PLoS One: epidermális növekedési faktor-szerű domént tartalmazó fehérje 7 (EGFL7) Javítja az EGF receptor-AKT jelzés és az epithelialis-mesenchymalis átmenet, és metasztázis gyomorrák Cells

absztrakt katalógusa

Az epidermális növekedési faktor szerű domén -tartalmú fehérje 7 (EGFL7) felülszabáiyoződik humán epithelialis tumorok és így potenciális biomarker rosszindulatú. Valóban, a korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a magas EGFL7 expresszió elősegíti a beszivárgása és metasztázis gyomorrák. Az epithelialis-mesenchymalis tranzíció (EMT) kezdeményezi a metasztatikus kaszkád és felruházza a rákos sejtek invazív és a migrációs kapacitása; Azonban ez nem ismert, ha EGFL7 elősegíti metasztázis által kiváltó EMT. Azt találtuk, hogy EGFL7 volt túltermelõdik több humán gyomorrák (GC) sejtvonalak és túltermelése támogatni sejtek invázióját és a migráció által feltárt karcolás tekercses transzwell migrációs vizsgálatokban. Ezzel szemben shRNS közvetített EGFL7 knockdown csökkent invázió és a migráció. Továbbá EGFL7 overexpresszáló sejtek nőtte nagyobb tumorok és nagyobb valószínűséggel áttétet a májba képest underexpressing CG sejtekben szubkután injekció egerekben. EGFL7 túltermelése védett GC sejtvonalak ellen anoikis, amely egy plauzibilis mechanizmusa a megerősített metasztatikus képességét. Ebben kimetszett emberi gyomor daganatok, kifejezése EGFL7 pozitív korrelációt mutatott a expressziós szintje mesenchymalis marker vimentin és az EMT-asszociált transzkripciós represszor csiga, és negatívan korrelált a kifejezés a hámsejt marker E-cadherin. GC sejtvonalak, EGFL7 akciós fordított morfológiai jelei EMT és csökkentette vimentin Csiga kifejezést. Ezen túlmenően, EGFL7 túlexpressziója mozdítani az EGF receptor (EGFR) és a protein-kináz B (AKT) foszfo-aktiválás, hatások jelentősen elnyomta az EGFR tirozin-kináz-inhibitor AG1478. Sőt, AG1478 is csökkentette az emelkedett invazív és migrációs képességét GC sejtvonalak túltermelő EGFL7. Együttesen ezek az eredmények arra utalnak, hogy EGFL7 elősegíti metasztázis aktiválásával EMT keresztül EGFR-AKT-Csiga jelátviteli. Roncsolása EGFL7-EGFR-Akt-csiga jelátvitel ígéretes terápiás stratégiát gyomorrák.

bevezető hivatkozás: Luo B-H, Xiong F, Wang J-P, Li J-H, Zhong M, Liu Q-L, et al. (2014) az epidermális növekedési faktor-szerű domént tartalmazó fehérje 7 (EGFL7) Javítja az EGF receptor-AKT jelzés és az epithelialis-mesenchymalis átmenet, és metasztázis gyomorrák sejtek. PLoS ONE 9 (6): e99922. doi: 10,1371 /journal.pone.0099922 katalógusa

Szerkesztő: Claudia D. andl, Vanderbilt University, Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: november 15, 2013; Elfogadva: 19. május 2014; Megjelent: június 19, 2014 katalógusa

Copyright: © 2014 Luo et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatott Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (No. 81001080), valamint a nyílt végű alap az értékes és precíziós műszerek Közép-Dél Egyetem (No. JJ3121). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák (GC) a negyedik leggyakoribb rosszindulatú daganat a második vezető oka a rákkal összefüggő halálozás világszerte [1], [2]. Körülbelül fele GC esetek a kelet-ázsiai országban, különösen magas előfordulási Japánban, Koreában és Kínában [3], [4]. Haladás a szisztémás kezelése GC jelentősen nőtt a rövid távú túlélés; azonban az ötéves túlélési arány GC betegek továbbra is csekély, a visszaesés és a metasztázis [5]. Sőt, a legtöbb újonnan diagnosztizált GC betegek már mutatják áttétes betegség, ami jelentős terápiás kihívás onkológusok [6].

epidermális növekedési faktor-szerű domént tartalmazó protein 7 (EGFL7), más néven vaszkuláris endoteliális sztatin , egy endoteliális sejt-eredetű szekretált faktor, amely szabályozza a vaszkuláris csőképződést. Parker et al. [7] kimutatták, hogy EGFL7 elengedhetetlen angiogenezis során zebrahal embriogenezis [8]. A legújabb tanulmányok arról számoltak be, megemelkedett expressziója EGFL7 több tumorok és rákos sejtvonalakban, beleértve a vese daganatok, rosszindulatú gliómák, hepatocelluláris karcinómák, és vastagbélrák [7] - [10]. Korábban kimutatták, hogy EGFL7 is túltermelõdik gyomorrák [11], és a kifejezés szignifikáns korrelációt mutatott kóros jellemzőit, a klinikai progresszió, rossz prognózisú és metasztázis [10], [12]. Ezért EGFL7 egy jelölt prediktív tényező a rák kifejlődésének, valamint az áttétek. Azonban azok a mechanizmusok alapjául szolgáló tumorkeltő hatását EGFL7 nem világos.

