PLoS ONE: RhoE Edistää Etäpesäke mahasyövän kautta mekanismin Riippuu Enhanced Expression of CXCR4

tiivistelmä

RhoE, uusi jäsen Rho proteiini perhe, on keskeinen säätelijä solun tukirangan ja solujen vaeltamiseen. Ryhmämme on aiemmin osoittanut, että RhoE suorana kohteena HIF-1α ja välittää hypoksian aiheuttamaa epiteelin ja mesenkymaalitransitioon mahalaukun syöpäsoluja. Siksi oletimme, että RhoE voisi olla tärkeä rooli mahasyövässä etäpesäkkeitä. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet roolin RhoE ilmaisun mahasyövän, solu- ja metastaasit, ja vaikuttaa RhoE sääntelystä potentiaali ilmentymistä alavirtaan geenejä. RhoE ilmentyminen koholla mahasyövän kudoksissa verrattuna normaaliin mahalaukun kudoksiin. Olemme myös havainneet läheisen korrelaatio histologinen arvosana ja diagnoosi. Up-regulation RhoE paransi merkittävästi muuttavien ja invasiivisia kyvyt mahalaukun syöpäsolujen sekä in vitro
ja in vivo
. Lisäksi säätely alaspäin RhoE vähentynyt metastaattista potentiaalia syöpäsolujen. PCR array ja myöhemmät siirtokuoppaan määritys osoitti, että sääntely mahasyövän etäpesäkkeiden by RhoE osittain välittämä CXCR4. Tämä havainto viittasi siihen, että CXCR4 ehkä alavirtavaikuttajainhibiittorit varten RhoE. Yhteenvetona, Tutkimuksemme tunnistettiin RhoE uutena prognostista biomerkkiaineen ja metastaattinen edistävät geenin mahasyövässä.

Citation: Feng B, Li K, Zhong H, Ren G, Wang H, Shang Y, et ai. (2013) RhoE Edistää Etäpesäke mahasyövän kautta mekanismin Riippuu Enhanced Expression of CXCR4. PLoS ONE 8 (11): e81709. doi: 10,1371 /journal.pone.0081709

Editor: Sharmila Shankar, University of Kansas Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 11 tammikuu 2013; Hyväksytty: 24 lokakuu 2013; Julkaistu: 29 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Feng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Basic Research Program of China (nro: 2009CB521700), National korkean teknologian tutkimus- ja kehittämisohjelma Kiina (nro: 2006AA02A253) ja National Science and Technology tukeminen Program aikana yhdennentoista viisivuotissuunnitelman Period (No: 2006BAI02A14). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahalaukun syöpä on toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat maailmassa ja kasvaimen etäpesäke on suurin este onnistuneen hoidon ja suurin syy potilaan kuolleisuutta [1,2]. Vuosikymmeniä, lukuisat tutkimukset ovat yrittäneet ymmärtää prosesseja ja mekanismeja etäpesäkkeiden mahasyövän. Viime vuosina on havaittu, että epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT) on ratkaisevan tärkeää tässä prosessissa ja edistää suuresti syöpäsoluinvaasiota ja etäpesäke. Yksi mahdollinen syy on, että aikana EMT, solun tukirangan on pohjimmiltaan moduloidaan, mikä sirontaa syöpäsolujen [3].

RhoE kuuluu alaryhmä Rho proteiineja, joka on merkittävä osa solun tukirangan muodostumiseen , solun liikkuvuus, solusyklin ja apoptoosin [4,5]. Toisin kuin tyypillinen Rho proteiineja, jotka kiertävät läpi aktiivisen GTP-sidottu valtion ja lepo BKT sitoutuneena, RhoE puuttuu luontainen GTPaasina aktiivisuutta ja kääntää aina aktiivisena GTP-sitoutunut muoto [6]. Tämä ainutlaatuinen ominaisuus osoittaa, että toiminto on RhoE olennaisesti säädellään sen ilmaisukeinoja eikä sen toimintaa.

Viime aikoina useat tutkimukset osoittivat, että epänormaali ilmentyminen RhoE liittyi karsinogeneesin ja että RhoE saattaa toimia joko kasvainsuppressorigeenin tai onkogeenin, alkuperästä riippuen syöpä [7-9]. Vastaavasti RhoE on vaihtelevia vaikutteita etäpesäkkeitä eri syöpiä. Melanooma, RhoE tukee muuttoliike ja invasiivisuus kasvainsolujen säätelemällä aktiinisytoskeletonin [10]. Kuitenkin maksasolukarsinoomassa, RhoE edustaa itseään soriproteiini tuumorimetastaasin [11,12].

