Ploche ONE: epidermálneho rastového faktora-podobná doména obsahujúca proteín 7 (EGFL7) Zvyšuje receptora EGF-Akt signalizáciu, epitelové, mezenchýme prechod, a metastázy karcinómu žalúdka Cells

abstraktné

epidermálneho rastového faktora-like domény -S proteín 7 (EGFL7) je up-regulovaná v ľudských epiteliálnych nádorov, a tak je potenciálny biomarker malignity. V skutočnosti, predchádzajúce štúdie ukázali, že vysoká expresia EGFL7 podporuje infiltráciu a metastázovaniu karcinómu žalúdka. Prechod epiteliálne-mezenchýmových (EMT) spúšťa kaskádu metastatický a dotuje rakovinové bunky s invazívne a migračnej kapacity; Avšak, to nie je známe, či EGFL7 propaguje metastáz aktiváciou EMT. Zistili sme, že EGFL7 bol nadmerne exprimovaný v mnohých ľudských bunkových líniách rakoviny žalúdka (GC), a že nadmerná expresia podporoval invázie buniek a migráciu ako bolo zistené scratch rany a transwell migračné testy. Naopak, zhrnie sprostredkované EGFL7 porazený zníženú inváziu a migráciu. Okrem toho EGFL7-exprimujúce bunky rástli do väčších nádorov a boli viac pravdepodobné, že metastázovať do pečene v porovnaní s underexpressing CG buniek po subkutánnej injekcii u myší. EGFL7 nadmerná expresia chránenej GC bunkových línií proti anoikis, ktoré poskytujú hodnoverný mechanizmus tohto posilneného metastatické kapacity. Odrezanými ľudských nádorov žalúdka, expresie EGFL7 v pozitívnej korelácii s expresiou v mezenchymálnych markerov vimentin a EMT asociované transkripcie represor Slimák a negatívne koreláciu s expresiou epiteliálne bunky markeru E-cadherinu. V bunkových líniách GC, EGFL7 porazený obrátil morfologické znaky EMT a znížila aj vimentin a výraz Slimák. Okrem toho EGFL7 nadmerná expresia podporoval EGF receptor (EGFR) a proteín kináza B (AKT) fosfo-aktivácia, účinky výrazne potlačený inhibítorom EGFR tyrozínkinázy AG1478. Okrem toho AG1478 tiež znižuje zvýšenú invazívne a migračnej kapacity GC bunkových línií s nadmernou expresiou EGFL7. Súhrnne tieto výsledky ukazujú, že silne podporuje EGFL7 metastáz aktiváciou EMT prostredníctvom EGFR-AKT-Slimák signalizačné dráhe. Rozrušenie EGFL7-EGFR-AKT-Slimák signalizácia môže byť sľubnú stratégiu pre rakovinu žalúdka

Citácia :. Luo B-H, Xiong F, Wang J-P, Li J-H, Zhong M, Liu Q-L, et al. (2014), epidermálny rastový faktor-podobná doména obsahujúca proteín 7 (EGFL7) Zlepšuje EGF Receptor-AKT Signalizácia, epitel-mezenchymálnych Transition a metastáza žalúdočné rakovinové bunky. PLoS ONE 9 (6): e99922. doi: 10,1371 /journal.pone.0099922

Editor: Claudia D. Andlát, Vanderbilt University, Spojené štáty |

prijatá: 15. novembra 2013; Prijaté: 19.května 2014; Uverejnené: 19.června 2014

Copyright: © 2014 Luo et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bola podporovaná národná prírodná Science Foundation Číny (No. 81001080) a Open-End fondu za cennú a Precision Instruments of Central South University (č JJ3121). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

rakovina žalúdka (GC) je štvrtou najčastejšou malígny tumor a druhou najčastejšou príčinou úmrtí na nádorové ochorenie na celom svete [1], [2]. Približne polovica všetkých prípadov GC sa vyskytujú v krajinách východnej Ázie, s obzvlášť vysokými prípadov v Japonsku, Kórei a Číne [3], [4]. Pokrok v systémovej liečby GC výrazne vzrástla krátkodobé prežitie; Avšak, päťročné prežitie pacientov GC zostáva na nízkej úrovni v dôsledku recidívy a metastáz [5]. Navyše má novo diagnostikovaných pacientov GC už ukazujú, metastatické ochorenie, ktorá tvorí hlavnú terapeutickú výzvu pre onkológmi [6].

