Финансирование:. Эта работа не была поддержана Национальной программы фундаментальных исследований Китая (No: 2009CB521700), исследований и разработок Национальная программа высоких технологий Китая (No: 2006AA02A253) и Национальный научно-технологический поддержку программе в ходе одиннадцатой пятилетке план период (№: 2006BAI02A14). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
<р> рак желудка является второй ведущей причиной рака, связанных смерти в мире и метастазирование опухоли является самым большим препятствием для успешного лечения и основной причиной смертности пациентов [1,2]. В течение многих десятилетий, многочисленные исследования попытались понять процессы и механизмы метастазирования при раке желудка. В последние годы было обнаружено, что эпителиальные мезенхимальных перехода (EMT) имеет решающее значение в этом процессе, и в значительной степени способствует инвазии и метастазирование раковых клеток. Одной из возможных причин является то, что во время EMT, цитоскелет фундаментально модулируется, что приводит к рассеянию опухолевых клеток [3]
. <Р> Rhoe принадлежит к подгруппе белков Rho, которые играют ключевую роль в формировании цитоскелета , подвижность клеток, клеточный цикл и апоптоз [4,5]. В отличие от типичных белков Rho, которые цикл между активным GTP-связанном состоянии и состоянии покоя ВВП переплете, Rhoe не прослеживается внутренней активность ГТФ и всегда представляет в качестве активного GTP-связанной форме [6]. Эта уникальная особенность указывает на то, что функция Rhoe, по существу, регулируется с помощью его экспрессии, а не по его активности.
Недавно несколько исследований показали, что аномальная экспрессия Rhoe была связана с канцерогенеза и Rhoe может действовать либо как ген-супрессор опухолей или онкоген, в зависимости от происхождения рака [7-9]. Точно так же, Rhoe имеет различные влияния на метастазирование в различных раковых образований. В меланоме, Rhoe поддерживает миграцию и инвазивности опухолевых клеток путем регуляции актинового цитоскелета [10]. Тем не менее, в гепатоцеллюлярной карциномой, Rhoe представляет себя в качестве белка-супрессора опухоли метастазов [11,12].
<Р> Ранее наша группа обнаружила, что Роу была увеличена в желудочном раковых клеток путем индукции HIF-1α экспрессии под гипоксические условия и способствует EMT желудка раковых клеток [13]. Таким образом, мы предположили, что Rhoe может иметь положительный вклад в метастазирование рака желудка. В настоящем исследовании, мы исследовали аффект Rhoe на метастазирование клеток рака желудка и основных механизмов.
Культура клеток
<р> человеческой аденокарциномы желудка клеточных линий SGC7901, MKN-45, MKN-28, КАТО-III и нормальные слизистой желудка GES клеточной линии были сохранены в нашем институте [14-16]. Кроме того, рак желудка линия SGC7901 Cell-М-, которая имеет высокий метастатический потенциал, и SGC7901-НМ, которая имеет плохую метастатический способность, были созданы и поддерживаются в нашем институте [17]. Все клетки поддерживали в среде RPMI 1640, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco, Карлсбад, Калифорния, США) и культивировали при 37 ° С в полностью увлажненной атмосфере, содержащей 5% СО2.
Tissue Массив
<р> Для иммуноокрашивания приложений, две ткани массивы рака желудка человека были коммерчески приобретены у переплюнуть Biotech Co. Ltd (Шанхай, Китай). Один массив тканей содержал 90 пятен опухолевой ткани и соответствуют соседние пятна неопухолевой ткани, которые были получены из 90 пациентов (с 5.3-6.1 лет наблюдения). Производитель обеспечил пол, возраст и параметры клинико-пациентов. Другой массив содержал 120 пятен с 40 первичных пятен тканей опухолей, 40 подобранных соседних пятен неопухолевой ткани, и 40 подобранных метастазами в лимфатических узлах пятен.
Рана-Healing Анализ
<р> Для определения подвижности клеток, экспоненциальной фазе клетки высевают в 6-луночные планшеты. После того, как клетки не достигли слияния в монослой клеток на подложке пластины, пластиковый наконечник пипетки было обращено через центр пластины для получения чистого 1 мм шириной области раны и среду заменяли свежей RPMI 1640, содержащей 1% фетальной бычьей сыворотки , Через 48 ч, движение клеток в области раны оценивали с помощью фазово-контрастного микроскопа, как описано ранее [19,20].