Aikaisemmin ryhmämme on havaittu, että RhoE tehostettiin mahasyövän soluissa indusoimalla HIF-1α ilmentymistä hypoksinen olosuhteet ja edistettävä EMT mahalaukun syöpäsolujen [13]. Niinpä arveltu, että RhoE voi olla positiivinen panos etäpesäkkeiden mahasyövän. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme vaikuttaa sekä RhoE on etäpesäkkeitä mahasyövän solujen ja taustalla olevien mekanismien.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Ihmisen mahalaukun adenokarsinooman solulinjat SGC7901, MKN-45, MKN-28, KATO-III ja normaali mahan limakalvon solu- line GES säilytettiin meidän instituutti [14-16]. Lisäksi mahasyövän solu- linja SGC7901-M, joka on korkea metastaattinen potentiaali, ja SGC7901-NM, joka on huono metastaattinen kyky, otettiin talteen ja säilytettävä meidän instituutti [17]. Kaikki solut ylläpidettiin RPMI 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (GIBCO, Carlsbad, CA, USA), ja viljeltiin 37 ° C: ssa täysin kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO2: ta.

Tissue Array

Immuunivärjäystä sovelluksissa, kaksi kudosmatriisien ihmisen mahasyöpä oli kaupallisesti hankittiin päihittää Biotech Co. Ltd (Shanghai, Kiina). Yksi kudoksen array sisälsi 90 kasvainkudoksen täplät ja sovitettu viereisen ei-kasvainkudoksen pisteitä, jotka saatiin 90 potilasta (joilla 5,3-+6,1vuosi seuranta). Valmistaja toimitti sukupuoli, ikä, ja kliinis parametreja potilaista. Toinen joukko sisälsi 120 täplien 40 ensisijaisen kasvainkudoksen paikkoja, 40 sovitettu viereisen ei-kasvainkudoksessa paikkoja, ja 40 Hyväksytty imusolmukemetastaaseja paikkoja.

immunohistokemia

Immunohistokemia suoritettiin käyttämällä Histostain ™ Plus sarjat (Zhongshan Goldenbridge Biotech, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden. Hiiren anti-RhoE-vasta-ainetta (laimennettu 1: 100; Upstate, MA, USA), tai anti-CXCR4-vasta-ainetta (laimennettu 1: 200, Sigma-Aldrich, MO, USA) käytettiin IHC määrityksessä ensimmäisen vasta-aineen. IgG sijasta käytettiin ensimmäisen vasta-aineen negatiivinen kontrolli näissä tutkimuksissa. Saatu tulos oli semi-kvantitatiivisesti arvioida määrittämällä pisteet intensiteetti immunoreaktiivisuus ja solujen osuus, jotka värjäytyivät positiivisesti, kuten on kuvattu muiden. Intensiteetti immunoreaktiivisuus jaettiin neljään ryhmään ja pisteytetään poissa (-; pistemäärä: 0), heikko (+; pisteet: 1), kohtalainen (++, pistemäärä: 2), tai vahva (+++, pisteet: 3 ) mukainen värjäytymisen intensiteetti, joka havaittiin useimmissa mahalaukun epiteelisolujen. Osuus positiivisia soluja luokiteltiin neljään ryhmään: (1), 0-25% syöpäsolujen, joilla immunoreaktiivisuus; (2), 25-50%: ssa soluista; (3), 50-75 prosenttiyksikköä solujen; ja (4), 75-100% soluista. Yleinen tilanne oli tuotteen kahden [18].

Western blot -analyysi

Proteiininäytteet uutettiin soluista tai kudoksista sonikoimalla lyysipuskuria (150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl (pH 8,8), 0,1% SDS, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% NP40: tä, 5 ug /ml aprotiniinia, 1 ug /ml leupeptiiniä) jäillä, sentrifugoitiin 12000 rpm 10 minuutin ajan. Proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja sähköllä nitroselluloosakalvoille (Bio-Rad, CA, USA). Ei-spesifinen sitoutuminen blokattiin 5% rasvattomalla maitoa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kalvo sitten erikseen inkuboitiin anti-RhoE-vasta-ainetta (laimennettu 1: 400, Upstate, MA, USA), anti-CXCR4-vasta-ainetta (laimennettu 1: 1000, Sigma-Aldrich, MO, USA), anti-VEGFA-vasta-ainetta (laimennettu 1 : 500; Abcam, MA, USA), anti-CD82-vasta-ainetta (laimennettu 1: 1000, Abcam, MA, USA), anti-CTSK-vasta-ainetta (laimennettu 1: 1000, Santa Cruz, Texas, USA), tai β-aktiini-vasta-aine ( laimennettu 1: 10000, Sigma-Aldrich, MO, USA) yön yli 4 ° C: ssa. Neljän pesun jälkeen TBS-T-puskurilla, membraaneja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (laimennettu 1: 2000, Santa Cruz, Texas, USA) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kun 4 pesua TBS-T-puskuria, bändit kehitettiin SuperSignal kemiluminesenssisubstraatilla (Thermo Scientific, MA, USA) proteiinien visualisoimiseksi. Sitten blotit analysoitiin Määrä One® ohjelmisto (versio 4.2. Bio-Rad, CA, USA) noudattaen käyttöopas. Western blot β-aktiinin ilmentymistä käytettiin sisäisenä kontrollina.

