PLoS One: RhoE Elősegíti metasztázis gyomorrákban mechanizmuson keresztül függően fokozott expressziójának CXCR4

absztrakt katalógusa

RhoE, egy új tagja a Rho fehérje család egyik legfontosabb szabályozója a citoszkeleton és a sejtek migrációját. Csoportunk korábban kimutatták, hogy RhoE közvetlen célpontja a HIF-1α és közvetíti a hipoxia által kiváltott epithelialis a mesenchymalis átalakulás gyomorrák sejtek. Ezért azt feltételeztük, hogy RhoE lehet fontos szerepet játszanak a gyomorrák metasztázis. A jelen tanulmányban már feltárt szerepének RhoE expresszió gyomorrák, sejt invázió és metasztázis, és a befolyása a RhoE szabályozására lehetséges kifejezése down-stream géneket. RhoE expresszió emelkedett a gyomorrák szövetekben, mint a normál gyomor szövetekben. Azt is megállapította, hogy szoros összefüggés áll fenn a szövettani grade és a diagnózis a beteg. Up-szabályozása RhoE számottevően növeli a migrációs és invazív képességek gyomorrák sejtek mind in vitro katalógusa és in vivo katalógusa. Sőt, down-regulációja RhoE csökkentette a metasztatikus potenciálját rákos sejteket. PCR array és az azt követő transzwell vizsgálat azt mutatta, hogy a rendelet a gyomorrák metasztázis által RhoE részben közvetíti CXCR4. Ez a megfigyelés azt javasolta, hogy a CXCR4 lehet egy későbbi effektor RhoE. Összefoglalva, a vizsgálat azonosított RhoE mint új prognosztikai biomarker és áttétes elősegítő gén gyomorrák.

bevezető hivatkozás: Feng B, Li K, Zhong H, Ren G, Wang, H Shang Y, et al. (2013) RhoE Elősegíti metasztázis gyomorrákban mechanizmuson keresztül Függ Fokozott kifejezése CXCR4. PLoS ONE 8 (11): e81709. doi: 10,1371 /journal.pone.0081709 katalógusa

Szerkesztő: Sharmila Shankar, University of Kansas Medical Center, Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: január 11, 2013; Elfogadva: október 24, 2013; Megjelent: november 29, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Feng és mtsai. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatta a Nemzeti Alap Research Program of China (No: 2009CB521700), a National High Technology Kutatási és Fejlesztési Program of China (No: 2006AA02A253) és a Nemzeti Tudományos és Technológiai Támogató Program során a tizenegyedik ötéves terv időszakában (No: 2006BAI02A14). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák a második vezető oka a rák okozta halál a világon, és a tumor metasztázis a legnagyobb akadálya, hogy sikeres kezelés és a fő oka a beteg halálozási [1,2]. Évtizedeken számos tanulmány igyekezett megérteni a folyamatokat és mechanizmusokat metasztázis gyomorrák. Az elmúlt években, azt találtuk, hogy a hámsejtek mesenchymalis átmenet (EMT) döntő fontosságú ebben a folyamatban, és nagyban hozzájárul a rák terjedését és áttétét. Az egyik lehetséges ok az, hogy közben EMT, a citoszkeleton alapvetően modulált, ami a szórási tumorsejtek [3]. Katalógusa

RhoE tartozik alcsoport a Rho fehérjék, amelyek kulcsszerepet játszanak a citoszkeleton kialakulását , cell, motilitás, sejtciklus és apoptózis [4,5]. Ellentétben a tipikus Rho fehérjék, melyek ciklus között egy aktív GTP-hez kötött állapotban, és a nyugalmi GDP-kötött állapotban, RhoE hiányzik intrinsic GTPáz aktivitását, és mindig mutatja, mint az aktív GTP-kötött formában [6]. Ez az egyedülálló szolgáltatás azt jelenti, hogy a funkció a RhoE lényegében szabályozza annak kifejezése helyett annak aktivitását.