Опухоли Метастазы PCR массив
выражение metastasis- генов, ассоциированных определяли человеческим метастазирование опухоли PCR Array (ПАУ-028A; SuperArray Biosciences, штат Мэриленд, США) в соответствии с инструкциями производителя. Во-первых, Суммарную РНК экстрагировали из Rhoe-lentviral инфицированных SGC7901 клеток и контрольных клеток с использованием стандартных протоколов, которые затем превращают в первой цепи кДНК. Шаблон кДНК объединяли с 2 × SuperArray Master Mix ПЦР, добавляли в лунки блока плиты ПЦР (384-луночные), содержащий наборы праймеров геноспецифических и подвергали ПЦР в реальном времени. Условия велосипедных ПЦР были следующие: 40 циклов при 95 ° С в течение 15 с, 60 ° С в течение 1 мин и 72 ° С в течение 30 сек. Пять генов домашнего хозяйства использовались в качестве внутреннего контроля. Складными изменения в экспрессии генов, связанных с метастазированием определяли методом ΔΔCt.
Результаты
Избыточная экспрессия Rhoe коррелирует со степенью дифференцировки и стадирования опухоли в желудочном раковых тканях и указывает на плохой прогноз для пациентов Для того, чтобы исследовать роль Rhoe в желудочном метастазирования рака, мы повышающей регуляции его экспрессии белка в SGC7901-NM клеток после трансдукции с лентивирусов вектором Rhoe или контрольным вектором (названный SGC7901-NM-Роу или SGC7901-NM-контроль ). В противоположность этому, смачивая экспрессии в клетках Rhoe SGC7901-М была достигнута после трансфекции миРНК направлены против мРНК Rhoe или с контролем миРНК (названный SGC7901-M-siRhoE или SGC7901-M-контроля соответственно). Уровни экспрессии белка были подтверждены с помощью Вестерн-блоттинга после трансфекции (рис 2А). CXCR4 имеет важное значение в стимулировании вторжения в Rhoe клеток рака желудка Обсуждение Вывод
<р> Выражение Rhoe в желудочном раковые ткани, окружающие ткани неопухолевой и родственные ткани узлов метастатического лимфатических исследовали с помощью иммуногистохимии (рис 1А). Выражение Rhoe было обнаружено слабо выражены или даже отсутствуют в соседних тканях неопухолевыми (а), в то время как его экспрессия была значительно выше в желудочных тканях рака и метастазов в лимфатических узлах (б-е). Далее, мы проанализировали связь между Rhoe окрашивания и клинико-патологическими параметрами рака желудка у пациентов (таблица 1). Результаты показали, что ни один, ни возраст Пол коррелирует с экспрессией Rhoe. Тем не менее, повышенная экспрессия Rhoe была статистически коррелирует со степенью дифференцировки (р = 0,005) и стадирования опухоли, состоявшей размера опухоли (T, P < 0,001), инвазии лимфатических узлов (N, P = 0,001) и отдаленными метастазами (М, Р = 0,003). Кроме того, анализ выживаемости Каплана-Мейера показал, что у больных с высоким уровнем экспрессии Rhoe, представленных с более короткой общей выживаемости по сравнению у пациентов с отрицательным выражением Rhoe (Фиг.1В). оценки модели пропорциональных рисков Кокса Мультивариантный показали, что уровни экспрессии Rhoe были независимым и существенным фактором для выживания в желудочных больных раком (таблица S1).