Ectopic Expression ja siRNA-välitteisen hiljentäminen

ektooppinen ilmentyminen kohdegeenien, mahalaukun syövän solut transdusoitiin lentiviruksen ilmentävää RhoE tai CXCR4 (tarjoamia GeneChem, Shanghai, Kiina). Lyhyesti, solut maljattiin ja kasvatettiin 75-80% konfluenssiin ilman antibiootteja, minkä jälkeen lentivirusvektoreita lisättiin solujen kasvualustaan, joka sisälsi polybreenin (2 ug /ml) MOI-arvolla 50. Seuraavaksi soluja viljeltiin vielä 72 h ja infektion tehokkuus tarkastettiin fluoresenssimikroskopialla ja Western blot-analyysi. Häiriöt ihmisen RhoE tai CXCR4 ilmentyminen saavutettiin käyttämällä RNA-interferenssi tekniikkaa. siRNA-dupleksit syntetisoitiin Takara Biotechnology (Liaoning, Kiina) ja kohdennettu sekvenssit RhoE tai CXCR4 määriteltiin näin:

RhoE, 5'-GAACGUGAAAUGCAAGAUAUU-3 ';

CXCR4, 5'-UAAAAUCUUCCUGCCCACC-3 '.

Ohjaus siRNA-dupleksit suunniteltiin jälkeen tiedustellaan BLAST tietokannan epäspesifinen kohdennussekvenssiä. Solut transfektoitiin oligonukleotididuplekseilla käyttäen LipofectamineTM 2000 (Invitrogen, NY, USA) valmistajan ohjeiden, minkä jälkeen ne alistettiin edelleen analysoidaan 48 tuntia transfektion jälkeen.

haavanparantumis- Pitoisuus

havaitsemiseksi solun liikkuvuus, eksponentiaalivaiheen solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille. Sen jälkeen kun solut saavuttivat konfluenssin yhtenä kerroksena solujen levyn substraatti, muovi pipetin kärki oli vedetty poikki levyn keskelle tuottaa puhdasta 1 mm leveä haava-alueelle ja väliaine korvattiin tuoreella RPMI 1640, joka sisälsi 1% naudan sikiön seerumia . 48 tunnin kuluttua, solujen liikkeen haava-alueen arvioitiin käyttäen faasikontrastimikroskoopissa kuten aikaisemmin on kuvattu [19,20].

Invasion Pitoisuus

Cell invasion analyysit suoritettiin käyttäen transwell levy (Corning, NY, USA) päällystettiin Matrigel (Becton Dickinson, NJ, USA). Lyhyesti, Matrigel laimennettiin pitoisuuteen 2 mg /ml, ja 50 ui tätä liuosta pantiin polykarbonaattisuodatin ja ilmakuivattiin. Huuhtelun jälkeen PBS: llä, suodattimet asetettiin kuoppiin ja 700 ul: ssa RPMI-1640-viljelyalustaan, jota oli täydennetty 10% FBS: ää lisättiin alempaan kammioon. Solut suspendoitiin uudelleen RPMI-1640, joka sisälsi 1% FBS: ää ja 1 x 105 solua 0,2 ml: ssa määritellyssä elatusaineessa maljattiin ylempään kammioon. Solut hyökkäyksen kammioissa inkuboitiin kosteutetussa inkubaattorissa 12-48 tuntia. Vielä inkuboinnin, solut, jotka tunkeutui kalvon huokosten ja dispergoidaan alapintaan suodattimien värjättiin 5% kristalliviolettiliuoksella visualisointiin. Seuraavaksi hyökkäsi solut kussakin kuopassa laskettiin valomikroskoopilla (Olympus, Tokio, Japani) ja kvantitoidaan visualisointiin viidestä satunnaisesti kentät suurennos x 200 ja keskimäärin kuten on kuvannut Albini [21]. Invaasio määritys toistettiin 3 kertaa. Arvo pylväsdiagrammin edustaa keskimääräistä lukumäärää hyökkäsi solujen 3 eri kokeesta.

häntälaskimoon Metastaattinen Pitoisuus

häntälaskimoon metastaattinen määritys määritettiin aiemmin raportoitu [22]. Kolmekymmentä nude-hiiriä käsiteltiin käyttäen parasta inhimillinen käytäntöjä ja hoidettiin mukaisesti NIH Animal Care ja Käytä komitean ohjeita. Solut kerättiin käyttämällä trypsiiniä ja pestiin kolme kertaa PBS: llä. Sitten hiiret injektoitiin 1 x 106 solua 0,1 ml: ssa PBS kautta häntälaskimoinjektio. Sitten hiiriä tarkkailtiin yleistä terveyttä ja kehon kokonaispainosta. 28. päivänä injektion jälkeen hiiret tapettiin. Keuhkojen ja maksan kudoksissa havaittiin paljain silmin ja lukumäärä näkyviä kasvaimia keuhkojen ja maksan pinta kvantitoitiin. Keuhkojen ja maksan kudokset leikattiin leikesarjojen, värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla, sitten havaittiin valomikroskoopilla. Koe- ja kontrolliryhmissä kukin sisälsi 6-hiirissä. Kaikki koetoimenpiteet oli hyväksynyt Experimental Animal Welfare ja eettinen komitea, neljäs Military Medical University. Eläinkokeet suoritettiin hyväksymisestä institutionaalisten komitean Animal Research, mukaisesti kansalliset ohjeet hoitoon ja koe-eläinten käytön.