Nemrégiben számos tanulmány megállapította, hogy a kóros expressziója RhoE társult carcinogenesis, és hogy RhoE működhetne akár egy tumorszuppresszor gén vagy egy onkogént, eredetétől függően a rák [7-9]. Hasonlóképpen RhoE eltérőek befolyások áttét különböző rákos megbetegedések. A melanoma, RhoE támogatja a migráció és invazivitását tumorsejtek szabályozása által az aktin citoszkeleton [10]. Azonban a hepatocelluláris karcinóma, RhoE képviseli magát a szupresszor fehérje tumormetasztázisban [11,12]. Katalógusa

Korábban a csoport úgy találta, hogy RhoE fokozódott gyomorrák sejtek indukciója HIF-1α expresszió hipoxiás körülmények és támogatni EMT gyomorrák-sejtek [13]. Mindez arra utal, hogy RhoE lehet pozitív hozzájárulás az áttét gyomorrák. A jelen tanulmányban azt vizsgáltuk, hogy befolyásolja a RhoE az áttét gyomorrák sejtek és az azok hátterében. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Cell Culture katalógusa

Az emberi gyomor adenokarcinóma sejtvonalak SGC7901, MKN-45, MKN-28, KATO-III és a normál gyomornyálkahártya-sejt-line GES őrizték intézetünkben [14-16]. Továbbá, a gyomorrák sejt vonal SGC7901-M, mely egy nagy metasztatikus potenciállal, és SGC7901-NM, amely a szegény metasztatikus képességét, arra alapított és fenntartott intézetünkben [17]. Minden sejteket tartottunk fenn RPMI 1640 tápközegben, amelyet 10% magzati borjúszérummal (GIBCO, Carlsbad, CA, USA), és a tenyésztést 37 ° C-on, egy teljesen párásított atmoszférában, 5% CO2.

Tissue Array katalógusa

immunhisztokémiai alkalmazások, két szövet tömbök humán gyomorrák a kereskedelmi forgalomban vásárolt felülmúlni Biotech Co. Ltd (Shanghai, Kína). Egy szövet array szereplő 90 daganatos szövet foltok, és kiegyenlített szomszédos, nem daganatos szövet foltok kaptuk 90 beteg (a 5,3-6,1 éves követés). A gyártó feltéve, hogy a nem, az életkor, és klinikopatológiai paraméterek a betegek. A másik tömb tartalmazott 120 foltok 40 primer tumor szövet foltok, 40 párosított szomszédos, nem-tumoros szövet foltok, és a 40 párosított nyirokcsomó-metasztázisok foltok.

Immunhisztokémia

Immunhisztokémia alkalmazásával végeztük Histostain ™ Plus kitek (Zhongshan Goldenbridge Biotech, Kína), a gyártó utasításai szerint. Az egér anti-RhoE antitesttel (1: 100 hígításban; Upstate, MA, USA) vagy anti-CXCR4 antitestet (hígítva 1: 200; Sigma-Aldrich, MO, USA) használtunk a IHC vizsgálattal, mint az első antitest. Egér IgG-t alkalmazunk az első antitest, mint a negatív kontroll ezekben a vizsgálatokban. A kapott eredmény az volt félkvantitatíven értékeltük hozzárendelésével pontszámok intenzitását immunreaktivitás és az aránya a sejtek pozitívan festődő leírtak mások által. Az intenzitás az immunreakciót négy kategóriába sorolhatók, és pontozni hiányzik (-; pontszám: 0), gyenge (+; pontszám: 1), közepes (++; pontszám: 2), vagy erős (+++; pontszám: 3 ) szerint a festődés intenzitása, hogy megfigyelhető volt a legtöbb gyomor hámsejtek. A pozitív sejtek arányát volt négy csoportba sorolhatók: (1), 0-25% a tumorsejtek mutató immunreaktivitást; (2), 25-50% a sejtek; (3), 50-75 százalékponttal sejtek; és (4), 75-100% sejtek. A teljes pontszám volt a termék a két [18].

