PLOS ONE: Fator de Crescimento Epidérmico-Like de domínio contendo proteína 7 (EGFL7) Melhora EGF Receptor-AKT Signaling, epitelial-mesenquimal de Transição, e metástase de células de câncer gástrico

Abstract

factor de crescimento epidérmico-como proteínas contendo o domínio 7 (EGFL7) é regulada em tumores epiteliais humanas e por isso é um biomarcador potencial de malignidade. De facto, estudos anteriores mostraram que a expressão elevada EGFL7 promove a infiltração e a metástase de carcinoma gástrico. A transição epitelial-mesenquimal (EMT) inicia a cascata metastática e dota as células cancerosas com capacidade invasiva e migratórias; No entanto, não se sabe se EGFL7 promove metástase pelo desencadeamento EMT. Descobrimos que EGFL7 foi sobre-expresso em várias linhas celulares de cancro gástrico humano (GC) e que a sobre-expressão promovida invasão celular e migração, conforme revelado por ferida zero e Transwell ensaios de migração. Por outro lado, shRNA mediada EGFL7 knockdown reduzida invasão e migração. Além disso, as células que sobre-expressam EGFL7 cresceu em tumores grandes e foram mais propensos a metastizar para o fígado em comparação com células underexpressing CG a seguir à injecção subcutânea em ratos. EGFL7 superexpressão protegida linhas celulares GC contra anoikis, proporcionando um mecanismo plausível para essa capacidade metastática reforçada. Em tumores gástricos humanos excisados, expressão de EGFL7 foi positivamente correlacionada com os níveis da vimentina mesenquimais marcador e a transcrição associada EMT-expressão do repressor do caracol, e negativamente correlacionada com a expressão do marcador de células E-caderina epitelial. Em linhas de células de GC, EGFL7 knockdown revertida sinais morfológicos de EMT e diminuiu tanto vimentina e expressão Caracol. Além disso, a sobre-expressão promovida EGFL7 receptor de EGF (EGFR) e proteína cinase B (AKT) fosfo-activação, efeitos marcadamente suprimido pelo inibidor da tirosina-cinase EGFR AG1478. Além disso, AG1478 também reduziu a elevada capacidade invasiva e migratórias de linhas de células que sobre-expressam GC EGFL7. Colectivamente, estes resultados sugerem fortemente que EGFL7 promove a metástase através da activação de EMT através de uma via de sinalização de EGFR-AKT-caracol. A interrupção da sinalização EGFL7-EGFR por AKT-Snail pode uma estratégia terapêutica promissora para o cancro gástrico

citação:. Luo B-H, Xiong F, Wang J-P, Li J-H, Zhong H, Liu Q-L, et al. (2014) Protein 7 (EGFL7) Fator de Crescimento Epidérmico-Like Domain-Contendo Melhora EGF Receptor-AKT Signaling, epitelial-mesenquimal de Transição, e metástase de células de câncer gástrico. PLoS ONE 9 (6): e99922. doi: 10.1371 /journal.pone.0099922

editor: Claudia D. ANDL, da Universidade Vanderbilt, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de novembro de 2013; Aceito: 19 de maio de 2014; Publicação: 19 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Luo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No. 81.001.080) e do Fundo Open-End para o valioso e precisão instrumentos de Centro Universitário do Sul (No. JJ3121). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (CG) é o quarto tumor maligno mais comum ea segunda principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo [1], [2]. Cerca de metade de todos os casos de GC ocorre em países do leste asiático, com particular incidências elevadas no Japão, Coreia e China [3], [4]. O progresso no tratamento sistémico do GC aumentou significativamente a sobrevivência a curto prazo; no entanto, a taxa de sobrevivência de cinco anos de pacientes GC permanece baixa devido à recidiva e metástase [5]. Além disso, os pacientes GC mais recentemente diagnosticados já mostram doença metastática, o que constitui um grande desafio terapêutico para oncologistas [6].

factor de crescimento epidérmico-como proteínas contendo o domínio 7 (EGFL7), também conhecido como estatina endotelial vascular , é um factor secretado derivado das células endoteliais que regula a formação de tubo vascular. Parker et al. [7] demonstraram que EGFL7 é crucial para a angiogénese durante a [8] embriogénese zebra peixes. Estudos recentes têm relatado a expressão elevada de EGFL7 em diversos tumores e linhas celulares de cancro, incluindo tumores renais, gliomas malignos, carcinomas hepatocelulares, cancros do cólon e [7] - [10]. Nós já demonstrou que EGFL7 também é sobre-expresso em carcinoma gástrico [11], e de expressão foi significativamente correlacionada com características patológicas, evolução clínica, prognóstico reservado, e as metástases [10], [12]. Portanto, EGFL7 é um fator preditivo candidato para progressão e metástase do câncer. No entanto, os mecanismos subjacentes aos efeitos de EGFL7 tumorigénicas não são claras.