epidermálny rastový faktor podobný proteín doménu obsahujúce 7 (EGFL7), tiež známy ako vaskulárny endoteliálny statín , je pre endotelové bunky a odvodený vylučovaný faktor, ktorý reguluje tvorbu cievne trubice. Parker et al. [7] preukázali, že EGFL7 je zásadný pre angiogenézu v priebehu embryogenézy Danio pruhované [8]. Nedávne štúdie preukázali zvýšenú expresiu EGFL7 v niekoľkých nádorov a nádorových bunkových línií, vrátane nádorov obličiek, malígny gliómami, hepatocelulárny karcinóm, a rakoviny hrubého čreva [7] - [10]. Už skôr sme preukázali, že EGFL7 je tiež nadmerne vystavený v karcinómu žalúdka [11], a expresia bola významne koreluje s patologickými vlastnosťami, klinický priebeh, zlou prognózou a metastáz [10], [12]. Z tohto dôvodu, EGFL7 je kandidátom prediktívne faktor pre progresiu rakoviny a metastáz. Avšak, mechanizmus na ktorých sú tumorigénny účinky EGFL7 sú nejasné.

metastáza je viacstupňový proces, ktorý zahŕňa epiteliálne-mezenchýmových prechod (EMT), v ktorej polarizované epitelové bunky sa prevedú na mezenchýmových buniek [13], fenotyp s väčším invazívne a migračnej kapacity [14]. EMT je reverzibilná proces, ktorý sa často vyskytuje u invazívnej pred mnohými metastatických nádorových ochorení [15]. Niekoľko štúdií ukázalo, že EGF podporuje migráciu nádorových buniek a invázie súčasne s aktiváciou EMT [16] - [18]. Je príznačné, že EGFL7 obsahuje dve domény EGF-podobnej, čo naznačuje určitú funkčné homológie [9], [12]. Avšak to, či EGFL7 vlastne robí zvýšiť EMT a podporiť rakovina žalúdka metastáz je potrebné ešte určiť. Okrem toho, že molekulárne mechanizmy, ktoré sú upravené v EMT GC zostávajú do značnej miery neznámy. Zinok prst transkripčné represor Slimák je rozhodujúci pre preprogramovanie expresie génov v priebehu EMT, najmä pokiaľ ide o represiu adhézie bunka-bunka proteín endothelu (E) -cadherin, strata, ktorá je považovaná za dôležitou udalosťou v ranej EMT a nevyhnutné pre následné metastáz [ ,,,0],19].

Táto štúdia bolo zistiť, či EGFL7 propaguje metastáz aktiváciou EMT. Zistili sme, že nadmerná expresia EGFL7 aktivuje EGFR AKT dráhu, spúšťa EMT, a podporuje GC invázie buniek in vitro stroje a metastázy in vivo
.

Materiály a metódy

Pacienti a tkanivové zbierky

karcinómu žalúdka tkaniva boli získané od 79 GC pacientov (58 mužov a 21 žien) liečených chirurgickou resekciou na oddelení chirurgie, nemocnice Xiangyu, stredné Južnej University (Čína). Chirurgické zákroky boli vykonávané od januára 2010 do decembra 2012. Pacienti boli 54,7 rokov v priemere (rozsah: 28 až 82 rokov). A nedostal ani chemoterapiou ani rádioterapie pred chirurgickým zákrokom

Pacienti boli informovaní, že chirurgické vzorky by byť použitý pre konvenčné patologickej diagnózy a že zostávajúce tkanivá by mohli byť použité pre výskum. Žiadne osobné údaje pacienta bola nutná pre účely tejto štúdie a protokoly vykonávané žiadne riziko, takže len slovné informovaný súhlas bol požadované od pacientov. Protokol bol schválený etickou komisiou z Xiangyu nemocnice, centrálne južnej univerzita (Permit číslo: 201311389).

staging ochorenia bola definovaná podľa šiesteho vydania TNM predstavovať systém spoločného výboru amerického rakoviny [ ,,,0],20], [21]. Nádory boli dobre diferencovaný adenokarcinóm žalúdka v 12 prípadoch, mierne diferencované v 34 prípadoch, a zle diferencované v 33 prípadoch. Všetky vzorky boli okamžite fixované 10% formalínu, dehydratovaný a parafínových. Presné informácie o klinickej a patologickej diagnózy boli k dispozícii pre všetkých pacientov.

Imunohistochémia

Pre imunohistochémia, pripravené vzorky boli inkubované pri teplote 60 ° C počas 15 hodín a znížiť do 4 um silné oddiely, v deparafinizovány terpentín, vysuší sa a rehydratuje v klesajúcom etanol: destilovaná voda gradient. Endogénnej peroxidázy aktivita bola inaktivovaná inkubáciou počas 30 minút v 0,3% peroxidu vodíka v 0,01 M fosfátovom vyrovnanom fyziologickom roztoku (PBS). Rezy boli potom inkubované po dobu 15-20 minút v citrátovom pufri (pH 6,0) pri teplote 95 ° C počas získaní antigénu, blokovali sa 5% normálnym kozím sérom v PBS, 0,01 M po dobu 15 min pri 37 ° C, a inkubované s primárnymi protilátkami zriedenými v blokujúcim roztoku cez noc pri teplote 4 ° C vo vlhkej komore. Boli použité nasledujúce primárne protilátky: protilátky, myší anti-EGFL7 monoklonálna protilátka (abca, USA, 1: 400) a králičie monoklonálnou vznesené proti E-cadherinu (CST, USA, 1: 1000), vimentinu (CST, USA, 1: 1000 ), Slimák (Proteintech, USA, 1: 1000) a CD34 (Boster, Čína, 1: 500). Po premytí boli vzorky postupne inkubovali s biotinylizované sekundárne protilátka a streptavidín-chrenová peroxidáza (HRP) avidín pracovného roztoku. Immunolabeling bola vizualizované pomocou súpravy na DAB substrát od Zhongshan Golden Bridge Company (Čína) podľa odporúčania výrobcu. Nakoniec sa rezy boli kontrastne hematoxylínom (Vector Laboratories, USA) dehydrované vo vzostupnom etanol: destilovaná voda gradient, a namontované na sklíčka s použitím Permount montážneho média (Fisher Scientific, USA)