tuumorietäpesäke PCR Array

ilmaus metastasis- liittyvien geenien määritettiin Human Tumor Metastasis PCR Array (PAH-028A; SuperArray Biosciences, Maryland, USA) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ensimmäinen, kokonais-RNA uutettiin RhoE-lentviral tartunnan SGC7901 soluista ja vertailusoluista käyttämällä standardimenetelmiä, joka muutettiin sitten ensimmäisen juosteen cDNA: ta. CDNA-templaatti yhdistettiin 2 x SuperArray PCR master mix, kuoppiin lisättiin PCR-Array levyn (384-kuoppa), joka sisälsi geenin aluketta asetetaan, ja sille suoritettiin reaaliaikaisella PCR: llä. PCR pyöräily-olosuhteet olivat seuraavat: 40 sykliä 95 ° C: ssa 15 s, 60 ° C 1 min, ja 72 ° C: ssa 30 s. Viisi taloudenhoito geenejä käytettiin sisäisen valvonnan. Kertamuutoksen ilmaus etäpesäkkeiden liittyvien geenien määritettiin ΔΔCt menetelmällä.

Tilastollinen analyysi

Tietojen analysointi suoritettiin SPSS 17.0 tilastollisen analyysin ohjelmisto (Chicago, IL, YHDYSVALLAT). Mann-Whitneyn U-testiä käytettiin arvioimaan merkitystä eroja taajuuden ilmaisun RhoE välillä mahasyövän kudosten ja etäpesäkkeitä imusolmukkeissa. Kruskal-Wallisin H testi monen ryhmille, ja U-testi kahden ryhmän vertailussa käytettiin analysoimaan suhdetta molempien RhoE ekspressiotasot ja erilaisten kliinis-patologisten tekijöiden mahasyövän yksilöitä. Kumulatiivinen elinaika laskettiin käyttämällä Kaplan-Meier selviytymisen menetelmällä ja analysoidaan log-rank-testi. Yhden ja usean analyysit perustuivat Coxin suhteellisen vaarat regressiomallin. Vertailut määrällisten analysoitiin Studentin T-testi kahden ryhmän välillä. Korrelaatioanalyysin välillä ilmaus RhoE ja CXCR4 arvioitiin Spearmanin listalla korrelaatio menetelmä. Erot katsottiin tilastollisesti merkittäviksi, kun P < 0,05.

Tulokset

Yli-ilmentyminen RhoE korreloi erilaistumista luokan ja tuumorin luokitus mahasyövän kudoksissa ja osoittaa huono ennuste potilaille

ilmentyminen RhoE maha- terveisiin kudoksiin, viereisen ei-kasvain kudosten ja niihin liittyvien metastaattinen imusolmukkeiden kudoksissa tutkittiin immunohistokemiallisesti (kuvio 1A). RhoE ekspressio havaittiin heikosti ilmaistu tai jopa puuttuu viereisen ei-tuumorikudoksissa (a), kun taas sen ilmentyminen oli huomattavasti korkeampi mahasyövän kudosten ja etäpesäkkeitä imusolmukkeissa (b-e). Seuraavaksi analysoidaan suhdetta RhoE värjäys ja kliinis parametrit mahasyöpäpotilaista (taulukko 1). Tulokset osoittivat, että kumpikaan sukupuoli eikä ikä korreloi ilmaus RhoE. Kuitenkin lisääntynyt RhoE ilmentyminen tilastollisesti korreloi luokka eriyttäminen (P = 0,005) ja tuumorin luokitus, joka koostui kasvaimen kokoa (T, P < 0,001), imusolmukkeesta invaasio (N, P = 0,001), ja kaukainen etäpesäke (M, P = 0,003). Lisäksi Kaplan-Meier selviytymisen analyysi osoitti, että potilailla, joilla on korkeat ekspressiotasot RhoE esitteli lyhyemmällä eloonjäämiseen verrattuna potilailla, joiden negatiivinen ilmaus RhoE (kuvio 1 B). Monimuuttuja Coxin suhteellisen vaarat malli arvioinnit osoittivat, että tasot RhoE ilmaisun olisi itsenäinen ja merkittävä tekijä hengissä mahalaukun syöpäpotilailla (taulukko S1).
Expression taso RhoE
Luokka
n
- +
++
+++
P value
Total9014283216Age0.421≤6041610187>6049818149Gender0.742Male679232213Female2355103Differentiation0.005^{aWell52120Moderately471215146Poorly380121610TNM stageT <0.001aT194320T2175840T347414209T4171367N0.001bN031111073N1-N3593182513M0.003bM08014272811M1100145Table 1. Tilastollinen analyysi immunohistokemiallinen määritys.
a, Kruskal-Wallisin H testi; b, U-testi CSV Lataa CSV}