Western-blot analízis

Protein mintákat kivont sejteket vagy szöveteket ultrahanggal egy lízis pufferben (150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl (pH8.8), 0,1% SDS-t, 2 mM EDTA-t, 1 mM PMSF, 1% NP40, 5 ug /ml aprotinin, 1 ug /ml leupeptin) jégen, majd centrifugáltuk 12.000 rpm-en 10 percig. A fehérjéket SDS-PAGE és elektrotranszferrel nitrocellulóz membránra (Bio-Rad, CA, USA). A nem-specifikus kötődést blokkoltuk 5% zsírmentes tej 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A membránt ezután külön-külön inkubáltuk anti-RhoE antitestet (hígítva 1: 400; Upstate, MA, USA), az anti-CXCR4 antitesttel (1: 1000 hígítás; Sigma-Aldrich, MO, USA), az anti-VEGFA antitestet (hígítva 1 : 500; ABCAM, MA, USA), az anti-CD82 antitestet (1: 1000 hígítás; ABCAM, MA, USA), az anti-CTSK antitesttel (1: 1000 hígítás; santa Cruz, Texas, USA), vagy β-aktin antitest ( hígított 1: 10000; Sigma-Aldrich, MO, USA) egy éjszakán át 4 ° C hőmérsékleten. Miután négy mosás TBS-T-pufferrel, a membránokat inkubáltuk a torma peroxidázzal konjugált szekunder antitesttel (1: 2000 hígításban; Santa Cruz, Texas, Amerikai Egyesült Államok) 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Miután 4 mosást TBS-T-pufferrel, a sávokat kifejlesztett SuperSignal kemilumineszcens szubsztrátot (Thermo Scientific, MA, USA) a fehérjék láthatóvá tételére. Blotokat azután elemeztük Mennyiség One® szoftver (4.2-es verzió. Bio-Rad, CA, USA) követően a használati útmutató. Western-blot a β-aktin expresszióját használtuk belső kontrollként.

ektópiás expressziója és siRNS-közvetített némító

ektópiás expressziója a célgének, gyomorrák sejteket transzdukált lentivírus vektor kifejező RhoE vagy CXCR4 (amelyet GeneChem, Shanghai, Kína). Röviden, a sejteket szélesztjük és növesztjük 75 80% -os összefolyás antibiotikumok nélkül, amelyet követően a lentivirális vektorok adtunk a sejtekhez tartalmazó táptalajban polibrént (2 ng /ml) a MOI 50. Ezután a sejteket tenyésztettük másik 72 óra, és a fertőzés a hatékonyságot ellenőriztük fluoreszcens mikroszkópia és Western blot analízissel. Interferencia a humán RhoE vagy CXCR4 expresszióját értük el alkalmazásával RNS-interferencia technika. siRNS duplexeket szintetizált Takara Biotechnology (Liaoning, Kína), valamint a célzott szekvenciák RhoE vagy CXCR4 határoztak így: katalógusa

RhoE, 5'-GAACGUGAAAUGCAAGAUAUU-3 ';

CXCR4, 5'-UAAAAUCUUCCUGCCCACC-3 '. Matton

Control siRNS duplexeket tervezték után lekérdező BLAST adatbázis nem specifikus célzott sorozatok. A sejteket transzfektáltuk oligonukleotid duplexek alkalmazásával LipofectamineTM 2000 (Invitrogen, NY, USA), a gyártó utasításai, amelyet követően azokat alávetik további elemzések 48 órával a transzfekció.

sebgyógyító Assay

kimutatására sejtmozgás, exponenciális fázisban sejteket oltottunk 6 mérőhelyes lemezeken. Miután a sejtek összeértek, mint egy egyrétegű sejteket a lemezen szubsztrátum, egy műanyag pipetta hegyét átszívott a központ a lemez előállításához a tiszta 1 mm széles sérült területen, és a tápközeget helyettesítettük friss RPMI 1640, amely 1% magzati szarvasmarha szérumot . 48 óra múlva a sejtek mozgását a sérült területre alkalmazásával értékeltük egy fáziskontraszt-mikroszkóp a korábban leírtak [19,20].