A metástase é um processo multi-passos, que envolve a transição epitelial-mesenquimal (EMT) em que as células epiteliais polarizadas são convertidos em células mesenquimais [13], um fenótipo com maior capacidade invasiva e migratório [14]. A EMT é também um processo reversível que muitas vezes ocorre na frente invasiva de muitos cancros metastáticos [15]. Vários estudos têm mostrado que o EGF promove a migração de células de cancro e invasão concomitante com a activação de EMT [16] - [18]. Significativamente, EGFL7 contém dois domínios semelhantes a EGF, sugerindo alguma homologia funcional [9], [12]. No entanto, se EGFL7 realmente faz aumentar a EMT e promovem a metástase do câncer gástrico tem ainda a ser determinado. Além disso, os mecanismos moleculares pelos quais EMT é regulada em GC permanecem largamente desconhecidos. O dedo de zinco repressor de transcrição Snail é crítica para a reprogramação expressão do gene durante EMT, nomeadamente para a repressão da proteína endotelial de adesão célula-célula (E) -cadherin, a perda do qual é considerada como um importante evento precoce na EMT e necessária para metástase subsequente [ ,,,0],19].

O presente estudo teve como objetivo determinar se EGFL7 promove a metástase, desencadeando EMT. Descobrimos que EGFL7 superexpressão ativa a via EGFR-AKT, desencadeia EMT, e promove a invasão de células GC in vitro
e metástase in vivo
.

Materiais e Métodos

pacientes e Recolha de tecidos

tecidos de carcinoma gástrico foram obtidos de 79 pacientes do GC (58 machos e 21 fêmeas) tratados por ressecção cirúrgica do Departamento de Cirurgia do Hospital Xiangya, Centro Universitário do Sul (China). As cirurgias foram realizadas a partir de janeiro de 2010 a dezembro de 2012. Os pacientes foram 54,7 anos em média (intervalo: 28 a 82 anos). E recebeu nem quimioterapia nem radioterapia antes da cirurgia

Os pacientes foram informados de que os espécimes cirúrgicos faria ser utilizado para o diagnóstico patológico convencional e que os restantes tecidos pode ser usada para pesquisa. Nenhum dado pessoal paciente foi necessário para este estudo e os protocolos realizados sem risco, portanto, apenas o consentimento verbal informado foi exigido dos pacientes. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética da Xiangya Hospital, Centro Universitário do Sul (Permit Number: 201311389).

O estadiamento da doença foi definida de acordo com a sexta edição do sistema de estadiamento TNM da American Joint Committee on Cancer [ ,,,0],20], [21]. Os tumores foram bem diferenciados adenocarcinoma gástrico em 12 casos, moderadamente diferenciado em 34 casos, e pouco diferenciado em 33 casos. Todas as amostras foram imediatamente fixados em formalina a 10%, desidratados e embebidos em parafina. informação clínica precisa e diagnóstico patológico estavam disponíveis para todos os pacientes.