Myöhemmin tutkimme ekspressiotasot RhoE perusterveydenhuollossa mahasyövässä kudokset ja niiden yhteensovitettujen metastasoituneen imusolmuke kudoksiin. Ilmentymistasojen RhoE puuttuivat 7 mahasyövän kudoksissa, heikosti ilmaistuna 16 mahasyöpäpotilaista, kohtalaisen ilmaistuna 11, ja erittäin ilmaistuna 6 syövän kudoksissa, vastaavasti. Sitä vastoin imusolmukemetastaaseja vastaava luku oli 3, 12, 14 ja 11. Lisäksi ilmaus RhoE oli merkitsevästi korkeampi metastaattisessa imusolmuke kudosten kuin todettu ensisijainen syöpä kudoksiin. Nämä havainnot osoittivat, että RhoE ilmentyminen korreloi etäpesäkkeitä mahasyövän (taulukko 2, P < 0,05).
Expression taso RhoE
histologinen tyyppi
n
-
+
++
+++
P-arvo
Ensisijainen syöpä tissues407161160.048 <sup>* Imusolmuke metastases403121411Table 2. ilmentäminen RhoE Alkeisyhdistyksessä Cancer kudoksia ja osuvan imusolmukemetastaaseja .
* U-testi CSV Lataa CSV</sup>

Expression of RhoE in solulinjojen analysoitiin Western blot (kuvio 1 C). Olemme havainneet, että verrattuna, että GES solulinjassa, ilmaus RhoE oli merkittävästi korkeampi eri mahasyövän solulinjoja. Lisäksi taso RhoE proteiinin ilmentyminen oli merkitsevästi korkeampi erittäin invasiivisia SGC7901-M-solun osa-linjan kuin vähemmän invasiivisia solualapopulaatioita-line SGC7901-NM. Siksi lisätutkimukset tuumorimetastaasin tehtiin perustuu solujen mallinnuksen kanssa SGC7901-M ja SGC7901-NM solulinjoja.

RhoE edistää muuttavien ja invasiivisia kyvyt mahalaukun syöpäsolujen in vitro ja in vivo

tutkia roolia RhoE mahasyövän etäpesäkkeitä, me sääteli sen proteiinin ilmentymistä SGC7901-NM soluissa transduktion kanssa RhoE lentivirus vektorin tai kontrollivektorille (nimeltään SGC7901-NM-RhoE tai SGC7901-NM-ohjaus ). Sen sijaan vaimentaa of RhoE ilmentymisen SGC7901-M-solut saatiin aikaan seuraava transfektion siRNA kohdistettu RhoE mRNA tai ohjaus siRNA (nimeltään SGC7901-M-siRhoE tai SGC7901-M-ohjaus vastaavasti). Proteiinin ekspressiotasoja vahvistettiin Western blot-analyysi transfektion jälkeen (kuvio 2A).

Seuraavaksi in vitro
maahanmuutto- ja invaasiomääritys tehtiin (kuvio 2B ja 2C). Löysimme tehostettu ilmentyminen RhoE voisi merkittävästi ajan säännellä muuttavien ja invasiivisia kyvyt mahasyövän solulinjaan SGC7901-NM, haavan paranemista ja siirtokuoppaan invaasio määrityksissä. Sen sijaan SGC7901-M-soluissa, joilla on kostutettu ilmaus RhoE oli merkittävä esto muuttavien ja invasiivisen kykyjä verrattuna kontrolli soluihin. Ymmärtää onko toimintojen RhoE olivat yleisiä tapahtumia eri mahalaukun syöpäsoluissa tai SGC7091-tapahtumia, mahasyövän solulinjojen MKN45 ja MKN28 käytettiin loppuun samoja kokeita. Tulokset sekä haavan paranemista ja siirtokuoppaan hyökkäys määritykset paljastivat, että RhoE edisti muuttavien ja invasiivisia kyvyt sekä MKN45 ja MKN28 soluja (kuvio S1), joka ehdotti, että toiminnot RhoE jotka havaittiin in vitro
täydellisinä kaikille mahasyövän solulinjoja. Samalla olemme myös suorittaa MTT-määritystä testaamiseksi sää muuttamiseen RhoE ilmaisun voisi vaikuttaa solujen kasvuun mahasyövän tutkimuksessamme. Kuten kuva S3A esitetään, kumpikaan ylös- säätely RhoE in SGC7901-NM-solujen eikä alas-säätely RhoE in SGC7901-M-solut voisivat aiheuttaa Huomattava muutos solujen lisääntymisen (p > 0,05), mikä jättää vaikutus RhoE soluproliferaatioon joka toisi sekaannusta meidän tuloksia ja vahvistivat lisäksi, että RhoE voivat edistää solun liikkuvuus mahalaukun syöpäsoluja.