Metastasis egy többlépcsős folyamat, amely magában foglalja egy epiteliális-mezenchimális átmenet (EMT), amely polarizált hámsejtek alakítjuk mesenchymalis sejtek [13], fenotípus nagyobb inváziós és migrációs kapacitása [14]. Az EMT is egy reverzibilis folyamat, amely gyakran fordul elő a invazív előtt sok metasztázisos rákok [15]. Több tanulmány kimutatta, hogy az EGF elősegíti a rákos sejtek migrációját és invázióját egyidejű aktiválásával EMT [16] - [18]. Jelentősen, EGFL7 tartalmaz két EGF-szerű domént, ami arra utal, néhány funkcionális homológia, [9] [12]. Azt azonban, hogy EGFL7 valójában nem növeli EMT és elősegíti gyomorrák áttétek még nem határozták meg. Sőt, a molekuláris mechanizmusok, amelyek EMT szabályozott GC nagyrészt ismeretlen. A cink-ujj transzkripciós represszor Csiga kritikus a génexpressziós átprogramozás alatt EMT, nevezetesen elnyomás a sejt-sejt adhéziós fehérje endothel (E) -cadherin, a veszteség, amely tekinthető egy fontos korai esemény EMT és szükséges a későbbi metasztázis [ ,,,0],19]. katalógusa

A jelen tanulmány célja, hogy meghatározza, ha EGFL7 elősegíti metasztázisok által kiváltó EMT. Azt találtuk, hogy EGFL7 túltermelése aktiválja az EGFR-AKT útvonal, kiváltja EMT, és elősegíti a GC sejtek invázióját in vitro katalógusa és metasztázis in vivo katalógusa.

Anyagok és módszerek

a betegek és Tissue Collection katalógusa

a gyomor karcinómaszövetek kaptuk 79 GC beteg (58 férfi és 21 nő) kezelt sebészeti kimetszés, a Department of Surgery, Xiangya Kórház, Közép-Dél Egyetem (Kína). Műtétek végeztek Jan 2010 december 2012. A betegek 54,7 éves átlagban (tartomány: 28-82 év), és kapta meg sem kemoterápiát sem sugárkezelést a műtét előtt. Katalógusa

A betegek tájékoztatták, hogy sebészeti mintákban lenne lehet használni hagyományos patológiai diagnózis és hogy a fennmaradó szöveteket is fel lehet használni a kutatás. Nem személyes páciens adatokra szükség erre a vizsgálatra, és a protokollok elvégzett nincs kockázat, így csak szóbeli beleegyezését kell biztosítani a betegek számára. A protokollt jóváhagyta Etikai Bizottsága Xiangya Kórház, Közép-Dél Egyetem (engedély száma: 201311389). Katalógusa

A betegség stádium szerint definiálták a hatodik alkalommal a TNM stádium rendszerben az American Joint Committee on Cancer [ ,,,0],20], [21]. A tumorokat jól differenciált gyomor adenokarcinóma 12 esetben, közepesen differenciált 34 esetben, és rosszul differenciált 33 esetben. Minden mintát közvetlenül rögzített 10% -os formalin, dehidratált, és paraffinba ágyaztuk. Pontos klinikai információ és patológiai diagnózis voltak minden páciensnél áll rendelkezésre.

Immunhisztokémia

immunhisztokémia, elkészített mintákat inkubáltuk 60 ° C-on 15 órán és vágjuk 4 um vastag metszeteket, paraffint a terpentin, szárítjuk és rehidratáltuk egy csökkenő etanol: desztillált víz gradiens. Az endogén peroxidáz aktivitást inaktiváltuk inkubálás 30 percig 0,3% hidrogén-peroxidot tartalmazó 0,01 M foszfát-pufferolt sóoldattal (PBS). A szeleteket ezután inkubáltuk 15-20 percig citrát-pufferrel (pH = 6,0) 95 ° C-antigén visszakeresés, blokkoltuk 5% -os normál kecske szérummal 0,01 M PBS-ben 15 percen át 37 ° C-on, és inkubáltuk primer antitestekkel hígított blokkoló oldatot egy éjszakán át 4 ° C-on, nedvesített kamrában. A következő primer antitesteket használtuk: egér anti-EGFL7 monoklonális antitest (ABCAM, USA, 1:400), és nyúl monoklonális antitestek ellen E-kadherin (CST, USA, 1:1000), vimentin (CST, USA, 1:1000 ), csiga (Proteintech, USA, 1:1000) és CD34 (Boster, Kína, 1:500). Mosás után a mintákat egymás után inkubáltuk biotinilált másodlagos antitesttel és streptavidin-torma-peroxidáz (HRP) avidin munkaoldat. Immunfestést tettük az DAB szubsztrát kit Zhongshan Golden Bridge Company (Kína), a gyártó ajánlásainak megfelelően. Végül a metszeteket hematoxilinnel ellenfestettük (Vector Laboratories, USA), dehidratált egy növekvő etanol: desztillált víz gradiens, és szerelt csúszda használatával Permount szerelési Media (Fisher Scientific, USA).