A imuno-histoquímica

para imuno-histoquímica, as amostras preparadas foram incubadas a 60 ° C durante 15 h e cortado em secções de 4 um de espessura, em desparafinadas terebintina, secou-se, e reidratadas em etanol decrescente: gradiente de água destilada. A actividade da peroxidase endógena foi inactivada por incubação durante 30 minutos em peróxido de hidrogénio a 0,3% em 0,01 M de solução salina tamponada com fosfato (PBS). As fatias foram então incubadas durante 15-20 minutos em tampão de citrato (pH 6,0) a 95 ° C para a recuperação de antigénio, bloqueadas com soro de cabra normal a 5% em 0,01 M PBS durante 15 min a 37 ° C, e incubados com anticorpos primários diluídos em solução de bloqueio durante a noite a 4 ° C numa câmara humidificada. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: anticorpos anti-EGFL7 anticorpo monoclonal de murganho (Abcam, EUA, 1:400) e monoclonais de coelho produzidos contra a E-caderina (CST, EUA, 1:1000), vimentina (CST, EUA, 1:1000 ), Caracol (Proteintech, EUA, 1:1000) e CD34 (Boster, China, 1:500). Após a lavagem, as amostras foram incubadas sucessivamente com uma solução de avidina biotinilada de anticorpo e estreptavidina-peroxidase de rábano secundário (HRP) a trabalhar. Imunomarcação foi visualizada utilizando o kit de substrato DAB de Zhongshan dourado Bridge Company (China) de acordo com as recomendações do fabricante. Finalmente, as secções foram contrastadas com hematoxilina (Vector Laboratories, EUA), desidratados em etanol ascendente: gradiente de água destilada, e montadas em lâminas com meios de montagem Permount (Fisher Scientific, EUA)

A quantificação de sinais de imuno-histoquímica.

Todos os GC e tecidos circundantes gástricas não neoplásicas foram confirmados histopatologicamente por dois patologistas independentes (K.-SW e J.-HL) cegos para o diagnóstico original. A imunocoloração foi classificada por um método semi-quantitativo, que considerada a intensidade e a distribuição da coloração [22]. Resumidamente, cinco campos foram selecionados aleatoriamente em pequeno aumento (100 ×, Olympus BX51, Tóquio, Japão), e 200 células tumorais contado a partir de cada campo. A intensidade da coloração foi pontuada como se segue: 0, sem coloração; 1, a coloração amarela fraca; 2, a coloração amarela; 3, de coloração marrom. As células positivas foram caracterizados por uma fronteira clara e coloração amarela ou castanha distinta do fundo. A percentagem de células positivas (PP) foi pontuado como se segue: 0, 0%; 1, 1% -25%; 2, 26% -50%; 3, 51% -75%; 4, 76% -100%. As duas pontuações foram combinados para obter a seguinte classificação: coloração negativa, as amostras com pontuação imunorreativa (IRS) de 0 a 2; fracamente coloração positiva, com amostras de IRS de 3 a 5; fortemente coloração positiva, com amostras de IRS de 6 a 7. As amostras que apresentaram fraca e forte coloração positiva foram incluídos na análise estatística.

Linhas Celulares e Cultura

linhas celulares GC humano SGC7901 (moderadamente adenocarcinoma diferenciado), BGC823 (adenocarcinoma pouco diferenciado), MKN28 (adenocarcinoma bem diferenciado) e MKN45 (adenocarcinoma pouco diferenciado), bem como normais da mucosa gástrica GES-1 epiteliais células foram adquiridos a partir do Type Culture Collection da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). Todas as células foram cultivadas e mantidas em Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Gibco Biocult, Paisley, UK) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Gibco Biotechnology), 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /ml estreptomicina a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO _2.

curto do gancho de cabelo de ARN (ARNsh) e de expressão recombinante O plasmídeo Pex-2-EGFL7

Para gerar linhas de células que sobre-expressam ou underexpressing EGFL7, as linhas celulares nativas foram estavelmente transfectadas com um vector de expressão ou shRNA alvo. As sequências shRNA de EGFL7 humano foram projetados de acordo com a sequência de DNA EGFL7 humana (GenBank NO NM_016215.3.) Por software Designer 3.0 (Genepharma, http://www.genepharma.com) e pesquisas BLAST (http: //www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). As sequências alvo foram comparadas com a base de dados do genoma humano, por pesquisa BLAST para garantir que não haja uma elevada homologia com outras sequências de codificação. As sequências EGFL7-homo-333 e EGFL7-homo-887 foram identificados como locais-alvo para um EGFL7 shRNA específico. Além disso, uma sequência não específica (precipitação shRNA) foi concebido como um controlo negativo, e a sequência de GAPDH foi concebido como um controlo interno. As sequências de shRNA foram como se segue:

EGFL7-shRNA1 contra EGFL7-homo-333: sentido, 5'-CACCGGTGCTGCTGATGTGGCTTTCAAGAGAAGCCACATCAGCAGCACCTTTTTTG-3 '; anti-sentido, 5'-GATCCAAAAAAGGTGCTGCTGATGTGGCTTCTCTTGAAAGCCACATCAGCAGCACC-3 '; EGFL7-shRNA2 contra EGFL7-homo-887: sentido, 5'-CACCGAGTGGACAGTGCAATGAATTCAAGAGATTCATTGCACTGTCCACTCTTTTTTG-3 '; anti-sentido, 5'-GATCCAAAAAAGAGTGGACAGTGCAATGAATCTCTTGAATTCATTGCACTGTCCACTC-3 '; inespecífica sentido, 5'-CACC GTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3 '; anti-sentido, 5'-GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC-3 '; GAPDH sentido, 5'-CACCGTATGACAACAGCCTCAAGTTCAAGAGA CTTGAGGCTGTTGTCATACTTTTTTG-3 '; anti-sentido, 5'-GATCCAAAAAAGTATGACAACAGCCTCAAGTCTCTTGAACTTGAGGCTGTTGTCATAC-3 '. O vector pGPU6 /GFP /Neo (proteína fluorescente verde, a neomicina) (Genepharma Company, Xangai, China) foi utilizado para a construção dos plasmídeos. Os nucleótidos foram emparelhados e inseridos nos locais BamHI e Hindi II e transformado em E. coli DH5a competentes-. canamicina colónias Dual /resistentes à neomicina foram seleccionados e as sequências do vector confirmada por digestão de restrição e sequenciação de ADN.

O ADNc que codifica a sequência de EGFL7 ácido amino 533-1353 foi subclonado num vector de plasmídeo pEX-2 (Genepharma, Xangai, China) por BglII /EcoRI dupla digestão e designado pEX-2-EGFL7. O plasmídeo recombinante foi amplificado em E. coli DH5a competente e a sequência do vector amplificado por PCR. A sequenciação do ADN confirmou que o plasmídeo recombinante contém um fragmento do gene EGFL7 idêntico ao que no GenBank (Genbank no. NM_016215.3). Canamicina /colónias resistentes à neomicina foram seleccionados e a sequência confirmada por digestão de restrição e sequenciação de ADN. Todos os iniciadores foram desenhados e sintetizados por Genepharma (Xangai, China).

A transfecção estável e G418 Seleção

Para estabelecer um clone EGFL7-underexpressing (e de controlo adequado), BGC823 células foram semeadas em seis -bem placas de cultura em 1 × 10 ^{6 /poço e incubou-se durante 24 h em meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS numa atmosfera humidificada de 5% de CO _{2 atmosfera mantida a 37 ° C. As células foram transf ectadas com 4 ug pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1, pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA2, pGPU6 /GFP /Neo-inespecífica-shRNA, ou pGPU6 /GFP /Neo-GAPDH-shRNA utilizando Lipofectamina 2000 reagente de transfecção (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) seguindo as instruções do fabricante. Após 24 h, as células foram incubadas em G418 (Sigma, EUA, 600 ug /ml) para a selecção inicial, diluiu-se, plaqueadas a baixa densidade (~ 1 célula /poço) e mantidas em meio de cultura suplementado com G418 a metade da concentração inicial de selecção durante mais 3 semanas. As linhas de células estáveis ​​resultantes foram nomeados BGC2-13 (linha celular resultante da pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 transfecção estável) e BGC-NC, e ampliado para estudos posteriores. O nível de expressão EGFL7 foi avaliada por Western blot e em tempo real de RT-PCR. Para estabelecer uma linha que sobre-expressam e controlo combinados, células MKN28 foram semeadas, transfectadas com 4 ug de PEX-2-EGFL7 ou PEX-2 plasmídeos, e seleccionados tal como descrito para BGC823 células, excepto que 500 ug /ml de G418 foi utilizado para a selecção inicial. As linhas de células estáveis ​​resultantes foram nomeados MKN28-EGFL7 e MKN28-NC. Os níveis de expressão de EGFL7 nos clones resistentes a G418 foram avaliadas por transferência de Western e quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR).}}