Invasion Assay

sejtek invázióját vizsgálatokat végeztünk Transwell lemez (Corning, NY, USA) bevonva Matrigel (Becton Dickinson, NJ, USA). Röviden, a Matrigel hígítottuk, hogy koncentrációja 2 mg /ml, és 50 ul ezt az oldatot helyeztük polikarbonát szűrő, és levegőn megszárítjuk. Öblítés után PBS-sel, a szűrőket lyukakba helyeztük, és 700 ul RPMI-1640 táptalajban, amely 10% FBS-t adtunk be az alsó kamrába. A sejteket újra szuszpendáltuk RPMI-1640, amely 1% FBS-t és 1 × 105 sejt, 0,2 ml meghatározott közegben vittünk be a felső kamrába. A sejteket az invázió kamrák inkubáltuk párásított inkubátorban 12-48 órán át. Az elegyet további inkubálás sejtek behatolt a pórusokat, a membrán és a diszpergált, hogy az alsó felület a szűrőket megfestettük 5% kristályibolya oldat megjelenítés. Ezután a megszállták sejteket minden lyukban alatt megszámoltuk fénymikroszkóp (Olympus, Tokió, Japán) és mennyiségileg vizualizálhatunk öt random mezők nagyításban × 200 és átlagolt által leírt Albini [21]. Az inváziós vizsgálati eljárás 3-szor ismételtünk. Az érték az oszlopdiagram mutatja az átlagos száma megszállták sejtek 3 külön kísérletben. Katalógusa

farokvénába áttétes Analitika katalógusa

A farokvénába áttétes assay meghatároztuk a korábban leírtak szerint [22]. Harminc hím csupasz egereket megfogni legjobb humánus gyakorlatot és ápolták az összhangban NIH Animal Care and Use Committee irányelveket. A sejteket tripszin alkalmazásával betakarítottuk és háromszor mostuk PBS-sel. Az egereket ezután injektáltunk 1 × 106 sejt, 0,1 ml PBS-ben keresztül injekció farokvénába való beadása. Az egereket ezután monitorozni általános egészség és a teljes test súlyát. A 28. napon az injekció beadását követően az egereket leöltük. Tüdőben és a májban szöveteket által megfigyelt szabad szemmel, és a száma látható daganatok a tüdőben és a májban felületi mennyiségileg. Tüdőben és a májban szöveteket vágtuk soros szakaszok, megfestettük hematoxilin és eozin, majd megfigyelhető fénymikroszkóp alatt. Kísérleti és a kontroll-csoport mindegyik tartalmazott 6 egerekben. Minden vizsgálati eljárást jóváhagyta a kísérleti állatjólléti és etikai bizottság, a negyedik Katonai Orvostudományi Egyetem. Állatkísérletek végeztünk jóváhagyásával az Intézményi Bizottság és Takarmányozási Kutatóintézet, összhangban nemzeti irányelvek az ellátás és a laboratóriumi állatok felhasználását. Katalógusa

tumormetasztázisban PCR Array katalógusa

A kifejezés a metastasis- asszociált gének úgy határoztuk meg, a humán tumor metastasis PCR Array (PAH-028A; SuperArray Biosciences, Maryland, amerikai Egyesült Államok) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. Először is, a teljes RNS-t kivontuk RhoE-lentviral fertőzött SGC7901 sejtek és kontrollsejtek standard protokollok, amelyet ezután alakítjuk első szál cDNS-t. A cDNS-templátot együtt egy 2 × SuperArray PCR Master Mix, adunk a lyukakhoz egy PCR Array lemez (384 lyukú), amely a gén-specifikus primert készletek, és alá kell vetni a valós idejű PCR-rel. A PCR ciklus körülmények a következők voltak: 40 ciklus 95 ° C-on 15 s, 60 ° C-on 1 percig és 72 ° C-on 30 másodpercig. Öt háztartási gének használtunk belső ellenőrzés. A hajtás-változás a kifejezés a metasztázis kapcsolatos gének határoztuk meg ΔΔCt módszerrel.