уровень экспрессии Rhoe
Категория
п
-
+
++ +++
P value
Total9014283216Age0.421≤6041610187>6049818149Gender0.742Male679232213Female2355103Differentiation0.005aWell52120Moderately471215146Poorly380121610TNM stageT <0.001aT194320T2175840T347414209T4171367N0.001bN031111073N1-N3593182513M0.003bM08014272811M1100145Table 1. Статистический анализ иммуногистохимического Пробирной
а, Крускала-Уоллиса H Test. Ь, Манна-Уитни U Test CSV Загрузить CSV <р> Затем мы исследовали уровни экспрессии Rhoe в первичных желудочных раковых тканей и их подобранных тканей узлов метастатического лимфатических. Уровни экспрессии Rhoe отсутствовали в 7 желудочных раковых тканей, слабо выраженный в 16 больных раком желудка, умеренно выраженный в 11, и в высшей степени выражены в 6 раковых тканей, соответственно. В отличие от этого, в метастазами в лимфатических узлах соответствующее число составляло 3, 12, 14 и 11. Кроме того, экспрессия Rhoe была значительно выше в метастатических тканях лимфатических узлов чем найденное в первичных раковых тканей. Эти наблюдения показали, что экспрессия Rhoe коррелировало с метастазами при раке желудка (таблица 2, Р &л; 0,05).
Уровень экспрессии Rhoe
гистологического типа
н
-
+
++ +++
Значение Р
Первичный рак tissues407161160.048 * лимфоузлов metastases403121411Table 2. Экспрессия в Rhoe первичного рака тканей и наборные метастазами в лимфатических узлах .
* Манна-Уитни U Test CSV Загрузить CSV <р> Выражение Rhoe в клеточных линиях, анализировали с помощью Вестерн-блоттинга (рис 1C). Мы обнаружили, что по сравнению с, что в клеточной линии GES, экспрессия Rhoe была значительно выше в различных рака желудка клеточных линий. Более того, уровень экспрессии белка Rhoe был в очень инвазивной SGC7901-М клеток к югу от линии значительно выше, чем в менее инвазивной клеток к югу от линии SGC7901-NM. Таким образом, дальнейшие исследования метастаза опухоли были сделаны на основе клеточного моделирования с линий клеток SGC7901-М и SGC7901-NM.
Rhoe способствует миграционные и инвазивные способности клеток рака желудка в пробирке и в естественных условиях <бр>
<р> Далее в пробирке
миграции и инвазии анализа были выполнены (рис 2В и 2С). Мы нашли усиленную экспрессию Rhoe может значительно повышающего регулировать миграционные и инвазивные способности желудочного раковых клеток линии SGC7901-НМ, в заживлении ран и Transwell вторжения анализы. В противоположность этому, SGC7901-M клетки, проявляющие увлажненную экспрессию Rhoe показал замечательное ингибирование миграционными и инвазивными способностей по сравнению с контрольными клетками. Для того, чтобы понять, были ли функции Rhoe распространенные события в различных клеток рака желудка или SGC7091 конкретных событий, рак желудка клеточных линий MKN45 и MKN28 были использованы для выполнения тех же экспериментов. Результаты как ранозаживляющее и Transwell вторжения анализов показали, что Rhoe способствовали миграционные и инвазивные способности обоих MKN45 и MKN28 клеток (рис S1), который предположил, что функции Rhoe, которые были обнаружены в пробирке
были комплексными для всех желудочных раковых клеток линий. В то же время, мы также провели МТТ для проверки Wether изменение экспрессии Rhoe может повлиять на рост клеток рака желудка в нашем исследовании. Как показано Рисунок S3A, ни вверх регулирование Rhoe в SGC7901-NM клетках, ни понижающей регуляции Rhoe в клетках SGC7901-М может привести к заметному изменению клеточной пролиферации (р > 0,05), таким образом, исключается влияние Rhoe на пролиферацию клеток что привело бы к путанице нашим результатам и далее подтвердили, что Rhoe может способствовать подвижность клеток желудка раковых клеток.
<р> для дальнейшего изучения, может ли увеличена Rhoe изменяют в естественных условиях
метастатической способности клеток рака желудка мы провели в естественных условиях
хвостовую вену метастатических анализы в голых мышах с использованием SGC7901-NM-Роу и SGC7901-NM-контроля клеточных линий. В забивали мышей, было обнаружено, что клетки, отображающие более высокие уровни экспрессии Rhoe привело к значительно более видимые liver- и легких поверхностных опухолей по сравнению с контрольными клетками (P &ЛТ; 0,05, рисунок 3). H и E окрашивание показало, что SGC7901-NM-Rhoe клетки, по-видимому получают метастазы в обоих легких и печени, в то время как контрольные клетки показаны лишь частичные метастаз. Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что Роу сыграли важную роль в содействии метастазирование клеток рака желудка и в пробирке
и В естественных условиях
.
