía un fragmento del gen EGFL7 idéntica a la de GenBank (GenBank NO. NM_016215.3). Kanamicina /se seleccionaron las colonias resistentes a la neomicina y la secuencia confirmada por digestión de restricción y secuenciación de ADN. Todos los cebadores fueron diseñados y sintetizados por Genepharma (Shanghai, China).

Transfección estable y selección G418

Para crear un clon EGFL7-underexpressing (y el control apropiados), BGC823 células fueron sembradas en seis -bien placas de cultivo a 1 × 10 ^{6 /pocillo y se incubaron durante 24 h en medio RPMI 1640 que contiene 10% de FBS en una humidificado 5% CO _{2 atmósfera mantenida a 37 ° C. Las células fueron transfectadas con 4 mg pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1, pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA2, pGPU6 /GFP /Neo-inespecífica-shRNA o pGPU6 /GFP /Neo-GAPDH shRNA usando Lipofectamine 2000 reactivo de transfección (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de 24 h, se incubaron las células en G418 (Sigma, EE.UU., 600 g /ml) para la selección inicial, se diluye, en placas a baja densidad (aproximadamente 1 célula /pocillo) y se mantuvieron en medio de cultivo suplementado con G418 a la mitad de la concentración inicial de selección durante 3 semanas adicionales. Las líneas celulares estables resultantes se denominaron BGC2-13 (línea celular que resulta de pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 transfección estable) y BGC-NC, y se expandieron para estudios posteriores. El nivel de expresión de EGFL7 se evaluó mediante Western blot y en tiempo real de RT-PCR. Para establecer una línea de sobreexpresión y control emparejado, las células MKN28 se sembraron, transfectadas con 4 g de PEX-2-EGFL7 o PEX-2 plásmidos, y seleccionados como se describe para BGC823 células excepto que 500 g /ml de G418 se utiliza para la selección inicial. Las líneas celulares estables resultantes se denominaron MKN28-EGFL7 y MKN28-NC. Los niveles de expresión de EGFL7 en clones resistentes a G418 se evaluaron mediante transferencia Western y cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR).}}

Western Blot Analysis

Después de las células alcanzaron 80% -95% confluencia, proteína total se extrajo utilizando tampón de extracción de lisado de células (Beyotime, china) que contiene inhibidor de la proteasa (1 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo). Lisado concentración de proteína total se determinó usando un kit de ensayo de proteínas de ácido bicinconínico (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EE.UU.). Cantidades iguales de proteína (25 mg) a partir de cada grupo de tratamiento se separaron por carril gel de 8% de sodio dodecil electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y se transfirieron a difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Billerica, EE.UU.). Las membranas se incubaron secuencialmente con tampón de bloqueo que consiste en solución salina tamponada con Tris (TBS) que contiene 5% de leche descremada en polvo durante 2 h a temperatura ambiente y luego durante la noche a 4 ° C en este mismo tampón con uno de los siguientes anticuerpos primarios: anti EGFL7 (1:500; Abcam la ciencia de Cambridge, Reino Unido). anti-E-cadherina, anti-vimentina, anti-Caracol (todos a 1:1000; Cell Signaling Technology, CST, EE.UU.), anti-GAPDH (1:10000, Protech), anti-EGFR, anti-fosfo-EGFR, anti-AKT, anti-fosfo-AKT, anti-ERK, y anti-fosfo-ERK (todo 1:800, Abou Biotech Co., Ltd., EE.UU.). membranas immunolabeled se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con HRP (1:2000, inmunología consultores Laboratory, Inc., EE.UU.) durante 2 h a temperatura ambiente. Después de lavar con TBST, las bandas de proteínas se visualizaron usando el sistema de detección de quimioluminiscencia (Advansta Corporation, Menlo Park, California, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. La expresión de GAPDH se utilizó como control de carga y las proteínas cuantificado usando UTHSCSA Image Tool 3.0. expresión de la proteína diana se calcula como el cociente entre la intensidad de banda de la proteína diana a GAPDH.