Análise Western Blot

Após as células atingiram 80% -95% confluência, proteína total foi extraído usando o tampão de extracção de lisado de células (Beyotime, China) contendo inibidores de proteases (fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM). concentração total de proteína de lisado foi determinada utilizando um kit de ensaio de proteína do ácido bicinconínico (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EUA). Quantidades iguais de proteína (25 ug) de cada grupo de tratamento foram separados por coluna de gel de 8% de sódio dodecil sulfato de electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e transferidos para difluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Billerica, EUA). As membranas foram incubadas sequencialmente com tampão que consiste de solução salina tamponada com Tris (TBS) contendo 5% de leite em pó desnatado durante 2 horas à temperatura ambiente e em seguida durante a noite a 4 ° C neste mesmo tampão com um dos seguintes anticorpos primários de bloqueio: anti- EGFL7 (1:500; Abcam Cambridge Ciência, UK). anti-caderina-E, anti-vimentina, anti-Snail (todos a 1:1000; Cell Signaling Technology, CST, EUA), anti-GAPDH (1:10000, Protech), anti-EGFR, anti-fosfo-EGFR, anti-AKT, anti-fosfo-AKT, anti-ERK e anti-fosfo-ERK (todos 1:800, Anbo Biotech Co., Ltd., EUA). immunolabeled membranas foram então incubadas com um anticorpo secundário conjugado com HRP (1:2000, Immunology Consultants Laboratory, Inc., EUA) durante 2 h à temperatura ambiente. Depois de se lavar com TBST, as bandas de proteína foram visualizadas usando o sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (Advansta Corporation, Menlo Park, Califórnia, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A expressão de GAPDH foi usada como um controlo de carga e proteínas quantificadas utilizando UTHSCSA Image Tool 3.0. a expressão da proteína alvo foi calculada como a razão entre a intensidade da banda da proteína alvo para GAPDH.

Extração de RNA e Análise de PCR

As células foram lisadas em reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e ARN total foi preparado de acordo com as instruções do fabricante. Os cDNAs da primeira estirpe foram sintetizados pelo kit de reagente PrimeScript RT com ADNg Borracha (Takara, Otsu, Japão) e amplificado por PCR utilizando os seguintes iniciadores específicos: EGFL7 sentido, 5'-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 '; anti-sentido, 5'-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 '. O ADNc de GAPDH foi amplificado para controlar a quantidade de ADNc presente em cada amostra (com sentido, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; anti-sentido, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'). A amplificação por PCR foi realizada a 94 ° C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 57 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 40 s. Os produtos de PCR foram separados em geles de agarose a 1,0% e a expressão do gene alvo quantificadas como a razão entre a intensidade da banda do gene alvo para que de GAPDH utilizando Image Tool 3.0 (Universidade do Texas Saúde Science Center, San Antonio, Texas, EUA).

-PCR em tempo real

A mistura de reacção para PCR em tempo real consistiu em 10 ul de pré-mistura Ex Taq (Sonda qPCR), 0,2 uM de cada iniciador EGFL7 e GAPDH (abaixo), 0,2 pmol /ml sondas TaqMan (EGFL7 ou GAPDH), e 0,4 ul ROX (tetrapropano-6-carboxirrodamina) tintura de Referência II (Takara Bio, Shiga, Japão). A mistura foi combinada com 2 ul de cDNA em cada poço de uma placa de 96 poços MicroAmp (Applied Biosystems, CA, EUA) e água destilada foi usada para ajustar a um volume final de 20 ul. Os seguintes iniciadores foram concebidos utilizando o pacote de software 6.0 Primer Premier (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, EUA): EGFL7: para a frente, 5'-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 '; reverso, 5'-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 '; GAPDH: para a frente, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; reverso, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 '. Todas as reacções foram realizadas num tempo real do sistema de PCR 7500 (Applied Biosystems, CA, EUA). condições Thermocycle foram desnaturação inicial a 95,8 ° C durante 30 s, seguida de 40 ciclos de amplificação a 95,8 ° C durante 6 s e 60,8 ° C durante 30 s.

condições experimentais semelhantes foram utilizados para avaliar a expressão de outros genes com os seguintes iniciadores: E-caderina: Atacante, 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3 '; reverso, 5'-AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 '; vimentina: para a frente, 5'-GACGCCATCAACACCGAGTT-3 '; reverso, 5'-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3 '; Caracol: para a frente, 5'-TGCTCCACAAGCACCAAGA-3 '; reverso, 5'-GCAGAGGACACAGAACCAGAAA-3 '; GAPDH: para a frente, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; reverso, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 '. A mistura de reacção para PCR em tempo real consistiu em 10 ul de SYBR Premix Ex TaqTM II, 1,6 pi de cada iniciador (0,4 uM), 0,4 ul de ROX corante de referência, 2 ul de ADNc molde, e 6 ul de dietil pirocarbonato-tratada água. PCR em tempo real foi realizada em um tempo real do sistema 7500 de PCR (Applied Biosystems, CA, EUA) com as seguintes condições thermocycle: desnaturação inicial a 95 ° C durante 10 s, seguido de 40 ciclos de amplificação a 95 ° C durante 5 s e 60 ° C durante 34 s.