Kvantifikácia imunohistochemických signálov.

Všetky GC a okolitom normálnom žalúdočné tkaniva boli potvrdené histopatologicky dvoma nezávislými patológov (K.-SW a J.-HL) slepých na pôvodnú diagnóze. Imunologické sa triedi podľa semi-kvantitatívna metóda, ktorá zvažovali oba intenzitu a distribúciu farbenie [22]. Stručne povedané, päť náhodne vybraných polí pri nízkom zväčšení (100 x, Olympus BX51, Tokyo, Japonsko), a 200 nádorových buniek počítaných z každej oblasti. Intenzita sfarbenia bola hodnotená nasledovne: 0, žiadne farbenie; 1, slabé žlté sfarbenie; 2, žlté sfarbenie; 3, hnedé sfarbenie. Pozitívne bunky boli charakterizované jasnú hranicu a žlté alebo hnedé sfarbenie odlišné od pozadia. Percento pozitívnych buniek (PP) bola hodnotená nasledovne: 0, 0%; 1, 1% -25%; 2, 26% -50%; 3, 51% -75%; 4, 76% -100%. Oba výsledky boli spojené získať nasledovné klasifikácie: negatívne zafarbenie, vzorky s imunoreaktívnych skóre (IZS) zo 0-2; slabo pozitívne farbenie, vzorky s IZS 3-5; silne pozitívne farbenie vzorky s IZS 6 až 7. Vzorky, ktoré vykazovali slabo a silne pozitívne farbenie boli zahrnuté do štatistickej analýzy.

bunkových línií a kultúra

Human GC bunkové línie SGC7901 (stredne diferencovaný adenokarcinóm), BGC823 (zle diferencovaný adenokarcinóm), MKN28 (dobre diferencovaný adenokarcinóm), a MKN45 (zle diferencovaný adenokarcinóm), rovnako ako normálne žalúdočnej sliznice epitelu GES-1 bunky boli zakúpené od Type Culture Collection čínskej akadémie vied (Shanghai, Čína). Všetky bunky boli pestované a udržiavané v Roswell Park Memoriál Institute (RPMI) 1640 (Gibco Biocult, Paisley, UK) doplnenom 10% fetálnym hovädzím sérom (FBS) (Gibco Biotechnology), 100 U /ml penicilínu a 100 ug /ml streptomycínu pri 37 ° C vo zvlhčenej atmosfére obsahujúcej 5% CO _2.

Krátky vlásenka RNA (zhrnie) a Rekombinantný expresný plazmid Pex-2-EGFL7

Pre generovanie bunkových línií nadmerne exprimujúce alebo underexpressing EGFL7, prirodzené bunkové línie boli stabilne transfekované s expresným vektorom alebo cielené zhrnieme. V Zhrnieme sekvencie ľudského EGFL7 boli navrhnuté v súlade s EGFL7 sekvencie DNA človeka (GenBank NO NM_016215.3.) Zo strany Designer 3.0 softvéru (Genepharma, http://www.genepharma.com) a BLAST vyhľadávania (http: //www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Cieľové sekvencie boli porovnané s databázy genómu ľudského BLAST vyhľadávania, či nedošlo k vysokú homológie k iným kódujúcich sekvencií. Sekvencia EGFL7-homo-333 a EGFL7-homo-887 boli identifikované ako cieľové lokalít pre konkrétny EGFL7 zhrnieme. Okrem toho jeden nešpecifickej sekvencie (zhon zhrnie), bola navrhnutá ako negatívna kontrola, a GAPDH sekvencie bola navrhnutá ako vnútorná kontrola. Sekvencia Zhrňme boli nasledujúce:

EGFL7-shRNA1 proti EGFL7-homo-333: zmysle, 5'-CACCGGTGCTGCTGATGTGGCTTTCAAGAGAAGCCACATCAGCAGCACCTTTTTTG-3 '; antisencie, 5'-GATCCAAAAAAGGTGCTGCTGATGTGGCTTCTCTTGAAAGCCACATCAGCAGCACC-3 '; EGFL7-shRNA2 proti EGFL7-homo-887: zmysel, 5'-CACCGAGTGGACAGTGCAATGAATTCAAGAGATTCATTGCACTGTCCACTCTTTTTTG-3 '; antisencie, 5'-GATCCAAAAAAGAGTGGACAGTGCAATGAATCTCTTGAATTCATTGCACTGTCCACTC-3 '; nešpecifické zmysel, 5'-ČAKK GTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3 '; antisencie, 5'-GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC-3 '; GAPDH zmysel, 5'-CACCGTATGACAACAGCCTCAAGTTCAAGAGA CTTGAGGCTGTTGTCATACTTTTTTG-3 '; antisencie, 5'-GATCCAAAAAAGTATGACAACAGCCTCAAGTCTCTTGAACTTGAGGCTGTTGTCATAC-3 '. PGPU6 /GFP /Neo (zelený fluorescenčný proteín, neomycín) vektor (Genepharma Company, Shanghai, Čína) bol použitý pre konštrukciu plazmidu. Nukleotidy boli žíhané a vložený do miest BamHI a HindIII a transformované do DH5a kompetentných E. coli. Duálny kanamycín /neomycínu-rezistentné kolónie boli vybrané a vektorové sekvencie potvrdené štiepenia štiepením a DNA sekvenovaním.

EGFL7 cDNA kódujúce sekvenciu amino 533-1353 bol subklonován do PEX-2 plasmidového vektora (Genepharma, Šanghaj, Čína), ktorú BglII /ECOR dvojitým trávenie a označený PEX-2-EGFL7. Rekombinantný plazmid bol amplifikovaný v DH5a kompetentných E. coli a vektorové sekvencie amplifikovanej pomocou PCR. Sekvenovania DNA bolo potvrdené, že rekombinantné plazmid obsahoval gén fragmentu EGFL7 rovnaký ako v GenBank (GenBank č. NM_016215.3). Kanamycín /neomycínu boli vybrané kolónie rezistentné a sekvencie potvrdené štiepenia štiepením a DNA sekvenovaním. Všetky primery boli navrhnuté a syntetizované Genepharma (Shanghai, Čína).

Stabilné transfekcia a G418 Selection

Ak chcete vytvoriť EGFL7-underexpressing klon (a riadna kontrola), BGC823 bunky boli nasadené na šesť no kultivačné doštičky v množstve 1 x 10 ^{6 /jamku a inkubované po dobu 24 hodín v médiu RPMI 1640 obsahujúcom 10% FBS vo zvlhčenej 5% CO _{2 atmosfére udržuje pri teplote 37 ° C. Bunky boli transfekovány 4 ug pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1, pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA2, pGPU6 /GFP /Neo-nešpecifické-zhrnieme, alebo pGPU6 /GFP /Neo-GAPDH-zhrnieme s použitím Lipofectamine 2000 transfekční činidlo (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) podľa návodu výrobcu. Po 24 hodinách boli bunky inkubované v G418 (Sigma, USA, 600 ug /ml) pre počiatočné výber, zriedený, schovať s nízkou hustotou (~ 1 bunka /jamka) a udržiavané v médiu s prídavkom G418 na polovičnej počiatočnej koncentrácie výberového počas ďalších 3 týždňov. Výsledné stabilné bunkové línie boli nazvané BGC2-13 (bunkové línie vyplývajúce z pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 stabilný transfekciu) a BGC-NC, je však doplnená o ďalšie štúdie. Hladina expresie EGFL7 bola hodnotená pomocou Western blot a real-time RT-PCR. Vytvoriť zvýšenú expresiou línie a zodpovedajúce kontrolné, MKN28 bunky boli schovať, transfekovány 4 ug PEX-2-EGFL7 alebo PEX-2 plazmidy, a vybrané ako je popísané pre BGC823 buniek, s výnimkou, že 500 ug /ml G418 bola použitá pre počiatočné výber. Výsledné stabilné bunkové línie boli nazvané MKN28-EGFL7 a MKN28-NC. Hladiny expresie EGFL7 v G418-rezistentných klonov boli hodnotené pomocou Western Blot a kvantitatívnej PCR v reálnom čase (QRT-PCR).}}