Statisztikai elemzés

Az adatok elemzése végeztük az SPSS 17.0 statisztikai elemző szoftver (Chicago, IL, USA). A Mann-Whitney U tesztet használtuk, hogy értékelje a jelentőségét különbségek a frekvencia expressziójának RhoE között gyomorrák szövetek és nyirokcsomó-metasztázisok. A Kruskal-Wallis H teszt multi-csoportok, és Mann-Whitney U teszt két csoport összehasonlítást alkalmaztunk, hogy elemezze a kapcsolat a két RhoE expressziós szintek és a különböző klinikai-patológiai tényezők a gyomorrák példányok. Kumulatív túlélési idő számítása a Kaplan-Meier túlélési módszert és elemezni kell a log-rank teszt. Egyváltozós és többváltozós elemzés alapján a Cox-féle regressziós modell. Összehasonlítások a mennyiségi adatok elemeztük Student-féle t-teszt két csoport között. Korreláció elemzés között kifejezése RhoE és CXCR4 becsültük Spearman korrelációs módszerrel. A különbségeket akkor tekintettük statisztikailag szignifikánsnak, ha P < 0,05.

Eredmények katalógusa

Túlzott kifejezése RhoE korrelál a differenciálás minőségű és stádium gyomorrákban szövetekben, és jelzi a rossz prognózisú betegek katalógusa

A kifejezés a RhoE a gyomor rákos szövet, szomszédos, nem daganatos szövetekben és a kapcsolódó metasztatikus nyirokcsomó szövetekben vizsgáltuk immunhisztokémiai (1A). RhoE expressziót találtunk gyengén fejeződik, vagy akár hiányzik a szomszédos, nem-tumor szövetekben (a), míg az expressziója jelentősen magasabb volt a gyomorrák szövetekben és nyirokcsomó-metasztázisok (B-E). Ezután azt viszonyát elemezte RhoE festés és a klinikopatológiai paraméterek gyomorrákos betegek (1. táblázat). Az eredmények azt mutatták, hogy sem a nemi, sem életkor korrelált a kifejezés a RhoE. Ugyanakkor fokozott RhoE expresszió statisztikailag korrelált évfolyam differenciálódás (P = 0,005) és a stádium, amely abból állt, a tumor mérete (T, P < 0,001), nyirokcsomó invázió (N, P = 0,001), és a távoli áttét (M, P = 0,003). Továbbá, Kaplan-Meier túlélési analízis azt mutatta, hogy a betegek nagy expressziós szintjének RhoE, bemutatva egy rövidebb teljes túlélés, mint azoknál a betegeknél, negatív kifejezése RhoE (1b ábra). Többváltozós Cox modellben felmérések azt mutatták, hogy a szintek RhoE kifejezés volt független és jelentős tényező a túlélésért gyomorrákos betegek (táblázat S1).
expressziós szintje RhoE Matton Kategória katalógusa n -
+ katalógusa ++ katalógusa +++ katalógusa P value
Total9014283216Age0.421≤6041610187>6049818149Gender0.742Male679232213Female2355103Differentiation0.005^{aWell52120Moderately471215146Poorly380121610TNM stageT <0.001aT194320T2175840T347414209T4171367N0.001bN031111073N1-N3593182513M0.003bM08014272811M1100145Table 1. Statisztikai elemzése immunhisztokémiai vizsgálat. Katalógusa a, Kruskal-Wallis H teszt; b, Mann-Whitney U teszt CSV letöltése CSV}

Ezt követően megvizsgáltuk az expressziós szintje RhoE elsődleges gyomorrák szövetek és illesztett metasztatikus nyirokcsomó szövetekben. Az expressziós szintek RhoE voltak jelen 7 gyomorrák szövetekben, gyengén expresszálódik a 16 gyomorrákos betegek, mérsékelten kifejezve 11, és igen kifejezett 6 rákos szövetekben, ill. Ezzel szemben a nyirokcsomó-metasztázisok a megfelelő száma 3, 12, 14 és 11. Ezenkívül a kifejezés a RhoE szignifikánsan magasabb volt áttétes nyirokcsomó szövetekben, mint amit a primer rákos szövet. Ezek a megfigyelések azt mutatták, hogy RhoE expresszió korrelációban metasztázis a gyomorrák (2. táblázat, a P < 0,05).
Expressziós szintjének RhoE
szövettani típus
N
- www.Booked.hu + katalógusa ++ katalógusa +++ katalógusa P érték katalógusa Elsődleges rák tissues407161160.048 <sup>* nyirokcsomó metastases403121411Table 2. kifejezése RhoE Elsődleges rákos szövet és az egyező nyirokcsomóáttétek .
* Mann-Whitney U teszt CSV letöltése CSV</sup>