Ensaio de proliferação celular

a proliferação celular foi estimada pelo 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5- difenil tetrazólio ensaio de células viáveis ​​(MTT). As células foram plaqueadas em placas de 96 poços a 2000 /poço e cultivadas durante 12, 24, 48, 72, e 96 h. Em seguida, 20 ul de solução de MTT (Sigma) estoque (5 mg /ml) foi adicionada a 200 ul de meio, em cada poço, e as placas foram incubadas durante mais 4 h a 37 ° C. Após aspiração cuidadosa do meio de cultura, 150 ul de dimetilsulfóxido (DMSO) foi adicionado a cada poço para dissolver cristais de formazano formados a partir de MTT pelas células viáveis. As placas foram agitadas numa plataforma rotativa durante 10 min e a absorvância medida a 490 nm utilizando um leitor de microplacas.
Formação

Placa Colony Ensaio

As células foram semeadas a 200 /po no mesmo seis bem como as placas utilizadas para outros ensaios para avaliar a formação de colónias de células em condições-aderente. Após 10 dias, as células foram coradas com 1% de Giemsa, e o número de colónias visíveis foi contado. O índice de formação clone relativo foi calculado número como médio de colónias /número de células semeadas × 100%.

Risco Wound Assays cura

Para testar a migração de células, 5 × 10 ^{5 células /poço foram semeadas em placas de seis poços revestidas com 10 ug /ml de fibronectina (FN) e incubou-se durante 24 h. A monocamada foi então interrompido por um único zero usando uma ponteira 200 mL. As micrografias foram obtidas a 0, 12, 24, 36, 48, e 72 h pós-zero com um microscópio de contraste de fase (Olympus BX51, Japão). O número de células no interior da região riscado (estéril) da micropoços foi contado em cinco campos (Ampliação: 200 x). Todos os experimentos foram realizados em duplicado.}

In vitro
Invasion and Migration Assay

invasão celular e migração foram avaliados utilizando transpo� câmaras (Corning, Nova York, EUA). Os ensaios foram conduzidos em Invasão Transwell câmaras separadas por inserções de filtro de membrana de policarbonato (8 uM poros) para placas de 24 poços. Cada câmara foi revestido com 100 ul de 01:20 de Matrigel (Becton, Dickinson and Company, Nova Iorque, EUA) em meio RPMI 1640 frio durante a noite a 4 ° C. Subsequentemente, as células (5 × 10 ^{4 /mL x 200 ul) foram semeadas na câmara superior em meio isento de soro. Cerca de 800 ul de meio condicionado com 10 ug /ml de fibronectina foi colocado no compartimento inferior da câmara de Transwell como um quimioatractor. Após incubação durante 24 h a 37 ° C, as células tumorais remanescentes na superfície superior da câmara foram removidas por limpeza com cotonetes de algodão molhado. Invadir as células na superfície inferior foram fixadas com paraformaldeído a 4%, coradas com violeta de cristal e contadas sob um microscópio de contraste de fase (Olympus, Japão) em 200 ×. Quatro experiências independentes foram realizados em triplicado em todas as condições de tratamento. In vitro
ensaios de migração foram realizadas sob as mesmas condições que os ensaios de invasão, mas com câmaras inferiores não revestidos e usando 1 × 10 5 células /ml (200 ul).}