számszerűsítése immunhisztokémiai Signals

Minden GC és a környező, nem daganatos szövetekben gyomor megerősítette szövettanilag két független patológusok (K.-SW és J.-HL) vakok az eredeti diagnózist. Immunfestést osztályozni félkvantitatív módszer, amely tekinthető mind az intenzitását és eloszlását a festődés [22]. Röviden, öt területen véletlenszerűen kiválasztott kis nagyítás (100 × Olympus BX51, Tokió, Japán), és 200 tumor sejtek számát minden területen. A festődés intenzitása pontoztuk a következők szerint: 0, nincs festés; 1, gyenge sárga festést 2, sárga festést 3, barna festődés. Pozitív sejtet jellemezte egyértelmű határ és sárga vagy barna festődés megkülönböztethető a háttértől. A pozitív sejtek százalékos aránya (PP) pontoztuk a következők szerint: 0, 0%; 1, 1% -25%; 2, 26% -50%; 3, 51% -75%; 4, 76% -100%. A két pontszámok egyesítjük, így a következő osztályozás: negatív festés minták immunreaktív pontszám (IRS) 0-2; gyengén pozitív festődés, mintákat IRS 3 és 5; erősen pozitív festés minták IRS 6 és 7 minták, amelyek azt mutatták, gyengén és erősen pozitív festéssel kerültek a statisztikai elemzés. katalógusa

Sejtvonalak és tenyésztési katalógusa

Az emberi GC sejtvonalak SGC7901 (mérsékelten differenciált adenocarcinoma), BGC823 (gyengén differenciált adenocarcinoma), MKN28 (jól differenciált adenocarcinoma) és MKN45 (gyengén differenciált adenocarcinoma), valamint a normál gyomornyálkahártya epithelialis GES-1 sejteket vásárolt a Type Culture Collection, a kínai Tudományos Akadémia (Sanghaj, Kína). Minden sejteket tenyésztettünk és karbantartani, Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 közegben (Gibco Biocult, Paisley, UK), kiegészítve 10% magzati borjúszérummal (FBS) (Gibco Biotechnology), 100 U /ml penicillinnel és 100 ug /ml-es sztreptomicint, 37 ° C-on nedvesített atmoszférában, amely 5% CO _2.

rövid hajtű-(shRNS) és a rekombináns expressziós plazmid Pex-2-EGFL7

sejtvonalak létrehozására túltermelő vagy underexpressing EGFL7, a natív sejtvonalak stabilan transzfektáltunk egy expressziós vektorral, vagy a célzott shRNS. Az shRNS szekvenciák humán EGFL7 terveztünk az emberi EGFL7 DNS-szekvencia (GenBank NO. NM_016215.3) által tervező 3.0 szoftver (Genepharma, http://www.genepharma.com) és BLAST keresések (http: //www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). A cél-szekvenciákat összehasonlítottuk az emberi genom adatbázisban BLAST keresés biztosítása nem magas homológiát más kódoló szekvenciákat. A szekvenciák EGFL7-homo-333 és EGFL7-homo-887 azonosítottak célwebhelyek egy adott EGFL7 shRNS. Ezen túlmenően, egy nem specifikus szekvenciát (Scramble shRNS) célja az volt, mint a negatív kontroll, és a GAPDH-szekvencia volt a célja, mint belső kontroll. Az shRNS szekvenciák a következők voltak:

EGFL7-shRNA1 ellen EGFL7-homo-333: az értelemben, 5'-CACCGGTGCTGCTGATGTGGCTTTCAAGAGAAGCCACATCAGCAGCACCTTTTTTG-3 '; antiszensz, 5'-GATCCAAAAAAGGTGCTGCTGATGTGGCTTCTCTTGAAAGCCACATCAGCAGCACC-3 '; EGFL7-shRNA2 ellen EGFL7-homo-887: az értelemben, 5'-CACCGAGTGGACAGTGCAATGAATTCAAGAGATTCATTGCACTGTCCACTCTTTTTTG-3 '; antiszensz, 5'-GATCCAAAAAAGAGTGGACAGTGCAATGAATCTCTTGAATTCATTGCACTGTCCACTC-3 '; nem specifikus értelemben, 5'-CACC GTTCTCCGAACGTGTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG-3 '; antiszensz, 5'-GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGACGTGACACGTTCGGAGAAC-3 '; GAPDH értelemben, 5'-CACCGTATGACAACAGCCTCAAGTTCAAGAGA CTTGAGGCTGTTGTCATACTTTTTTG-3 '; antiszensz, 5'-GATCCAAAAAAGTATGACAACAGCCTCAAGTCTCTTGAACTTGAGGCTGTTGTCATAC-3 '. A pGPU6 /GFP /Neo (zöld fluoreszcens fehérje, neomicin) vektort (Genepharma Company, Shanghai, Kína) alkalmaztunk a plazmid konstrukció. A nukleotidokat összeforrasztjuk, és beiktatjuk a BamHI és HindIII helyei, és átalakult DH5a-kompetens E. coli-ban. Kettős kanamicin /neomicin-rezisztens telepet szelektálunk, és a vektor szekvenciákat restrikciós emésztéssel és DNS-szekvenálással.

A EGFL7 kódoló cDNS-t a 533-1353 aminosav szekvenciát szubklónoztuk pEX-2 plazmid vektor (Genepharma, Sanghaj, Kína) BglII /EcoRI kettős emésztéssel és a kijelölt pEX-2-EGFL7. A rekombináns plazmidot amplifikáltuk DH5a-kompetens E. coli és a vektor szekvencia PCR-rel amplifikáltuk. DNS szekvenálás megerősítette, hogy a rekombináns plazmidot tartalmazott EGFL7 génfragmenst megegyezik a GenBank (GenBank NO. NM_016215.3). A kanamicin /neomicin-rezisztens telepet szelektálunk, és a szekvenciát igazoltuk restrikciós emésztéssel és DNS-szekvenálással. Minden primereket terveztünk, és szintetizálják Genepharma (Sanghaj, Kína). Katalógusa

Stabil transzfektálása és G418 katalógusa

létre EGFL7-underexpressing klón (és a megfelelő kontroll), BGC823 sejtet oltottunk hat -Nos kultúra lemezeket 1 × 10 ^{6 /, és az inkubálást 24 órán át RPMI 1640 közegben, amely 10% FBS-t, párásított 5% -os CO _{2 atmoszféra 37 ° C-on. A sejteket transzfektáltuk 4 ng pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1, pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA2, pGPU6 /GFP /Neo-nemspecifikus-shRNS, vagy pGPU6 /GFP /Neo-GAPDH-shRNS Lipofectamine 2000 transzfekciós reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a gyártó utasításai szerint. 24 óra elteltével a sejteket inkubáltuk G418-at (Sigma, Amerikai Egyesült Államok, 600 ng /ml) a kezdeti kiválasztás, hígított, bevont, alacsony sűrűségű (~ 1 sejt /mérőhely) és karbantartani, kiegészített táptalajon G418 fele a kezdeti kiválasztás koncentráció további 3 héten át. A kapott stabil sejtvonalakat elemzi BGC2-13 (sejtvonal eredő pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 stabil transzfekció) és BGC-NC, és kibővített a későbbi vizsgálatokban. Az expressziós szintjének EGFL7 értékeltük Western blot és a valós idejű RT-PCR-rel. Annak megállapítására, egy túltermelő vonalat, és kontroll, MKN28 sejteket oltottunk, transzfektáltunk 4 ng PEX-2-EGFL7 vagy pEX-2 plazmidok, és a kiválasztott leírtak BGC823 sejtek, kivéve, hogy 500 ng /ml G418-at használtunk a kezdeti kiválasztáshoz. A kapott stabil sejtvonalakat elemzi MKN28-EGFL7 és MKN28-NC. Az expressziós szintek EGFL7 a G418-rezisztens klónokat értékeltük Western blot és kvantitatív valós idejű PCR (QRT-PCR).}}