Analýza Western Blot

Potom, čo bunky dosiahli 80% -95% sútok, celková bielkovina bola extrahovaná extrakcie bunkový lyzát vyrovnávacej pamäte (Beyotime, Čína) obsahujúce inhibítory proteázy (1 mM fenylmetylsulfonyl fluorid). Lyzát celková koncentrácia proteínu sa stanoví za použitia testu bicinchoninic proteín kyselina kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Rovnaké množstvo proteínu (25 ug) z každej liečenej skupiny boli rozdelené na gélu pruhu o 8% dodecylsulfát sodný-polyakrylamidovom gélu (SDS-PAGE) a prenesené na polyvinylidendifluoridovou (PVDF) membrány (Millipore, Billerica, USA). Membrány boli následne inkubované s blokujúcim pufrom pozostávajúce z Tris-vyrovnanom fyziologickom roztoku (TBS) obsahujúcim 5% netučného sušeného mlieka po dobu 2 hodín pri teplote miestnosti a potom cez noc pri teplote 4 ° C v rovnakom pufri s jedným z týchto primárnych protilátok: anti EGFL7 (1: 500; abca Cambridge Science, UK). anti-E-cadherin, anti-vimentin, anti-Snail (všetko v 1: 1000; bunkovej signalizáciu Technology, CST, USA), anti-GAPDH (1: 10000, Protech), anti-EGFR, anti-fosfo-EGFR, anti-AKT, anti-fosfo-AKT, anti-EKR, a anti-fosfo-ERK (všetko 1: 800, Anbo Biotech Co., Ltd., USA). Immunolabeled Membrány boli potom inkubované s HRP-konjugovanou sekundárnou protilátkou (1: 2000, imunológia Consultants Laboratory, Inc., USA) po dobu 2 hodín pri teplote miestnosti. Po premytí TBST, proteínové pásy boli vizualizované pomocou rozšíreného systému detekcie chemiluminiscencie (Advansta Corporation, Menlo Park, Kalifornia, USA) podľa inštrukcií výrobcu. Expresia GAPDH bola použitá ako kontrola nanášania a bielkovín kvantifikovať pomocou UTHSCSA Image Tool 3.0. Expresie cieľového proteínu bola vypočítaná ako pomer intenzity pásma cieľového proteínu k GAPDH.

RNA extrakcia a PCR analýza

Bunky boli lyžovanie v činidle TRIzolu (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a celková RNA bola pripravená podľa návodu výrobcu. Prvé kmeň cDNA boli syntetizované PrimeScript RT reakčnej zostave s gDNA guma (Takara, Otsu, Japonsko) a amplifikovaný pomocou PCR s použitím nasledujúcich špecifických primerov: EGFL7 zmysel, 5'-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 '; antisencie, 5'-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 '. CDNA bola amplifikovaná GAPDH pre riadenie pre množstvo cDNA, prítomných v každej vzorke (zmysle, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 'antisencie, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'). PCR amplifikácia bola vykonaná pri 94 ° C po dobu 5 minút, nasleduje 30 cyklov pri teplote 94 ° C počas 30 s, 57 ° C počas 30 s a 72 ° C počas 40 s. PCR produkty boli separované na 1,0% agarózových géloch a cieľovej génovej expresie vyčíslené ako pomer intenzity cieľového génu pásmo k tomu GAPDH pomocou Image Tool 3.0 (The University of Texas Health Science Center, San Antonio, Texas, USA).

real-time PCR

Reakčná zmes PCR v reálnom čase sa skladala z 10 ul Premix Ex Taq (Probe qPCR), 0,2 uM každého primeru EGFL7 a GAPDH (pozri nižšie), 0,2 pmol /ml TaqMan sondy (EGFL7 alebo GAPDH) a 0,4 ul ROX (tetrapropano-6-carboxyrhodamine) referencie Dye II (Takara Bio, Shiga, Japonsko). Táto zmes sa spojí s 2 ul cDNA v každej jamke 96-jamkové doštičky v mikroampéroch (Applied Biosystems, CA, USA) a destilovaná voda sa používa k úprave na konečný objem 20 ul. Tieto priméry boli navrhnuté za použitia softvéru Primer Premier 6.0 balíka (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA): EGFL7: vpred, 5'-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 '; zvrátiť, 5'-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 '; GAPDH: vpred, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; zvrátiť, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 '. Všetky reakcie boli vykonávané na 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA). Thermocycle podmienky boli počiatočné denaturácia pri 95,8 ° C po dobu 30 sekúnd a následne 40 cyklov amplifikácie pri 95,8 ° C po dobu 6 sekúnd a 60,8 ° C počas 30 s.

Podobné experimentálne podmienky boli použité pre hodnotenie expresie iné gény s nasledujúcimi primermi: E-cadherinu: vpred, 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3 '; zvrátiť, 5'-AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 '; vimentin: vpred, 5'-GACGCCATCAACACCGAGTT-3 '; zvrátiť, 5'-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3 '; Snail: vpred, 5'-TGCTCCACAAGCACCAAGA-3 '; zvrátiť, 5'-GCAGAGGACACAGAACCAGAAA-3 '; GAPDH: vpred, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; zvrátiť, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 '. Reakčná zmes pre real-time PCR sa skladala z 10 ul SYBR Premix Ex TaqTM II, 1,6 ul každého priméru (0,4 uM), 0,4 ul ROX referenčného Dye, 2 ul templátové cDNA, a 6 ul diethylpyrokarbonát ošetrených voda. PCR v reálnom čase bola vykonaná na 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA) s nasledujúcimi podmienkami thermocycle: počiatočná denaturácia pri 95 ° C počas 10 sekúnd, nasledovalo 40 cyklov amplifikácie pri 95 ° C počas 5 s a 60 ° C počas 34 s.