jotta voitaisiin edelleen tutkia, lisääntynyt RhoE voisi muuttaa in vivo
metastaattisen kyvyn mahalaukun syöpäsoluja teimme in vivo
häntälaskimoon metastaattisen määrityksissä nude-hiirissä käyttäen SGC7901-NM-RhoE ja SGC7901-NM-ohjaus solulinjoja. Vuonna tapettiin hiirissä, havaittiin, että solut näytetään korkeampi RhoE ilmentymisen johti huomattavasti näkyvämmäksi maksa- ja keuhkojen pinta kasvainten verrattuna kontrollisolujen (P < 0,05, kuvio 3). H ja E värjäys osoitti, että SGC7901-NM-RhoE soluja tuotetaan ilmeisesti etäpesäkkeitä sekä maksan ja keuhkot, kun taas kontrolli solut näytetään vain osittain etäpesäkkeitä. Yhdessä nämä tiedot osoittivat, että RhoE ollut tärkeä rooli etäpesäke mahalaukun syöpäsolujen sekä in vitro
ja in vivo
.

CXCR4 voisi olla alas- stream geeni RhoE mahasyövän

Voit selvittää mahdollisimman alavirran geenien jonka kautta RhoE voivat välittää sen funktio etäpesäke mahalaukun syöpäsoluja, teimme PCR Array tutkia differentiaalisesti ilmentymistä etäpesäkkeiden liittyvien geenien jaetaan SGC7901-NM-RhoE ja SGC7901-NM-ohjaus solulinjoja. Geenit, jotka lisääntynyt tai vähentynyt ≥ 2-kertaiseksi pidettiin mahdollisina RhoE riippuva loppupään geenejä. Yhteenvetona, olemme havainneet 84-geenien ja lopulta löytyi 6, jotka merkittävästi muuttuneet sen jälkeen, kun ilmentymistä RhoE on parannettu (taulukko 3). Niistä 6 geenit, 3 (CXCR4, VEGFA, CTSK) oli säädelty, ja kolme muuta (MMP7, CD82, CTSL1) on säädellä vähentävästi SGC7901-NM-RhoE soluissa.
Ilmentymistaso mRNA
Gene nimi
Kuvaus
SGC7901-NM-ohjaus
SGC7901-NM-RhoE
CXCR4Chemokine (CXC-motiivin) -reseptorin 41.003.30VEGFAVascular endoteelikasvutekijä A1.002.78CTSKCathepsin K1.002.68CTSL1Cathepsin L11.00-2.12CD82CD82 molecule1.00-2.29MMP7Matrix metallopeptidaasi 71.00-2.47Table 3. ilmentyvät eri etäpesäke liittyvistä Genes jälkeen Augmented RhoE Expression.
CSV Lataa CSV

tässä tutkimuksessa, ilmaus CXCR4, VEGFA, CTSK ja CD82 varmistettiin Western blot -analyysillä ja kiinnostavaa, olemme havainneet, että ainoastaan ​​CXCR4: n ilmentyminen oli yhdenmukainen tulosten kanssa saatiin PCR erilaisia ​​analyysi. Proteiini taso CXCR4 tukahdutettiin häiriöitä RhoE ja sen sijaan lisääntyi, kun RhoE on ektooppisesti ilmaistuna (kuvio 4A). Siten, korrelaatio RhoE ja CXCR4 ilmentyminen analysoitiin immunohistokemiallisesti 60 mahasyövän kudokset Tulokset osoittivat, että CXCR4 ilmentyy suuresti kudoksissa, joissa RhoE positiivisesti värjättyä, kun se oli huonosti ilmaistu kyseisten kudosten, joissa RhoE ilmaistiin alhaisella tasolla (kuvio 4B). Lisäksi sekä RhoE ja CXCR4 ilmaisun olivat yhtäpitäviä vuonna 83,3% (50/60) ja mahakarsinoomat yksilöitä, Spearman R korrelaatiokerroin oli 0,80 (P < 0,001) ja osoitti läheinen korrelaatio sekä RhoE ja CXCR4 ilmaisun mahasyövistä (Taulukko 4). Kuten on raportoitu, yli-ilmentynyt CXCR4 on myös tärkeä rooli syöpäsolujen leviämiseen ja on mukana EMT prosessi, joka ehdotti, että CXCR4: ää voisi olla alavirran geenin RhoE kanssa merkitys etäpesäkkeiden mahalaukun syövän soluihin [23].
CXCR4
Spearmanin correlation
RhoE
+
++
+++
Negative
n
p
p
R
+1820060<0.001<0.0010.80++11730+++0270Negative2008Table 4. Korrelaatio välillä ilmaiseminen RhoE ja CXCR4 60 paria mahasyövän kudosten.
CSV Lataa CSV