Western-blot analízis

Miután a sejtek elérték a 80% -95% összefolyás, összfehérje extraháltunk sejtlizátumot extrakciós pufferben (Beyotime, Kína), amely proteáz-inhibitor (1 mM fenil-metil-szulfonil-fluorid). A lizátumot összfehérje-koncentráció alkalmazásával határoztuk meg bicinchoninsav- protein assay kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Egyenlő mennyiségű fehérjét (25 ug) az egyes kezelési csoportban elválasztjuk per gél Lane által 8% -os nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gél elektroforézissel (SDS-PAGE) és polivinilidén-difluorid (PVDF) membránokra (Millipore, Billerica, USA). A membránokat egymást követően inkubáljuk a blokkoló pufferrel álló Tris-pufferolt sóoldattal (TBS), amely 5% zsírmentesített száraz tejet 2 órán át szobahőmérsékleten, majd egy éjszakán át 4 ° C-on ugyanezen pufferrel rendelkezik az alábbi primer antitestek: anti- EGFL7 (1:500; ABCAM Cambridge Science, UK). anti-E-cadherin, anti-vimentin, anti-Csiga (mindezt 1:1000; Cell Signaling Technology, CST, USA), az anti-GAPDH (1:10000, Protech), anti-EGFR-t, anti-foszfo-EGFR, anti-Akt, anti-foszfo-Akt, anti-ERK, és az anti-foszfo-ERK (összes 1:800, Anbo Biotech Co., Ltd., USA). Immunolabeled membránokat ezután inkubáltuk egy HRP-konjugált másodlagos antitesttel (1:2000, immunológia Consultants Laboratory, Inc., USA) 2 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Mosás után TBST, fehérje sávok tettük láthatóvá használja a fokozott kemilumineszcenciás kimutatási rendszer (Advansta Corporation, Menlo Park, California, USA), a gyártó utasításai szerint. Expression of GAPDH használtunk terhelési kontrollként és a fehérjék alkalmazásával számszerűsíteni UTHSCSA Image Tool 3.0. Célfehérje expresszióját számítottuk a sáv intenzitása aránya a megcélzott fehérje GAPDH.

RNS-extraháló és PCR-analízis

A sejteket lizáltuk TRIzol reagenssel (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), és teljes RNS-t készítünk, a gyártó utasításai szerint. Először törzs cDNS-eket szintetizáljuk a PrimeScript RT reagens készlet gDNS Radír (Takara, Otsu, Japán) és PCR-rel amplifikáltuk a következő specifikus primerek: EGFL7 értelemben, 5'-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 '; antiszensz, 5'-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 '. A cDNS-t a GAPDH-t amplifikáltunk, hogy ellenőrizzék az összeg a cDNS jelen minden mintában (sense, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; antiszensz, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'). PCR-amplifikáció végeztük 94 ° C-on 5 percig, majd 30 ciklusban 94 ° C 30 s, 57 ° C-on 30 másodpercig és 72 ° C-on 40 másodpercig. A PCR termékeket elválasztottuk 1,0% -os agaróz gélen és a megcélzott gén expresszióját mennyiségileg, mint az arány a célgén sáv intenzitását, hogy a GAPDH alkalmazásával Image Tool 3.0 (A University of Texas Health Science Center, San Antonio, Texas, USA).

real-time PCR

A reakcióelegyet a valós idejű PCR-rel állt 10 ul Premix Ex Taq (szonda qPCR), 0,2 uM az egyes EGFL7 és GAPDH primert (lásd alább), 0,2 pmol /ml TaqMan (EGFL7 vagy GAPDH), és 0,4 ul ROX (tetrapropano-6-karboxi) Referencia Dye II (Takara Bio, Shiga, Japán). Az elegyet egyesítjük 2 ul cDNS egyes lyukakba a 96 lyukú mikroampert lemez (Applied Biosystems, CA, USA), és desztillált vizet használtunk, hogy alkalmazkodjon a végtérfogatra 20 ul. A következő primereket terveztünk a Primer Premier 6.0 szoftvercsomag (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA): EGFL7: előre, 5'-GACCCTGTCTCCGAGTCGTTC-3 '; fordított, 5'-GATGGTTCGGTAGGTGCTGC-3 '; GAPDH: előre, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; fordított, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 '. Minden reakciót végeztünk egy 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA). Thermocycle feltételek voltak kezdeti denaturáció 95,8 ° C-on 30 s, majd 40 amplifikációs ciklus át 95,8 ° C-on 6 s és 60,8 ° C-on 30 másodpercig.

Hasonló kísérleti körülményeket alkalmaztuk, hogy értékelje a kifejeződését más gének a következő primerekkel: E-cadherin: előre, 5'-GAGTGCCAACTGGACCATTCAGTA-3 '; fordított, 5'-AGTCACCCACCTCTAAGGCCATC-3 '; vimentin: előre, 5'-GACGCCATCAACACCGAGTT-3 '; fordított, 5'-CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT-3 '; Csiga: előre, 5'-TGCTCCACAAGCACCAAGA-3 '; fordított, 5'-GCAGAGGACACAGAACCAGAAA-3 '; GAPDH: előre, 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '; fordított, 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3 '. A reakcióelegyet a valós idejű PCR-rel állt 10 ul SYBR Premix Ex TaqTM II, 1,6 ul mindegyik primerből (0,4 | iM), 0,4 ul ROX Referencia Dye, 2 ul templát cDNS-t és 6 mikroliter dietil-pirokarbonát kezelt víz. Real-time PCR-t végeztünk egy 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA), a következő thermocycle feltételek: kezdeti denaturáció 95 ° C-on 10 s, majd 40 amplifikációs ciklus 95 ° C-on 5 s és 60 ° C-on 34 s.