ARN extracción y análisis de PCR

Las células fueron lisadas en reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y ARN total se preparó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. ADNc primera cepa fueron sintetizados por el equipo de reactivos RT PrimeScript con gDNA Borrador (Takara, Otsu, Japón) y se amplificaron por PCR usando los siguientes cebadores específicos: EGFL7 sentido, 5'-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 '; antisentido, 5'-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 '. El ADNc de GAPDH se amplificó para el control de la cantidad de ADNc presente en cada muestra (sentido, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; antisentido, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'). amplificación por PCR se llevó a cabo a 94 ° C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 57 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 40 s. Los productos de PCR fueron separados en 1,0% en geles de agarosa y la expresión de genes objetivo cuantificado como la relación entre la intensidad de la banda gen diana a la de GAPDH utilizando Image Tool 3.0 (La Universidad de Texas, Centro de Ciencias de la Salud, San Antonio, Texas, EE.UU.).

-PCR en tiempo real

La mezcla de reacción para PCR en tiempo real consistió en 10 l de Premezcla Ex Taq (sonda qPCR), 0,2 M de cada cebador EGFL7 y GAPDH (abajo), 0,2 pmol /sondas TaqMan ml (EGFL7 o GAPDH), y 0,4 l ROX (tetrapropano-6-carboxirodamina) Referencia tinte II (Takara Bio, Shiga, Japón). La mezcla se combinó con 2 l de ADNc en cada pocillo de una placa de 96 pocillos MicroAmp (Applied Biosystems, CA, EE.UU.) y se utilizó agua destilada para ajustar a un volumen final de 20 l. Los siguientes cebadores fueron diseñados utilizando el Primer Premier paquete de software 6.0 (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, EE.UU.): EGFL7: adelante, 5'-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 '; revertir, 5'-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 '; GAPDH: adelante, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; revertir, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 '. Todas las reacciones se realizaron en un sistema 7500 Real-Time PCR (Applied Biosystems, CA, EE.UU.). termociclo condiciones fueron desnaturalización inicial a 95,8 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de amplificación a 95,8 ° C durante 6 s y 60,8 ° C durante 30 s.

condiciones experimentales similares se utilizaron para evaluar la expresión de otra genes con los siguientes cebadores: E-cadherina: adelante, 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3 '; revertir, 5'-AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 '; vimentina: adelante, 5'-GACGCCATCAACACCGAGTT-3 '; revertir, 5'-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3 '; Caracol: adelante, 5'-TGCTCCACAAGCACCAAGA-3 '; revertir, 5'-GCAGAGGACACAGAACCAGAAA-3 '; GAPDH: adelante, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; revertir, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 '. La mezcla de reacción para PCR en tiempo real consistió en 10 l de SYBR Premezcla Ex TaqTM II, 1,6 l de cada cebador (0,4 M), 0,4 l de ROX Referencia tinte, 2 l de ADNc molde, y 6 l de pirocarbonato de dietilo tratado con agua. PCR en tiempo real se realizó en un Sistema 7500 Real-Time PCR (Applied Biosystems, CA, EE.UU.) con las siguientes condiciones termociclo: desnaturalización inicial a 95 ° C durante 10 s, seguido de 40 ciclos de amplificación a 95 ° C durante 5 s y 60 ° C durante 34 s.

Ensayo de proliferación celular

la proliferación celular se estimó por el [-2-il-4,5 dimetiltiazol] -2,5 difenil tetrazolio bromuro de 3- (MTT) ensayo de células viable. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a 2.000 /pocillo y se cultivaron durante 12, 24, 48, 72, y 96 h. Después, se añadieron 20 l de solución de MTT (Sigma) stock (5 mg /ml) a 200 l de medio de cada pocillo, y las placas se incubaron durante 4 h adicionales a 37 ° C. Después de una cuidadosa aspiración del medio de cultivo, se añadieron 150 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO) a cada pocillo para disolver los cristales de formazán formados a partir de MTT por las células viables. Las placas se agitaron en una plataforma rotatoria durante 10 min y la absorbancia medida a 490 nm usando un lector de microplacas.