kifejezése RhoE a sejtvonalak elemeztük Western blot (1C). Azt találtuk, hogy képest a GES sejt-vonal, a kifejezés a RhoE szignifikánsan magasabb volt a különböző gyomor rákos sejt-vonalak. Ezen túlmenően, a szint a RhoE fehérje expresszió szignifikánsan magasabb volt a rendkívül invazív SGC7901-M sejt al-line, mint a kevésbé invazív sejt al-line SGC7901-NM. Ezért további vizsgálatok a tumor metasztázis végeztük alapuló celluláris modellezés a SGC7901-M és SGC7901-NM sejt-vonalak.

RhoE elősegíti a migrációs és invazív képességének gyomorrák sejtek in vitro és in vivo

hogy vizsgálja meg a szerepét RhoE gyomorrákban áttét, akkor akár szabályozott protein expresszió SGC7901-NM sejtekben transzdukció a RhoE lentivírusvektor vagy kontroll vektorral (megnevezett SGC7901-NM-RhoE vagy SGC7901-NM-szabályozás ). Ezzel szemben tompítja a RhoE expresszió SGC7901-M sejtek követően elért transzfekciót célzott siRNS ellen RhoE mRNS vagy kontroll siRNS (megnevezett SGC7901-M-siRhoE vagy SGC7901-M-vezérlés -kal). Protein expressziós szinteket is megerősítette a Western blot analízis a transzfekciót követően (2A ábra).

Ezután in vitro
migráció és inváziós vizsgálati eljárás végeztünk (2B és 2C). Azt találtuk, fokozott expressziójának RhoE jelentősen up-szabályozzák a migrációs és invazív képességeit a gyomorrák sejt-vonal SGC7901 nm-es, a sebgyógyulásban és a transwell invázió vizsgálatokban. Ezzel szemben SGC7901-M sejtek mutató megnedvesített expresszióját RhoE mutatott figyelemreméltó gátlását vándorló és invazív képességek, mint mint a kontroll sejtek. Ahhoz, hogy megértsük, hogy a funkciók RhoE gyakoriak voltak események különböző gyomorrák sejtek vagy SGC7091-specifikus események, a gyomorrák sejtvonalak MKN45 és MKN28 használták a teljes ugyanazt kísérletek. Az eredmények mind a sebgyógyulás és transzwell behatolás vizsgálatok során kiderült, hogy RhoE támogatta a migrációs és invazív képességeket mindkét MKN45 és MKN28 sejtek (ábra S1), amely azt sugallta, hogy a funkciók RhoE hogy találtak in vitro katalógusa teljes volt az összes gyomorrák sejtvonalak. Közben mi is végeztünk MTT assay tesztelni ürü megváltoztatását RhoE kifejezés befolyásolhatja a sejtnövekedést a gyomorrák a vizsgálatba. Amint ábra S3A látható, sem felfelé szabályozása RhoE a SGC7901 nm-es sejtek, sem down-regulációja RhoE a SGC7901-M sejteket okozhat jelentős változása a sejtproliferáció (p 0,05), így kizárt a hatását RhoE sejtproliferációra amely hozna zavart Eredményeink továbbá megerősítette, hogy RhoE elősegítheti a sejtek mozgékonyságát a gyomor rákos sejteket. katalógusa