CXCR4 on olennaista asiakkuutta hyökkäystä RhoE mahasyövän soluissa

vaikutuksen tutkimiseksi CXCR4 kykyyn RhoE toiminnan myös etäpesäke mahasyövän, me tehostettu ilmentyminen CRCR4 in SGC7901-M-siRhoE soluissa lentiviraalinen tranduction ja alassäädetty ilmaisunsa SGC7901-NM-RhoE soluissa siRNA häiriöitä. Proteiini taso määritettiin Western blot -analyysillä (kuva S2). Seuraavissa transwell määritystä havaitsimme, että tehostettu ilmentyminen CXCR4 voisi palauttaa invasiivisen kyvyn SGC7901-M-siRhoE soluja, kun taas sitä vastoin hiljentäminen endogeenisen CXCR4 tukahdutettu hyökkäyksen SGC7901-NM-RhoE soluja (kuvio 5). Nämä havainnot osoittivat, että RhoE aiheuttama mahalaukun syöpäsoluinvaasiota, joka oli osittain välittämä CXCR4. Nämä havainnot myös osoitti lisäksi, että CXCR4 oli alas-stream tavoite RhoE.

Keskustelu

poikkeavasti-ilmaisi RhoE liittyy usein syövän etenemiseen. Kuitenkin rooli o RhoE voi Vaihtaminen tuumorisuppressoriproteiinia ja onkogeeni alkuperästä riippuen kasvaimen [7-9]. Kuten raportoitu, mahasyöpä edelleen yksi yleisimmistä syövistä maailmanlaajuisesti, erityisesti Itä-Aasiassa. Aikaisemmin on osoitettu, että epänormaali RhoE ilmaisu on hyvin korreloi etenemistä syöpään. Kuten Zhou ja Li on kuvattu, ekspressio RhoE on lisääntynyt mahalaukun syövän induktio HIF-1α, ja jonka ilmentyminen voisi mennä täydennetty vielä enemmän, kun syöpäsolut tuottavat resistenssin kasvaimen vastaisen huumeita. Lisäksi parannettu ilmaus RhoE edistää Lääkeresistenssin tukahduttamalla Bax ilmaisun [13,24].

Tässä tutkimuksessa olemme huomanneet, että RhoE ilmentyminen kohonnut mahalaukun syövän kudoksissa kun se oli poissa tai heikosti ilmaistu viereisen ei-syöpäkudoksissa. Lisäksi kliinistä näyttöä osoitti, että RhoE yli-ilmentyminen korreloi merkitsevästi astetta syövän solujen erilaistumisen ja TNM pysähdyspaikan, joka koostuu tuumorin koko (T), imusolmukkeesta invaasiota (N) ja etäpesäkkeiden (M). Vielä tärkeämpää on, RhoE ekspressiotasot olivat itsenäinen ja merkittävä riskitekijä selviytymisen mahasyövän. Lisäksi sääteli ilmentymä RhoE voisi ennustaa huono tulos mahasyöpäpotilaista. Yhdessä meidän data erittäin suositeltavaa, että RhoE saattanut toiminut onkogeenin mahasyövän ja ollut myönteinen rooli mahalaukun syövän etenemisessä, erityisesti syövän etäpesäkkeiden. On muodollisesti mahdollista, että RhoE voisi olla uusi ennustetekijä potilailla mahalaukun syöpä. Siten otetaan huomioon, että etäpesäke on yksi tärkeimmistä syistä mahasyövän kuolleisuus, meidän havainnoista saattaisi tarjota uuden vihjeen tai uusi tavoite estää kasvaimen etäpesäkkeiden mahasyövän ja saattavat lopulta auttaa kehittämään terapeuttisten strategioiden pidentää potilaiden selviytymiseen.

kuitenkin, roolia RhoE syövän etäpesäkkeiden edelleen osittain määrittelemätön. Maksasolukarsinoomassa ja mesenkymaalisten kasvainsoluja, lisääntynyt RhoE ilmentyminen korreloi alentunut metastaattinen kyky, kun taas melanooman soluissa, RhoE edistää solujen muuttoliike ja invaasiota [10,12,25]. Tutkia roolia RhoE metastasoinnissa mahasyövän, me pudotti RhoE vuonna SGC7901-M solulinjassa, jolla on korkea metastaattinen potentiaali ja me indusoi sen ilmentymistä SGC7901-NM solulinjassa, joka on huono etäpesäke . Sen jälkeen, in vitro
analyysit osoittivat, että lisääntynyt RhoE edistää solujen liikkuvuuteen ja invasiivisuus, kun taas laski RhoE johti ei-invasiivisia luonteeltaan mahalaukun syövän soluja. Nämä tulokset vahvistavat lisäksi in vivo
määrityksessä. On tunnettua, että tehostettu syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota ovat tärkeitä vaiheita lopullista muodostumista etäpesäkkeitä. Näin ollen, mahalaukun syövän soluissa, RhoE voi olla toiminnallinen etäpesäke edistävä geeni. Olemme kuitenkin myös huomannut, että solun morfologia muuttunut paljon sen jälkeen, kun muutos on RhoE ilmaisua. Lisätutkimukset totesi, että tämä morfologinen muutos saattaa johtua katoaminen stressisäikeiden (kuvio S3B) kuin muutos solujen lisääntymisen.