Colonia Placa de Formación de Ensayo

Las células se sembraron a 200 /pocillo en el mismo seis así placas tal como se utiliza para otros ensayos para evaluar la formación de colonias en condiciones de células adherentes. Después de 10 días, las células se tiñeron con 1% de Giemsa, y se contó el número de colonias visibles. El índice de formación clon relativa se calculó como el número medio de colonias /número de células sembradas x 100%.

arañazos Wound Healing Ensayos

Para el ensayo de migración celular, 5 × 10 ^{5 células /pocillo en placas de seis pocillos recubiertas con 10 mg /ml de fibronectina (FN) y se incubaron durante 24 h. A continuación, la monocapa fue interrumpido por un solo cero utilizando una punta de pipeta de 200 l. Micrografías fueron obtenidas a los 0, 12, 24, 36, 48 y 72 h post-cero con un microscopio de contraste de fases (Olympus BX51, Japón). El número de células dentro de la región rayada (estéril) de los pocillos se contó en cinco campos (Magnificación: x 200). Todos los experimentos se realizaron por duplicado.}

in vitro
invasión y migración Ensayo

invasión celular y la migración fueron evaluados utilizando cámaras transwell (Corning, Nueva York, EE.UU.). ensayos de invasión se llevaron a cabo en transwell cámaras separadas por insertos de filtro de membrana de policarbonato (8 micras poros) para las placas de 24 pocillos. Cada cámara se recubrió con 100 l de 1:20 Matrigel (Becton, Dickinson and Company, Nueva York, EE.UU.) en medio RPMI 1640 frío durante la noche a 4 ° C. Posteriormente, las células (5 × 10 ^{4 /ml x 200 l) se sembraron en la cámara superior en medio libre de suero. Aproximadamente 800 l de medio acondicionado con 10 mg de fibronectina /ml se colocó en el compartimiento inferior de la cámara transwell como un quimioatrayente. Después de la incubación durante 24 horas a 37 ° C, las células tumorales restantes en la superficie superior de la cámara se eliminaron frotando con hisopos de algodón mojado. células invasoras en la superficie inferior se fijaron con paraformaldehído al 4%, se tiñeron con violeta cristal y se contaron bajo un microscopio de contraste de fases (Olympus, Japón) a 200 ×. Cuatro experimentos independientes se realizaron por triplicado para todas las condiciones de tratamiento. in vitro
ensayos de migración se realizaron en las mismas condiciones que los ensayos de invasión, pero con cámaras inferiores sin recubrimiento y el uso de 1 × 10 5 células /ml (200 l).}

Anoikis Ensayo

metacrilato de poli-hidroxietilo (poli-HEMA, Sigma-Aldrich), que inhibe la adhesión celular a las placas de cultivo y otras superficies de crecimiento, se reconstituyó en 95% de etanol a una concentración final de 12 mg /ml. Para preparar placas recubiertas con poli-HEMA, se añadió a cada pocillo de una placa de 6 pocillos y se deja secar durante la noche bajo una campana de cultivo de tejido de flujo laminar 2 ml de esta solución. A continuación, 5 × 10 ^{4 células se sembraron por triplicado en cada poli-HEMA recubiertas bien con medios de cultivo regular. Después de 24 h, se recogieron las células de GC, se enjuagaron con PBS, y se resuspendieron en 500 l de tampón de unión de una anexina V-PE /7-AAD Kit de Detección de Apoptosis (eBioscience, San Diego, EE.UU.). Las células resuspendidas de cada muestra se tomaron alícuotas (100 l) en cuatro tubos. Tres tubos se marcaron con cualquiera de Anexina V-PE, 7-AAD, o ambos, mientras que el cuarto fue utilizado como un control no marcado. A continuación, cada lote se analizó por citometría de flujo en un FC 500 contador Beckman Coulter (Beckman Coulter, Inc.). El porcentaje de células apoptóticas se deriva como la suma de fracciones de células que muestran apoptosis temprana (anexina V-positivo) y la apoptosis tardía (7-AAD-positivo).}