Cell Proliferation Assay

a sejtproliferációt által becsült 3- [4,5-dimetil-tiazol-2-il] -2,5-difenil-tetrazólium-bromid (MTT) életképes sejtes vizsgálatban. A sejteket szélesztünk 96 mérőhelyes lemezeken 2000 /is, és tenyésztettük 12, 24, 48, 72, és 96 óra. Ezután 20 ul MTT-t (Sigma) törzsoldat (5 mg /ml) adtunk 200 ul tápközegben minden egyes lyukban, és a lemezeket inkubáltuk további 4 órán át 37 ° C-on. Gondos leszívása a tenyésztőközegben, 150 ul dimetil-szulfoxidot (DMSO) adunk az egyes lyukakhoz, hogy feloldódjon formazán kristályok képződnek MTT által életképes sejtek. A lemezeket rázatjuk egy rotációs platform 10 percig, és mért abszorbancia 490 nm-en egy mikrotiterlemez-leolvasó.

Plate telepképző assay

A sejteket beoltottuk 200 /mérőhely az ugyanazon hat- lyukú lemezeken, mint az egyéb vizsgálatok értékelésére telepek kialakulása alatt sejt tapadt körülmények között. 10 nap után a sejteket megfestettük 1% Giemsa, és a szám a látható telepeket megszámoltuk. A relatív klón formáció indexet átlag telepek számát /számát oltunk sejtek × 100%. Katalógusa

Scratch sebgyógyulásban esszék katalógusa

a teszt a sejtek migrációját, 5 × 10 ^{5 sejt /lyuk széiesztettünk hat lyukú bevont lemezeken, 10 ug /ml fibronektinnel (FN) és 24 órán át inkubáltuk. Az egyrétegű ezután megszakította egyetlen karcolás egy 200 ul pipetta hegyét. A mikrográfokat szerezhetők be 0, 12, 24, 36, 48 és 72 órával a nulláról egy fáziskontraszt-mikroszkóp (Olympus BX51, Japán). A sejtek számát a karcos (meddő) régióban a mikrotiter megszámoltuk öt területen (Nagyítás: × 200). Minden kísérletet két példányban. Katalógusa}

In vitro katalógusa invázió és migrációs assay katalógusa

Cell invázió és a migráció értékeltük ki transzwell kamrák (Corning, New York, USA). Inváziós vizsgálati eljárást végeztünk transwell kamrák elválasztott polikarbonát membránszűrőn betétek (8 um pórusok) a 24 lyukú lemezeken. Mindegyik kamrát bevonva 100 ul 1:20 Matrigel (Becton, Dickinson and Company, New York, USA) hideg RPMI 1640 éjszakán át 4 ° C-on. Ezt követően a sejteket (5 x 10 ^{4 /ml × 200 ul) oltunk a felső kamrába szérummentes közegben. Körülbelül 800 ul tápközegben kondicionált 10 ug /ml fibronektinnel helyeztünk az alsó rekeszbe a transwell kamrába, mint egy kemoattraktáns. Az inkubálás után 24 órán át 37 ° C-on, a maradék tumorsejtek felső felületén a kamra eltávolítjuk letörölni nedves pamuttörlővel. Sejtek megtámadása az alsó felületén fixáltuk 4% paraformaldehiddel, megfestettük kristályibolya, és alatt megszámoltuk fáziskontraszt-mikroszkóp (Olympus, Japán) a × 200. Négy független kísérletet végeztünk három párhuzamosban minden kezelés körülmények között. In vitro katalógusa migrációs vizsgálatokat végzünk ugyanolyan körülmények között, mint a behatolás vizsgálatokban, de nem bevont alsó kamra és a 1 × 10 5 sejt /ml (200 ml). Katalógusa}

Anoikis Analitika

Poly-hidroxi-etil-metakrilát (poli-HEMA, Sigma-Aldrich), amely gátolja a sejt adhéziót a kultúrához lemezek és más növekedési felületek, ben feloldott 95% -os etanolban, hogy a végső koncentráció 12 mg /ml. Hogy előkészítse a poli-HEMA-bevonatú lemezeken, 2 ml oldatot adunk minden egyes lyukba egy 6 mérőhelyes lemez és egy éjszakán száradni hagytuk lamináris áramlás alatt szövettenyésztő Hood. Ezután 5 × 10 ^{4 sejteket három párhuzamosban az egyes poli-HEMA-bevonatú jól rendszeres táptalajhoz. 24 óra elteltével a GC sejteket összegyűjtöttük, öblítjük PBS-sel, és újra szuszpendáljuk 500 ul kötőpufferben egy Annexin V-PE /7-AAD Apoptosis Detection Kit (eBioscience, San Diego, USA). A szuszpendált sejteket az egyes mintából aliquot részeket (100 ul) négy csövekbe. Három csöveket jelölt vagy Annexin V-PE, a 7-AAD, vagy mindkettő, míg a negyedik-ben használható, mint egy jelöletlen kontroll. Mindegyik adagot ekkor áramlási citometriával analizáltuk egy Beckman Coulter FC 500 számláló (Beckman Coulter, Inc.). A százalékos apoptotikus sejtek származnak, mint az összege sejtfrakciókat megjelenítésére korai apoptózis (annexin V-pozitív) és késői apoptózis (7-AAD-pozitív).}