Cell Test proliferácie

Bunková proliferácia bola odhadnutá podľa 3- [4,5-dimetyl-thiazol-2-yl] -2,5 difenyl tetrazolium bromidu (MTT) životaschopné bunky. Bunky boli nanesené na 96-jamkové doštičky v roku 2000 /jamka a kultivované po dobu 12, 24, 48, 72 a 96 hodín. Potom sa 20 ul MTT (Sigma) zásobného roztoku (5 mg /ml) sa pridá ku 200 ul média v každej jamke a doštičky boli inkubované po dobu ďalších 4 hodín pri teplote 37 ° C. Po dôkladnom odsatí kultivačného média, pridané 150 ul dimetylsulfoxidu (DMSO) do každej jamky, aby sa rozpustil formazánu kryštály z MTT o životaschopných buniek. Doštičky boli trepe na rotačnej platforme po dobu 10 minút a absorbancia meraná pri 490 nm za použitia čítačky mikrodoštičiek.

Plate Colony Formation Test

Bunky boli nasadené v množstve 200 /jamka v rovnakej šesť- jamkové doštičky, ako je používaný pre ďalšie testy pre hodnotenie tvorby kolónií v bunkovej priľnavé podmienok. Po 10 dňoch boli bunky zafarbené 1% Giemsa, a bol počítaný počet viditeľných kolónií. Index relatívnej formácie klon sa vypočítala ako priemerný počet kolónií /počet nasadených buniek x 100%.

Scratch hojenie rán Detekcia

Pre testovanie migráciu buniek, 5 × 10 ^{5 bunky /jamku boli umiestnené v šiestich jamkami potiahnutých 10 ug /ml fibronektínu (FN) a inkubované po dobu 24 hodín. Sa nárast bol potom narušený jednej nuly s použitím 200 ul pipety. Mikrofotografiami boli získané pri 0 ° C, 12, 24, 36, 48, a 72 hodín po poškriabaniu s mikroskopom s fázovým kontrastom (Olympus BX51, Japonsko). Počet buniek v poškriabané (neplodné) oblasti jamky bol počítaný v piatich oblastiach (zväčšenie: x 200). Všetky experimenty boli vykonávané v duplikátu.}

in vitro
invázie a migračné test

invázie buniek a migrácie boli hodnotené za použitia Transwellovy komory (Corning, New York, USA). Invázia testy boli vykonané v transwell komôr oddelených filtračných vložiek polykarbonátové membrány (8 um pórov) na 24-jamkové doštičky. Každá komora bola potiahnutá 100 ul 1:20 Matrigel (Becton, Dickinson and Company, New York, USA) v chladnom RPMI 1640 sa cez noc pri teplote 4 ° C. Následne sa bunky (5 x 10 ^{4 /ml x 200 ul) boli nasadené v hornej komore v médiu bez séra. Približne 800 ul média stabilizuje s 10 ug /ml fibronektínu bolo umiestnené v spodnej časti priestoru transwell komory ako chemoatraktantu. Po inkubácii po dobu 24 hodín pri teplote 37 ° C, zostávajúce nádorové bunky na hornom povrchu komory sa odstráni otrením s mokrými bavlnených tampónov. Napadajúce bunky na spodnom povrchu boli fixované 4% paraformaldehydom, zafarbené kryštálovú violeťou a počítajú pod mikroskopom s fázovým kontrastom (Olympus, Japonsko) pri x 200. Štyri nezávislé pokusy boli vykonané v troch opakovaniach pre všetky podmienky ošetrenie. In vitro
migračné testy boli vykonané za rovnakých podmienok ako invázia testy, ale s nižšími nenatieraných komory a za použitia 1 × 10 5 buniek /ml (200 ul).}

Anoikis test

poly-hydroxyethylmethakrylát (poly-HEMA, Sigma-Aldrich), ktorý inhibuje adhéziu buniek na kultivačné doštičky a ďalšie rastové povrchy, sa rekonštituuje v zmesi 95% etanolu na konečnú koncentráciu 12 mg /ml. Na prípravu poly-HEMA-potiahnutých dosiek, 2 ml tohto roztoku bolo pridané do každej jamky 6 jamkové doštičky a ponechaná uschnúť cez noc v laminárnym prúdením tkanivové kultúry kapotou. Potom sa 5 x 10 ^{4 bunky umiestnené v troch vyhotoveniach v každom poly-HEMA potiahnutých dobre s normálnym živnej pôde. Po 24 hodinách boli bunky zozbierané GC, opláchnuté PBS a resuspendované v 500 ul pufra Binding Buffer z annexinu V-PE /7-AAD Apoptóza Detection Kit (eBioscience, San Diego, USA). Resuspendovaného bunky z každej vzorky boli rozdelené do alikvótnych častí (100 ul) do štyroch skúmaviek. Tri skúmavky boli označené buď annexinu V-PE, 7-AAD, alebo oboma, zatiaľ čo štvrtý bola použitá ako kontrola neznačeného. Každá šarža sa potom analyzované prietokovou cytometriou na Beckman Coulter counter FC 500 (Beckman Coulter, Inc.). Percento apoptotických buniek bola odvodená ako súčet bunkových frakcií vykazujúcich skoré apoptózy (annexin V-pozitívnych) a neskoré apoptóze (7-AAD-pozitívne).}