anoikis ensaio

metacrilato de poli-hidroxietilo (poli-HEMA, Sigma-Aldrich), o qual inibe a adesão de células a placas de cultura e outras superfícies de crescimento, foi reconstituído em etanol a 95% para uma concentração final de 12 mg /ml. Para preparar as placas de poli-HEMA-revestidos, 2 ml desta solução foi adicionada a cada poço de uma placa de 6 poços e deixou-se secar durante a noite sob um fluxo laminar capuz de cultura de tecidos. Em seguida, 5 × 10 ^{4 células foram plaqueadas em triplicado em cada grupo poli-HEMA-revestidos bem com meio de cultura regular. Após 24 h, as células foram colhidas GC, lavadas com PBS e ressuspensas em 500 ul de tampão de ligação a partir de uma anexina V-PE /7-AAD Apoptosis Detection Kit (eBioscience, San Diego, EUA). células ressuspensas de cada amostra foram aliquotadas (100 ul) em quatro tubos. Três tubos foram marcadas quer com Anexina V-PE, 7-AAD, ou ambos, enquanto que a quarta foi usada como um controlo não marcado. Cada lote foi então analisada por citometria de fluxo em um Beckman Coulter FC 500 contador (Beckman Coulter, Inc.). A percentagem de células apoptóticas foi obtida como a soma das fracções de células que exibem apoptose precoce (anexina V-positivo) e apoptose tardia (7-AAD-positivo).}

Xenoenxerto do ratinho nu Modelo

xeno de linhas de células de GC foi realizada de acordo com as Diretrizes Nacionais para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório (publicação no. 86-23, revista, 1985), foi aprovado pelo Comitê animal Care and Use of a Xiangya Hospital Terceiro, Centro Universitário do Sul ( LLSC [LA] 2013-0010), e conformes à lei chinesa atual sobre a protecção dos animais (LLSC [LA] 2013-0010). Todos os esforços foram feitos para minimizar o número de ratos utilizados e seu sofrimento.

Trinta e cinco fêmeas Balb /c nu idade camundongos 4 a 6 semanas foram adquiridos de SLAC Animais de Laboratório Co. Ltd. (Xangai, China) e alojados em gaiolas ventiladas individualmente. Os ratos foram divididos aleatoriamente em BGC823, BGC-NC, BGC2-13, MKN28, MKN28-NC, MKN28-EGFL7, e controlar grupos PBS (n = 5 ratos /grupo). As células em cultura foram colhidas e ressuspensas em PBS a 1 × 10 ^{8 células /0,2 ml. A suspensão foi injectada por via subcutânea na extremidade superior esquerda de cada ratinho nu, excepto para aqueles no grupo de controlo, que foram injectados com 0,2 ml de PBS. O crescimento do tumor foi avaliada a cada 3 dias, medindo os diâmetros do tumor com compassos de calibre de Vernier. O volume do tumor (TV) foi calculada de acordo com a fórmula: TV (mm 3) = d 2 × D /2, onde d e D são os mais curtos e os diâmetros maior, respectivamente. Os ratinhos foram sacrificados 4 semanas após a implantação da célula, e os tumores foram extraídos e pesados. Todos os fígados foram examinadas para a metástase por hematoxilina e eosina (H & E) de coloração. Os tumores foram fixadas em formalina a 10%, embebidos em parafina e cortada em secções de 4 um de espessura. expressão EGFL7 foi determinada por imuno-histoquímica, como descrito acima.}

Análises Estatísticas

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa SPSS versão 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA) para Windows. Os dados são expressos como média ± desvio padrão (DP) de pelo menos três experiências independentes. as médias do grupo foram comparadas por análise de uma via de variância (ANOVA) com testes menor diferença significativa (LSD) para comparações de pares post hoc de Student-Newman-Keuls (SNK) ou. O coeficiente de correlação de Spearman foi utilizado para determinar as correlações entre EGFL7 e os níveis de expressão de proteínas relacionadas com a EMT em tecidos com câncer gástrico cirurgicamente excisadas. A P Art < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

EGFL7 Expressão foi elevada em linhas celulares de cancro gástrico humano

Western blot e RT. PCR foram realizadas para comparar a expressão EGFL7 nas linhas celulares humanas GC SGC7901, BGC823, MKN45, e MKN28 para que em normais da mucosa gástrica GES-1 epiteliais células. Níveis elevados de EGFL7 foram encontrados em todas as quatro linhas celulares em comparação com GC GES-1, com BGC823 e MKN28 exibindo a expressão mais alta e mais baixa EGFL7, respectivamente, tanto na proteína e níveis de ARNm (Figuras 1A e 1B). Portanto, BGC823 e MKN28 foram utilizados em experiências posteriores para avaliar os efeitos da expressão EGFL7 sobre a proliferação, migração, e o potencial metastático. Nós empregamos estável transfecção shRNA para suprimir a expressão EGFL7 em BGC823 células e desenhou um EGFL7 humana de alta expressão plasmídeo (PEX-2-EGFL7) para aumentar a expressão EGFL7 em células MKN28.