CXCR4 может быть понижающего поток гена Rhoe в желудочном
рака <р> для того, чтобы определить возможные гены вниз по течению, через который Rhoe может опосредовать свою функцию в метастазирование клеток рака желудка, мы провели ПЦР массива, чтобы исследовать дифференцированно экспрессию генов, связанных с Безметастатическая распределяются между SGC7901-NM-Роу и SGC7901-NM-контрольных линий клеток. Гены, которые увеличены или уменьшены ≥ 2 раза рассматривались в качестве потенциальных нижестоящих генов Rhoe-зависимых. В целом, мы обнаружили 84 генов, и в конечном счете нашли 6, которые заметно изменились после того, как экспрессия Rhoe усиливалась (таблица 3). Среди 6 генов, 3 (CXCR4, VEGFA, CTSK) были повышающей регуляции, а три других (MMP7, CD82, CTSL1) были понижающей регуляции в клетках SGC7901-NM-Роу.
уровень экспрессии мРНК имени
Gene
Описание
SGC7901-NM-контроль
SGC7901-NM-Rhoe
CXCR4Chemokine (СХС мотив) рецептора 41.003.30VEGFAVascular эндотелиальный фактор роста A1.002.78CTSKCathepsin K1.002.68CTSL1Cathepsin L11.00-2.12CD82CD82 molecule1.00-2.29MMP7Matrix metallopeptidase 71.00-2.47Table 3. выраженные метастазы Дифференциально-родственные гены после дополненной Rhoe Expression.
CSV Загрузить CSV <р> В этом исследовании, экспрессия CXCR4, VEGFA, CTSK и CD82 были проверены с помощью Вестерн-блот-анализа и, что интересно, мы обнаружили, что только экспрессия CXCR4 согласуется с результатами, полученными с помощью анализа ПЦР массива. Уровень белка CXCR4 было подавлено вмешательством Rhoe и напротив, был увеличен, когда Rhoe эктопически выражена (фиг.4А). Таким образом, соотношение между Rhoe и экспрессии CXCR4 анализировали с помощью иммуногистохимии в 60 рака желудка тканей Результаты показали, что CXCR4, высоко экспрессируются в тканях, где Rhoe был положительно загрязнена, в то время как она была слабо выражена в тех тканях, где была выражена Rhoe на низком уровне (4В). Кроме того, оба Rhoe и экспрессия CXCR4 были созвучны в 83,3% (50/60) желудочных образцов карцином, коэффициент корреляции R Спирмена составил 0,80 (Р &л; 0,001) и указал на тесную корреляцию между обоими выражения Rhoe и CXCR4 в рака желудка (таблица 4). Как уже сообщалось, сверхвыражен CXCR4, также играет важную роль в метастазировании раковых заболеваний и участвует в процессе ЕМТ, который предположил, что CXCR4, может быть ниже по потоку ген Rhoe с важностью в метастазировании клеток рака желудка [23].
CXCR4
Спирмена correlation
RhoE
+
++
+++
Negative
n
p
p
R
+1820060<0.001<0.0010.80++11730+++0270Negative2008Table 4. Корреляция между экспрессией Rhoe и CXCR4 в 60 пар рака желудка ТКАНЕЙ.
CSV Загрузить CSV
<р> Для того, чтобы исследовать влияние CXCR4 на способности Rhoe функционировать в метастазирование рака желудка, мы усиливал экспрессию в клетках CRCR4 SGC7901-М-siRhoE по лентивирусов tranduction и понижающей регуляции его экспрессии в клетках SGC7901-НМ-Rhoe путем миРНК вмешательства. Уровень белка определяли с помощью Вестерн-блот-анализа (рис S2). В следующем тесте Transwell, мы обнаружили, что усиленную экспрессию CXCR4 может восстановить инвазивную способность клеток SGC7901-М-siRhoE, в то время как в отличие от глушителей эндогенного CXCR4 репрессирован вторжение клеток SGC7901-НМ-Rhoe (рисунок 5). Эти наблюдения показали, что Rhoe индуцированных желудка инвазии раковых клеток, который был частично опосредованного CXCR4. Эти наблюдения также показали, что дополнительно CXCR4 был мишенью вниз поток Rhoe.