xenoimplantátu Nude Mouse Model

Xenografting bunkových línií GC bola vykonaná v súlade s národnými smernicami pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat (publikácia č. 86-23, revidované 1985), bol schválený výborom pre Animal Care a užívanie Xiangyu nemocnice tretí, stredný Južnej University ( LLSC [LA] 2013-0010), a prispôsobený aktuálnym čínskeho zákona o ochrane zvierat (LLSC [LA] 2013 až 0010). bolo vyvinuté všetko úsilie na minimalizáciu počtu použitých myší a ich utrpenie.

Tridsať päť samíc Balb /c nahých myší starobe 4-6 týždeň boli zakúpené od SLAC pokusného zvieraťa Co. Ltd. (Shanghai, Čína) a sídli v individuálne ventilovaných klietkach. Myši boli náhodne rozdelené do BGC823, BGC-NC, BGC2-13, MKN28, MKN28-NC, MKN28-EGFL7 a riadiť PBS skupiny (n = 5 myší /skupina). Kultivované bunky boli zozbierané a resuspendované v PBS na 1 x 10 ^{8 buniek /0,2 ml. Suspenzia bola subkutánne do ľavej hornej končatiny každého nahé myši s výnimkou tých, u kontrolnej skupiny, ktoré boli injikované 0,2 ml PBS. Rast nádoru sa hodnotila každé 3 dni meraním priemerov nádorov s Vernier strmene. Objem nádoru (TV) bola vypočítaná podľa vzorca: (TV mm 3) = d 2 x D /2, kde d a D sú najkratšie a najdlhšie priemery, v tomto poradí. Myši boli usmrtené po 4 týždňoch po implantácii buniek a nádory boli extrahované a zvážené. Všetky pečeň boli skúmané na metastázy hematoxylínom a eosínu (H &E) farbenie. Nádory boli fixované v 10% formaldehydu, vložené do parafínu a nakrájame na 4 um silné oddiely. EGFL7 expresia bola stanovená pomocou imunohistochémia, ako je popísané vyššie.}

Štatistické analýzy

Všetky štatistické analýzy boli vykonávané s použitím SPSS verzia 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) pre Windows. Dáta sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka (SD), z najmenej troch nezávislých pokusov. Skupina prostriedky boli porovnané pomocou jednocestnej analýzy variance (ANOVA) s Student-Newman-Keuls (SNK), alebo najmenej významný rozdiel (LSD) testov pre post hoc párové porovnanie. Spearman Rank korelačný koeficient sa určovali korelácia medzi EGFL7 a EMT súvisiacich s úrovňou expresie proteínov v chirurgicky vyrezaných žalúdočné rakovinové tkanive. A P Hotel < 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú

Výsledky

EGFL7 Expresia bola zvýšená u karcinómu žalúdka bunkových línií ľudského

Western blot a RT. PCR bola vykonávaná pre porovnanie EGFL7 expresie v ľudských bunkových líniách GC SGC7901, BGC823, MKN45 a MKN28 na ktoré v normálnej žalúdočnej sliznici epitelových GES-1 buniek. Zvýšené hladiny EGFL7 boli nájdené u všetkých bunkových línií štyri GC v porovnaní s GES-1, s BGC823 a MKN28 zobrazenie najvyššej a najnižšej EGFL7 expresie, v uvedenom poradí, a to ako na proteín a mRNA (obrázkoch 1A a 1B). Z tohto dôvodu, BGC823 a MKN28 boli použité v nasledujúcich pokusoch na posúdenie účinkov EGFL7 expresie na proliferáciu, migráciu a metastatického potenciálu. zamestnaný sme stabilný transfekciu zhrnieme potlačiť EGFL7 expresiu v bunkách BGC823 a vytvorili ľudský EGFL7 high-expresného plazmidu (PEX-2-EGFL7) k zvýšeniu EGFL7 expresiu v bunkách MKN28.