Foram construídos dois vectores de plasmídeo shRNA alvo EGFL7 ARNm e conduzida qRT-PCR para avaliar a eficácia destas sequências shRNA candidatos para suprimir EGFL7 em comparação com sequências não específicas. As sequências shRNA1 e shRNA2 alcançado 75% e 30% de inibição da EGFL7, respectivamente (Figura 1C), de modo que o shRNA1 mais eficiente foi usada para todas as experiências subsequentes. As linhas BGC823 estavelmente transfectadas com pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 ou pGPU6 /GFP /Neo-inespecífica-shRNA foram designados BGC2-13 e BGC-NC, respectivamente. As linhas MKN28 estavelmente transfectadas com pEX-2-EGFL7 e do PEX-2-inespecífica foram designados MKN28-EGFL7 e MKN28-NC, respectivamente. Os níveis de expressão de proteína e ARNm EGFL7 nos clones resistentes a G418 foram também avaliadas por transferência de Western (Figura 1D) e em tempo real de RT-PCR (Figura 1E). Os resultados mostraram marcadamente diminuída EGFL7 expressão em células BGC2-13 comparação com células BGC-NC e significativamente elevados de expressão em células MKN28-EGFL7 em comparação com células MKN28-NC (All P
< 0,05). Não houve diferenças significativas no mRNA e expressão de proteínas entre as células BGC-NF e BGC ou entre as células MKN28-NF e MKN28 (todos os P Art > 0,05).

EGFL7 Promovido Invasion GC celular e migração, mas não afetou GC Proliferação celular

Para investigar o papel do EGFL7 na progressão GC, primeiro analisou se EGFL7 silenciamento ou a sobre-expressão alterou a proliferativa, invasivo e capacidades migratórias de células GC. cicatrização de feridas zero foi utilizado para medir a migração de células transfectadas de forma estável. Uma ferida foi gerado em monocamadas de células GC por um único zero e o número de células na zona do zero em relação a 0 e 48 h. Fechamento da ferida foi significativamente mais lento no BGC2-13 culturas (underexpressing EGFL7) em comparação com BGC823 nativa e culturas BGC-NC (32% vs.
100% e 98%, tanto P
< 0,05) (Figura 2A). Em contraste, o fechamento foi significativamente mais rápida em culturas MKN28-EGFL7 (que sobre-expressam EGFL7) em comparação com culturas MKN28 e MKN28-NC (99% vs.
49% e 50%, ambos P <
; 0,05) (Figura 2B). Além disso, feridas mais de perto a algum tempo pós-zero (48 h) foi maior em alta tipo selvagem que expressam EGFL7 BGC823 células em comparação com células que expressam baixos tipo selvagem MKN28, indicando que os níveis de expressão endógenos também impacto na migração.

ensaios Transwell foram realizados para confirmar estes resultados e investigar o efeito de EGFL7 no potencial invasivo da BGC823 células, MKN28 células, e as respectivas linhas de expressão estáveis ​​em Matrigel. Houve significativamente menos EGFL7-underexpressing células (BGC2-13) no Matrigel em comparação com BGC-NC e BGC823 células (25 ± 3.1 vs
76 ± 2,9 e 79 ± 5,7 células /poço;. P
< 0,05), indicando que EGFL7 subexpressão significativa redução da capacidade invasiva (Figura 2C). Da mesma forma, o número de células alcance BGC2-13 o bem-Matrigel livre inferior em Transwell ensaios de migração foi significativamente reduzida em comparação com as células e BGC823 BGC-NC (19 ± 1.1 vs.
53 ± 2,9 e 54 ± 2.6 , tanto P Art < 0,05) (Figura 2C). Em contraste, EGFL7 superexpressão em MKN28 células aumentou significativamente tanto a invasão em Matrigel (MKN28-EGFL7: 79 ± 6,19 células /poço, MKN28-NC: 40 ± 2,00 células /poço, MKN28: 41 ± 4,22; ambos P
< 0,05; Figura 2D) e migração (MKN28-EGFL7: 67 ± 4,16, MKN28-NC: 33 ± 5,92, MKN28: 35 ± 3,7; ambos P Art < 0,05; Figura 2D).

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