<р> аберрантно экспрессируется Rhoe часто ассоциируется с опухолевой прогрессии. Тем не менее, роль о Rhoe может переключаться между супрессоров опухолей и онкогенов в зависимости от происхождения опухоли [7-9]. Как сообщалось, рак желудка остается одним из наиболее распространенных видов рака во всем мире, особенно в Восточной Азии. Ранее было показано, что ненормальное выражение Rhoe хорошо коррелируют с прогрессией рака желудка. Как описано Чжоу и Ли, экспрессия Rhoe увеличивается при раке желудка путем индукции HIF-1, а также, экспрессия которых может пойти дополненной еще больше, когда раковые клетки вырабатывают устойчивость к противоопухолевых препаратов. Кроме того, усиливается экспрессия Rhoe способствует устойчивости к лекарственным средствам путем подавления экспрессии Bax [13,24].
<р> В настоящем исследовании мы обнаружили, что экспрессия Rhoe был повышен в раковых тканях желудка в то время как он отсутствовал или слабо выраженный в смежных неопухолевых тканях. Кроме того, клинические данные показали, что Rhoe избыточная экспрессия была достоверно коррелирует с степенью дифференцировки раковых клеток и TNM постановки, которая состоит из размера опухоли (T), инвазии лимфатических узлов (N) и метастазирования (M). Что еще более важно, уровни экспрессии Rhoe были независимым и существенным фактором риска для выживания при раке желудка. Кроме того, до регулируемой экспрессии Rhoe мог предсказать неблагоприятный исход в больных раком желудка. Взятые вместе, наши данные убедительно показывают, что Роу, возможно, служил как онкоген рака желудка и сыграло положительную роль в прогрессии рака желудка, особенно в метастазирование рака. Формально возможно, что Rhoe может быть новым прогностическим фактором у больных раком желудка. Таким образом, учитывая, что метастазирование является одной из основных причин для желудка смертности от рака, наши результаты могут дать новый ключ или новую цель ингибировать метастазирование опухоли при раке желудка и может, наконец, помочь в разработке терапевтических стратегий для продления жизни пациентов.
<р> тем не менее, роль Rhoe в метастазирования рака остается частично неопределенными. В гепатоцеллюлярной карциномы и опухолевых клеток мезенхимы, повышенная экспрессия Rhoe коррелирует со снижением метастатической способности, в то время как в клетках меланомы, Rhoe способствует миграции клеток и вторжения [10,12,25]. Для того, чтобы исследовать роль Rhoe в метастазирования рака желудка, мы сбиты Rhoe в SGC7901-М клеточной линии, которая имеет высокий метастатический потенциал, и мы индуцированное свое выражение в SGC7901-NM клеточной линии, которая бедна на метастазирование , В дальнейшем, В пробирке
Анализы показали, что увеличение Rhoe способствовало клеточную подвижность и инвазивность, в то время как уменьшились Rhoe привели к неинвазивным характером клеток рака желудка. Эти результаты были дополнительно подтверждены В естественных условиях
анализа. Хорошо известно, что усиление миграции клеток рака и вторжение необходимые шаги для окончательного формирования метастазов. Таким образом, в клетках рака желудка, Rhoe может быть функциональным метастазирование промотирующее гена. Тем не менее, мы также заметили, что морфология клеток сильно изменилась после того, как изменения экспрессии Rhoe. Дальнейшие исследования обнаружили, что это морфологическое изменение может быть вызвано исчезновением напряжений волокна (рис S3B), а не изменение клеточной пролиферации.
<р> Как сообщалось, Rhoe регулирует метастазирования рака, и делает это в основном за счет ингибирования ROCK /MYPT пути [26]. Этот раздел был исследован в другом исследовании нашей группой (данные не показаны). В данном исследовании мы использовали анализ массива ПЦР для идентификации других генов вниз по течению Rhoe в желудочном метастазирования рака, с целью определения механизмов, лежащих в основе метастазирования опухоли. Таким образом, мы получили 6 дифференцированно выраженных генов метастаза связанных следующие повышающей регуляции Rhoe (CXCR4, VEGFA, CTSK, MMP7, CD82 и CTSL1). MMP7 (матрица металлопротеиназы-7) принадлежит к семейству ММР белков, которые участвуют в разрушении межклеточного матрикса в физической и патологического состояния [27].