Desnudo xenoinjerto modelo de ratón

xenotrasplante de líneas celulares GC fue realizado de acuerdo con las directrices nacionales para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio (publicación núm. 86-23, revisada 1985), fue aprobado por el Comité de Cuidado y uso de Animales de la Tercera Xiangya hospital, Universidad central del Sur ( LLSC [lA] 2013-0010), y se ajustaba a la ley actual de china en la protección de los animales (LLSC [lA] 2013-0010). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número de ratones utilizados y su sufrimiento.

Treinta y cinco ratones Balb /c desnudos edad ratones 4 a 6 semanas fueron adquiridos de los Animales de Laboratorio Slac Co. Ltd. (Shanghai, China) y alojados en jaulas ventiladas por separado. Los ratones fueron divididos aleatoriamente en BGC823, BGC-NC, BGC2-13, MKN28, MKN28-NC, MKN28-EGFL7, y grupos de control de PBS (n = 5 ratones /grupo). Se recogieron las células en cultivo y se resuspendieron en PBS a 1 × 10 ^{8 células /0,2 ml. La suspensión se inyecta por vía subcutánea en la extremidad superior izquierda de cada ratón desnudo a excepción de los del grupo de control, que fueron inyectados con 0,2 ml de PBS. El crecimiento del tumor se evaluó cada 3 días mediante la medición de diámetros de los tumores con calibradores Vernier. El volumen tumoral (TV) se calculó según la fórmula: TV (mm 3) = D 2 × D /2, donde d y D son las más cortas y los diámetros más largo, respectivamente. Los ratones se sacrificaron a las 4 semanas después de la implantación de células, y los tumores se extrajeron y se pesaron. Todos los hígados fueron examinados para la metástasis por hematoxilina y eosina (H & E) tinción. Los tumores fueron fijadas en formol al 10%, embebidos en parafina, y se cortaron en secciones de 4 micras de espesor. EGFL7 expresión se determinó por inmunohistoquímica, como se describe anteriormente.}

Análisis estadísticos

Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS versión 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.) para Windows. Los datos se expresan como media ± desviación estándar (SD) de al menos tres experimentos independientes. medias de los grupos se compararon mediante análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) con pruebas de mínima diferencia significativa (LSD) para la pareja comparaciones post hoc de Student-Newman-Keuls (SNK) o. Se utilizó el coeficiente de correlación de Spearman Rank para determinar las correlaciones entre EGFL7 y los niveles de expresión de proteínas relacionadas con la EMT en cáncer gástrico tejidos extirpados quirúrgicamente. Un P Hotel < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo

Resultados

Expresión EGFL7 fue elevada en líneas celulares de cáncer gástrico humano

Western blot y RT. PCR se realizó para comparar la expresión EGFL7 en las líneas celulares humanas GC SGC7901, BGC823, MKN45 y MKN28 a que en la mucosa gástrica GES-1 epiteliales normales células. Los niveles elevados de EGFL7 se encontraron en todas las líneas celulares de cuatro GC en comparación con GES-1, con BGC823 y MKN28 que muestra la expresión más alta y la más baja EGFL7, respectivamente, tanto en la proteína y los niveles de mRNA (Figuras 1A y 1B). Por lo tanto, BGC823 y MKN28 fueron utilizados en experimentos posteriores para evaluar los efectos de la expresión EGFL7 sobre la proliferación, migración y potencial metastásico. Empleamos estable transfección shRNA para suprimir la expresión EGFL7 en BGC823 células y diseñamos un EGFL7 humano de alto plásmido de expresión (PEX-2-EGFL7) para aumentar la expresión en células EGFL7 MKN28.