konštruované sme dve zhrnieme plazmidovej vektory cielenie EGFL7 mRNA a vykonala QRT-PCR na posúdenie účinnosti týchto kandidátnych sekvencií zhrnieme potlačiť EGFL7 v porovnaní s nešpecifickými sekvencií. Sekvencia shRNA1 a shRNA2 dosiahnuť 75% a 30% inhibíciu EGFL7, v danom poradí (obrázok 1C), a tak účinnejšie shRNA1 bol použitý vo všetkých nasledujúcich pokusoch. V BGC823 línie stabilne prenesené s pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 alebo pGPU6 /GFP /Neo-nešpecifické-zhrnieme boli označené BGC2-13 a BGC-NC, resp. Tieto MKN28 línia stabilne transfekované PEX-2-EGFL7 a PEX-2-nešpecifické boli označené MKN28-EGFL7 a MKN28-NC, resp. Hladiny expresie EGFL7 proteínu a mRNA v G418-rezistentné klony boli tiež hodnotené pomocou Western Blot (obrázok 1D) a real-time RT-PCR (obrázok 1E). Výsledky ukázali výrazne znížili EGFL7 expresiu v bunkách v porovnaní s BGC2-13 BGC-NC buniek a významne zvýšenej expresie v MKN28-EGFL7 buniek v porovnaní s bunkami MKN28-NC (všetci P Hotel &0,05). Neboli zistené žiadne významné rozdiely v mRNA a expresie proteínu medzi BGC-NC a BGC bunkami alebo medzi MKN28-NC a MKN28 buniek (všetci P Hotel > 0,05).

EGFL7 Akciové GC Cell Invasion a migrácia, ale neovplyvnilo GC bunkovej proliferácie

vyšetrovať úlohu EGFL7 progresiu GC, najprv skúmalo, či EGFL7 tlmenia hluku alebo nadmerná expresia zmenila proliferácie, invazívne a migračné kapacity GC buniek. Poškriabaniu hojenie rán bola použitá na meranie migrácie stabilne transfekciou buniek. Rana bola generovaná v GC bunkovej monovrstvy jediným nuly a počtu buniek v hracom pásme v porovnaní so pri teplote 0 a 48 hodín. Uzavretie rany bolo v BGC2-13 kultúrach (underexpressing EGFL7) výrazne pomalšia v porovnaní s natívnym BGC823 a BGC-NC kultúr (32% vs.
100% a 98%, a to ako P
menšia ako 0,05) (obrázok 2A). Na rozdiel od toho uzáver bol podstatne rýchlejší v MKN28-EGFL7 kultúr (s nadmernou expresiou EGFL7) v porovnaní s MKN28 a MKN28-NC kultúr (99% vs.
49% a 50%, a to ako P Hotel <0,05) (obrázok 2B). Okrem toho, hojenie bližšie na nejaký čas po poškriabaniu (48 h) bola vyššia vo vysokom EGFL7 expresiou divokého typu BGC823 buniek v porovnaní s bunkami MKN28 nízkou expresiou divokého typu, čo naznačuje, že endogénne hladiny expresie tiež vplyv na migráciu.

transjamkových testy boli vykonané pre potvrdenie týchto zistení a ďalej skúmať vplyv EGFL7 na invazívnu potenciál BGC823 buniek, MKN28 buniek a príslušných stabilných mimické vrásky do Matrigelu. Tam boli výrazne menej EGFL7-underexpressing (BGC2-13) buniek v Matrigelu v porovnaní s BGC-NC a BGC823 buniek (25 ± 3,1 vs
76 ± 2,9 a 79 ± 5,7 buniek /jamku;. I P Hotel &0,05), čo ukazuje, že EGFL7 underexpression významne zníženú schopnosť invazívne (obrázok 2C). Rovnako tak je počet buniek BGC2-13 dosiahnutí dolnej Matrigelu bez dobre v transwell migrácie testoch bola významne znížená v porovnaní s BGC823 a BGC-NC buniek (19 ± 1,1 vs.
53 ± 2,9 a 54 ± 2,6 obaja P Hotel < 0,05) (obrázok 2C). Na rozdiel od toho EGFL7 nadmerná expresia v MKN28 bunkách významne zvýšená ako invázia do Matrigelu (MKN28-EGFL7: 79 ± 6.19 buniek /jamku, MKN28-NC: 40 ± 2,00 buniek /jamku, MKN28: 41 ± 4,22, ako P
< 0,05; obr 2D) a migrácia (MKN28-EGFL7: 67 ± 4,16, MKN28-NC: 33 ± 5,92, MKN28: 35 ± 3,7; oba P Hotel &0,05; Obrázok 2D).

• Ploche on: 346 prípadová štúdia pre laparoskopickú Spleen-Zachovanie No.10 lymfadenektómia pre proximálneho rakoviny žalúdka: jedného centra Štúdie
• Ploche ONE: Nadmerná jadrovej apoptózu vyvolávajúci faktor 1 zmenil Proteomická Profil Žalúdočné Cancer ľudské bunky MKN45 a indukovaná zástavu bunkového cyklu v G1 /S fáze