xenograft csupasz egér Model

Xenografting GC sejtvonalak szerint végeztük a Nemzeti irányelvek Care and Use of Laboratory Animals (közzététel nélkül. 86-23, átdolgozott 1985) hagyta jóvá az Animal Care and Use Committee a harmadik Xiangya Kórház, Közép-Dél Egyetem ( LLSC [LA] 2013-0010), és megfelelt a jelenlegi kínai törvény az állatok védelméről (LLSC [LA] 2013-0010). Minden erőfeszítést tettek arra, hogy a lehető legkevesebb egerek, valamint azok szenvedését. Katalógusa

Harmincöt nőstény Balb /c csupasz egerek életkora 4-6 héttel vásároltunk SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. (Shanghai, Kína) és helytakarékosan egyedileg szellőztetett ketrecekben. Az egereket véletlenszerűen osztottuk BGC823, BGC-NC, BGC2-13, MKN28, MKN28-NC, MKN28-EGFL7, és ellenőrzés PBS csoportok (n = 5 egér /csoport). Tenyésztett sejteket összegyűjtöttük és reszuszpendáltuk PBS-ben 1 × 10 ^{8 sejt /0,2 ml. A szuszpenziót szubkután injekció formájában beadjuk a bal felső végtag egyes meztelen egér, kivéve azokat a kontroll csoportban, ami injektáltunk 0,2 ml PBS-sel. A tumor növekedést értékeltük minden 3. napon mérjük tumor átmérőjét Vernier mérőkörzővel. A tumor térfogatát (TV) kiszámítjuk a következő képlet szerint: TV (mm 3) = d 2 × D /2, ahol d és D közül a legrövidebb és a leghosszabb átmérőjét, ill. Az egereket leöltük után 4 héttel sejt implantáció, és a tumorokat extraháljuk, majd lemérjük. Minden májak vizsgáltuk metasztázis által hematoxilin-eozin (H &E) festéssel. A tumorokat fixáltuk 10% -os formaiinban fixáltuk, paraffinba ágyaztuk, és vágjuk 4 um vastag metszeteket. EGFL7 expressziót immunhisztokémiai vizsgálatok szerint a fent leírt módon. Katalógusa}

Statisztikai elemzések katalógusa

Minden statisztikai analízist az SPSS Version 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) a Windows. Az adatokat átlag ± standard deviáció (SD) legalább három független kísérlet során. Csoport eszközökkel hasonlítottuk össze egyutas varianciaanalízissel (ANOVA) Student-Newman-Keuls (SNK) vagy legkisebb szignifikáns különbség (LSD) teszt post hoc páros összehasonlítások. A Spearman rank korrelációs együttható meghatározására használt közötti korrelációk EGFL7 és EMT-rokon fehérje expressziós szintek sebészetileg kivágtuk gyomorrák szövetekben. A P katalógusa < 0,05 értéket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Katalógusa

Eredmények katalógusa

EGFL7 Expression emelkedett volt emberi gyomorban rákos sejtvonalak

Western blot és RT PCR végeztünk összeh EGFL7 expresszió a humán GC sejtvonalak SGC7901, BGC823, MKN45, és MKN28 hogy, hogy a szokásos gyomornyálkahártya epithelialis GES-1 sejtekben. Emelkedett EGFL7 szintet találtak mind a négy GC sejtvonal képest GES-1, azzal BGC823 és MKN28 megjelenítésére a legmagasabb és a legalacsonyabb EGFL7 kifejezés, illetve mind a fehérje és mRNS-szintek (1A és 1B). Ezért BGC823 és MKN28 használtuk a további kísérletekben, hogy értékelje a hatását EGFL7 expresszió proliferáció, migráció, és metasztatikus potenciálját. Mi alkalmazott stabil shRNS transzfekció elnyomni EGFL7 kifejezést BGC823 sejtek és terveztek egy emberi EGFL7 magas expressziós plazmidot (PEX-2-EGFL7), hogy növelje EGFL7 expresszió MKN28 sejtekben. Katalógusa