Hemos construido dos vectores de plásmido shRNA orientación EGFL7 mRNA y llevó a cabo QRT-PCR para evaluar la eficacia de estas secuencias shRNA candidatos para suprimir EGFL7 en comparación con secuencias no específicas. Las secuencias shRNA1 y shRNA2 lograron 75% y 30% de inhibición de EGFL7, respectivamente (Figura 1C), por lo que el shRNA1 más eficiente se utilizó para todos los experimentos posteriores. Las líneas BGC823 transfectadas de forma estable con pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 o pGPU6 /GFP /Neo-inespecífica-shRNA fueron designados BGC2-13 y BGC-NC, respectivamente. Las líneas MKN28 transfectadas establemente con PEX-2-EGFL7 y PEX-2-inespecíficos fueron designados MKN28-EGFL7 y MKN28-NC, respectivamente. Los niveles de expresión de proteína EGFL7 y mRNA en clones resistentes a G418 se evaluaron también por Western blot (Figura 1D) y de tiempo real RT-PCR (Figura 1E). Los resultados mostraron una disminución de expresión marcadamente EGFL7 en BGC2-13 las células que las células BGC-NC y significativamente elevados de expresión en las células MKN28-EGFL7 comparación con las células MKN28-NC (todo el P Hotel < 0,05). No hubo diferencias significativas en el ARNm y la expresión de proteínas entre las células BGC-NC y BGC o entre las células MKN28-NC y MKN28 (todos los P Hotel > 0,05).

EGFL7 Promovido invasión celular GC y la migración, pero no afectó a la proliferación de células GC

Para investigar el papel de EGFL7 en la progresión del GC, se analizó en primer lugar si EGFL7 silenciamiento o sobreexpresión alteraron la proliferativa, invasivo y capacidades migratorias de células GC. la curación de la herida de Scratch se utilizó para medir la migración de las células transfectadas de manera estable. Una herida fue generada en monocapas de células GC por un solo cero y el número de células en la zona cero en comparación a 0 y 48 h. El cierre de la herida fue significativamente más lento en BGC2-13 culturas (underexpressing EGFL7) en comparación con BGC823 nativo y culturas BGC-NC (32% vs.
100% y 98%, tanto P
< 0,05) (Figura 2A). En contraste, el cierre fue significativamente más rápida en cultivos MKN28-EGFL7 (que sobreexpresa EGFL7) en comparación con cultivos MKN28 y MKN28-NC (99% vs.
49% y 50%, ambos P <
; 0,05) (Figura 2B). Por otra parte, la herida más de cerca el algún momento posterior a cero (48 h) fue mayor en alta EGFL7 tipo salvaje que expresan BGC823 células en comparación con las células que expresan bajos-salvaje tipo MKN28, lo que indica que los niveles de expresión endógenos también influyen en la migración.

se realizaron ensayos Transwell para confirmar estos hallazgos e investigar aún más el efecto de EGFL7 sobre el potencial invasivo de células BGC823, MKN28 células, y las respectivas líneas de expresión estables en Matrigel. Hubo significativamente menos células EGFL7-underexpressing (BGC2-13) en el Matrigel en comparación con BGC-NC y BGC823 células (25 ± 3,1 vs
76 ± 2,9 y 79 ± 5,7 células /pocillo;. P
< 0,05), lo que indica que EGFL7 subexpresión significativa capacidad invasiva reducida (Figura 2C). Del mismo modo, el número de células BGC2-13 que llegan al pocillo inferior sin Matrigel en los ensayos de migración transwell se redujo significativamente en comparación con las células BGC823 y BGC-NC (19 ± 1,1 vs.
53 ± 2,9 y 54 ± 2,6 , tanto P Hotel < 0,05) (Figura 2C). Por el contrario, EGFL7 sobreexpresión en MKN28 células mejora de forma significativa tanto la invasión en Matrigel (MKN28-EGFL7: 79 ± 6.19 células /pocillo, MKN28-NC: 40 ± 2.00 células /pocillo, MKN28: 41 ± 4,22; ambos P
< 0,05; Figura 2D) y la migración (MKN28-EGFL7: 67 ± 4,16, MKN28-NC: 33 ± 5,92, MKN28: 35 ± 3,7; ambos P Hotel < 0,05; Figura 2D). Wu et al.

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