<р> Было сообщено, что повышенная экспрессия MMP7 усиливает инвазивную способность раковых клеток [28]. В анализе массива ПЦР, MMP7 было установлено, понижающей регуляции в сильно инвазивных клетках SGC7901-НМ-Роу, которая была противоречивой предыдущим сообщениям. Таким образом, мы рассмотрели MMP7 меньшее значение в нашем исследовании и не проверяли его экспрессию с помощью Вестерн-блоттинга. По той же причине мы не проверяли экспрессию CTSL1. К нашему удивлению, среди 4-х генов, обнаруженных с помощью Вестерн-блот-анализа, только выражение CXCR4 было найдено в соответствии с результатом, полученным с помощью анализа ПЦР-массива. Дальнейшие исследования показали, что до регуляции CXCR4 в раковых клетках желудка может частично восстановить инвазивной способность, которая была подавлена Rhoe нокаута. В противоположность этому, понижающего регулирование CXCR4 уменьшилось вторжение клеток рака желудка, которые индуцировали более выраженным Rhoe. Таким образом, CXCR4 может быть потенциальной вниз по течению эффектор Rhoe в желудочном метастазирования рака.
<Р> CXCR4, вместе с его лигандом CXCL12 (а именно CXCL12 /оси CXCR4), хорошо известно, участвует во многих аспектах прогрессирование опухоли, особенно в метастазировании опухолей. Ранее сообщалось, что /ось CXCR4 CXCL12 имеет важное значение для метастатические раковые клетки, чтобы рассеять в органы и тем самым позволить опухолевым клеткам доступ клеточные ниши, которые способствуют выживанию опухолевых клеток и роста [29]. Кроме того, активированный CXCR4, требует связывания с G-белками, чтобы передавать внеклеточные сигналы в клетку и инициировать расходящихся ответов [23]. Кроме того, при рассмотрении вопроса о том, что Роу является членом семейства G-белка, мы считали, что Rhoe может увеличить репертуар сигналов оси CXCL12 /CXCR4 путем повышения экспрессии рецептора CXCR4. В противоположность этому, Rhoe мог связываться с CXCR4 и опосредуют вниз по течению трансдукции сигнала, что может в конце концов привести к метастазирование рака. Кроме того, ранее мы показали, что Rhoe участвует в hypoxia- индуцированной EMT, ключевой процесс, который способствует ракового метастазирования, в котором CXCR4 также участвует. Эти тесные связи между Роу и CXCR4 настоятельно рекомендуется Rhoe усиленное метастазирование путем повышающей регуляции CXCR4 при раке желудка. Детальные механизмы, ответственные за эти пути нуждается в дальнейшем изучении.
<р> Наше исследование показало, что Роу был избыточно экспрессируется при раке желудка и коррелировали с прогрессированием рака.
Риск рака пищевода можно снизить с помощью эзомепразола и аспирина в низких дозах.
Функция печени может иметь важное значение для риска болезни Альцгеймера.
Смесь на основе козьего молока полезна для здоровья кишечника младенцев
Верхняя эндоскопия
Этот пепто, вероятно, не поможет вашей язве
Апоптоз - важный медиатор патогенеза коронавирусной инфекции животных.
Бактерии кишечника укрепляют мышцы у пожилых людей
Новое смелое исследование предполагает, что мышечная сила у пожилых людей может быть выше из-за:частично, механизмы с участием кишечных бактерий. Бактерии кишечника связаны с мышечной массой и физич
Генетически измененные кишечные бактерии снижают риск развития колоректального рака у мышей - результаты исследования
Исследователи обнаружили, что редактирование генов бактерий, присутствующих в кишечнике мышей, может помочь уменьшить воспаление и связанный с этим риск колоректального рака. Исследование ученых из Юг
Основные моменты и ключевые выводы Бостонской конференции по бактериям 2019 г. (BBM)
Boston Bacterial Meeting (BBM) - это ежегодная конференция, на которую собираются специалисты-бактериологи из Бостона и всего мира. Его 25 th итерация проходила с 6 июня th и 7 июня th , 2019, в