megépített két shRNS plazmid vektorok célzás EGFL7 mRNS és végzett qRT-PCR, hogy értékelje a hatékonyságát ezek jelölt shRNS szekvenciák, hogy elnyomja EGFL7 képest nem specifikus szekvenciákat. A shRNA1 és shRNA2 szekvenciák elért 75%, illetve 30% -os gátlását EGFL7, illetve (1C), így a hatékonyabb shRNA1 alkalmaztuk az összes további kísérletekben. A BGC823 vonalak stabilan transzfektált pGPU6 /GFP /Neo-EGFL7-shRNA1 vagy pGPU6 /GFP /Neo-specifikus-shRNS jelölték BGC2-13 és BGC-NC, ill. A MKN28 vonalak stabilan transzfektált pEX-2-EGFL7 és pEX-2-nemspecifikus jelölték MKN28-EGFL7 és MKN28-NC, ill. Az expressziós szintek EGFL7 fehérje és mRNS G418-rezisztens klónokat is értékeltük Western-blot (1D ábra) és a valós idejű RT-PCR-t (1 E. ábra). Az eredmények azt mutatták, jelentősen csökkent EGFL7 expresszió BGC2-13 sejtekben, mint a BGC-NC sejtek és szignifikánsan emelkedett expressziót MKN28-EGFL7 sejtek összehasonlítva MKN28-NC sejtek (mind p
< 0,05). Nem volt szignifikáns különbség a mRNS és fehérje expressziója között BGC-NC és BGC sejtek között vagy MKN28-NC és MKN28 sejtek (az összes P katalógusa > 0,05). Katalógusa

EGFL7 promotált GC Cell invázió és a migráció, de nem befolyásolta a GC sejt proliferáció katalógusa

a betöltött szerepének vizsgálatára EGFL7 GC progresszió, először azt vizsgálta, hogy EGFL7 hangtompító vagy túltermelése megváltoztatta a proliferatív, invazív, és a migrációs kapacitását GC sejteket. Scratch sebgyógyulás mértük migrációját stabilan transzfektált sejteket. A seb keletkezett GC egysejtrétegek egyetlen karcolás és a sejtek számát, a karcolás zónában képest 0 ° és 48 óra. A seb lezárása szignifikánsan lassúbb BGC2-13 kultúrákban (underexpressing EGFL7), összehasonlítva a natív BGC823 és BGC-NC tenyészetek (32% vs.
100% és 98%, mind a P katalógusa < 0,05) (2A ábra). Ezzel szemben, a lezárás azonban szignifikánsan nagyobb volt MKN28-EGFL7 kultúrák (túltermelõ EGFL7) képest MKN28 és MKN28-NC kultúrák (99% vs. Katalógusa 49% és 50%, mind a P <katalógusa 0,05) (2b ábra). Sőt, seb közelebb a kis időt utáni semmiből (48 h) nagyobb volt a magas EGFL7 expresszáló vad típusú BGC823 sejtekben, mint a kis-expresszáló vad típusú sejtek MKN28, jelezve, hogy az endogén expressziós szintje is hatással migráció. Katalógusa

Transwell vizsgálatot végeztünk, hogy erősítse meg ezeket az eredményeket, és további hatásának vizsgálatára EGFL7 az invazív potenciál BGC823 sejtek MKN28 sejtek, és a megfelelő stabil expressziós sorokat Matrigel. Szignifikánsan kevesebb EGFL7-underexpressing (BGC2-13) sejtek a Matrigel képest BGC-NC és BGC823 sejtek (25 ± 3,1 vs. Katalógusa 76 ± 2,9 és 79 ± 5,7 sejt /lyuk, mind P katalógusa < 0,05), jelezve, hogy EGFL7 underexpression jelentősen csökkenthetőek invazív képességét (2C ábra). Hasonlóképpen, a szám a BGC2-13 sejtek eléri az alsó Matrigel-mentes jól Transwell migrációs assay szignifikánsan csökkent összehasonlítva BGC823 és BGC-NC-sejteket (19 ± 1,1 vs.
53 ± 2,9 és 54 ± 2,6 mindkét P katalógusa < 0,05) (2C ábra). Ezzel szemben, a EGFL7 overexpresszió MKN28 sejtekben jelentősen továbbfejlesztett mindkét invázió a Matrigel (MKN28-EGFL7: 79 ± 6,19 sejt /lyuk, MKN28-NC: 40 ± 2.00 sejt /lyuk, MKN28: 41 ± 4,22; mindkét P
< 0,05; 2D ábra) és a migráció (MKN28-EGFL7: 67 ± 4,16, MKN28-NC: 33 ± 5,92, MKN28: 35 ± 3,7; mind P katalógusa < 0,05; 2D ábra).

• PLoS One: A 346 tok Analízis laparoszkópos Lép-Konzerváló No.10 nyirokcsomók proximalis gyomorrák: Egységes Center tanulmány
• PLoS One: túltermelése nukleáris apoptózist indukáló faktor 1 Megváltozott a proteomikai Profil humán gyomornyálkahártya Cancer Cell MKN45 és indukált sejtciklusmegállás G1 /S fázis