Kuten on raportoitu, RhoE säätelee syövän etäpesäke, ja tekee niin lähinnä estämällä ROCK /MYPT reitin [26]. Tässä osassa tutkittiin toisessa tutkimukseen ryhmämme (tuloksia ei ole esitetty). Tässä tutkimuksessa käytimme PCR Array analyysin tunnistamiseksi muiden alavirran geenien RhoE mahasyövän etäpesäkkeitä, jonka tavoitteena on määrittää taustalla olevien mekanismien tuumorimetastaasin. Niinpä saimme 6 ilmentyvät eri etäpesäke liittyviä geenejä seuraavia säätely ylöspäin RhoE (CXCR4, VEGFA, CTSK, MMP7, CD82 ja CTSL1). MMP7 (matriksimetalloproteinaasi-7) kuuluu MMP proteiinien perhe, jotka ovat mukana jakautuminen soluväliaineen sekä fyysisen ja patologinen tila [27].

Kerrottiin, että kohonnut ilmentyminen MMP7 parannettu invasiivisen kykyä syöpäsoluja [28]. PCR erilaisia ​​analyysi, MMP7 havaittiin olevan alassäädetty erittäin invasiivisia SGC7901-NM-RhoE soluja, mikä oli ristiriidassa aiempien raporttien. Niinpä katsotaan MMP7 vähemmän merkitystä tutkimuksessamme eikä tarkastaa sen ilmentymisen Western blot. Vastaavista syystä emme tarkista ilmaus CTSL1. Yllätykseksemme joukossa 4 geenien havaittiin Western blot -analyysillä, vain ekspression CXCR4 havaittiin yhdenmukainen tulos saatiin PCR Array-analyysi. Lisätutkimukset osoittivat, että säätely ylöspäin CXCR4 mahalaukun syöpäsoluissa voisi osittain palauttaa invasiivisia kyky, joka tukahdutti RhoE knock-out. Sen sijaan alas-säätely CXCR4 vähentynyt hyökkäystä mahasyövän soluja, jotka indusoitiin yliekspressoidaan RhoE. Siten CXCR4 voi olla mahdollinen alas-stream efektori RhoE mahasyövän etäpesäkkeitä.

CXCR4 yhdessä sen ligandin CXCL12 (eli CXCL12 /CXCR4 akseli), on hyvin tiedetään liittyvän moniin näkökohtiin syövän etenemiseen, erityisesti tuumorimetastaasissa. Aikaisemmin raportoitiin, että CXCL12 /CXCR4-akselilla on välttämätöntä metastaattisen syövän soluja hajottamaan elimiä ja siten mahdollistaa kasvainsolujen pääsyn solun kapeampiin, jotka suosivat kasvaimeen solujen eloonjäämistä ja kasvua [29]. Sen lisäksi, että aktivoitu CXCR4 edellyttää sitoutumista G-proteiineihin siirtämään solunulkoisia signaaleja soluun ja aloittaa erilaiset vastaukset [23]. Lisäksi, kun otetaan huomioon, että RhoE on jäsen G-proteiinin perheen, me katsotaan, että RhoE voi suurentaa ohjelmistoon CXCL12 /CXCR4 akselin signaaleja lisäämällä ilmentymistä CXCR4-reseptoria. Sen sijaan RhoE voisi sitoutua CXCR4 ja välittää alavirtaan signaalitransduktion, mikä saattaa lopulta johtaa syövän etäpesäkkeiden. Lisäksi olemme aiemmin osoittaneet, että RhoE osallistuu hypoxia- aiheuttama EMT, joka on keskeinen prosessi, joka edistää syövän etäpesäkkeiden, jossa CXCR4 on myös mukana. Nämä paljon yhteyksiä RhoE ja CXCR4 erittäin suositeltavaa, että RhoE parantaa etäpesäke jopa säätelevä CXCR4 mahasyövän. Yksityiskohtaiset mekanismit vastuussa näistä reiteistä on vielä tutkittava.

Johtopäätös

Tutkimus osoitti, että RhoE yliekspressoitui mahasyövän ja korreloi syövän etenemiseen.

• PLoS ONE: muuntaminen Microarray allekirjoitus osaksi Diagnostiikkasivun A Trial of Custom 74 Gene Array selvennystä ja ennustaminen ennuste Mahalaukun Cancer
• PLoS ONE: Resveratrol estää niiden kasvun mahasyövän indusoimalla G1 vaiheen pysähtymisen ja Vanheneminen on SIRT1 riippuva Manner