Ahhoz, hogy tovább vizsgálja, hogy fokozott RhoE megváltoztathatta volna a in vivo katalógusa metasztatikus képességét gyomorrák sejtek végeztünk in vivo katalógusa farokvénába áttétes esszék nude egerekben SGC7901-NM-RhoE és SGC7901-NM-ellenőrzési sejtvonalak. A leöltük egerekben, azt találták, hogy a sejtek megjelenítésére magasabb szintű RhoE kifejezés vezetett, hogy jelentősen jobban látható máj- és tüdő-felületi tumorok, mint a kontroll sejtek (P < 0,05, 3. ábra). H és E festés kimutatta, hogy SGC7901-NM-RhoE sejtek látszólag gyártott áttétek mind a máj és a tüdő, míg a kontroll sejtek, csak részleges áttétek. Együttesen ezek az adatok arra utalnak, hogy RhoE játszott fontos szerepet játszhat áttéte gyomorrák sejtek mind in vitro katalógusa és in vivo katalógusa.

CXCR4 lehet le- patak génje RhoE gyomorrákban katalógusa

az egyes lehetséges downstream gének, amelyen keresztül RhoE közvetítheti a funkcióját a metasztázis gyomorrák sejtek végeztünk PCR Array felfedezni differenciáltan kifejezése metasztázis kapcsolatos gének megoszlik SGC7901-NM-RhoE és SGC7901-NM-ellenőrzési sejtvonalak. Gének fokozott vagy csökkent ≥ 2-szeres tekintették potenciális RhoE függő downstream génje. Összegezve, észleltünk 84 gének, és végül talált 6, amely markánsan után megváltozott expresszióját RhoE fokozta (3. táblázat). Között 6 gén 3 (CXCR4, VEGFA, CTSK) volt akár szabályozott, és három másik (MMP7, CD82, CTSL1) voltak lefelé szabályozni SGC7901-NM-RhoE sejteket.
Expression mRNS katalógusa Gene név katalógusa Leírás katalógusa SGC7901-NM-ellenőrzési katalógusa SGC7901-NM-RhoE katalógusa CXCR4Chemokine (CXC motívum) receptor 41.003.30VEGFAVascular endothelialis növekedési faktor A1.002.78CTSKCathepsin K1.002.68CTSL1Cathepsin L11.00-2.12CD82CD82 molecule1.00-2.29MMP7Matrix metallopeptidáz 71.00-2.47Table 3. eltérően expresszált metasztázis kapcsolatos gének után kiterjesztett RhoE Expression.
CSV letöltése CSV

Ebben a vizsgálatban, a kifejezés a CXCR4, VEGFA, CTSK és CD82 ellenőrizték Western blot analízissel és érdekes módon, azt találtuk, hogy csak a CXCR4 kifejezés összhangban volt a kapott eredmények PCR array analízis. A fehérje szintje CXCR4 elnyomta interferenciája RhoE és ezzel szemben nőtt, ha RhoE volt ectopiásan kifejezve (4A). Így a korreláció RhoE és CXCR4 expresszióját analizáltuk immunhisztokémiai 60 gyomor rákos szövet Az eredmények azt mutatták, hogy a CXCR4-ben erősen expresszálódik a szövetekben, ahol RhoE volt pozitívan festődött, míg azt rosszul kifejezett azokban a szövetekben, ahol a RhoE fejeztük alacsony szinten (4b ábra). Ezen felül mindkét RhoE és CXCR4 kifejezés volt egybehangzó a 83,3% (50/60) a gyomor carcinoma minták esetén a Spearman R korrelációs együttható 0,80 (P < 0,001), és jelezte, hogy szoros összefüggés áll fenn a két RhoE és CXCR4 kifejezést gyomorrák (4. táblázat). Amint arról, overexpresszált CXCR4 szintén fontos szerepet játszik a rák metasztázis és részt vesz a EMT folyamat, amely azt sugallta, hogy a CXCR4 lehet egy downstream génje RhoE együtt fontos a metasztázis gyomorrák-sejtek [23]. Matton CXCR4
Spearman-féle correlation
RhoE
+
++
+++
Negative
n
p
p
R
+1820060<0.001<0.0010.80++11730+++0270Negative2008Table 4. Összefüggések kifejezése RhoE és CXCR4 a 60 pár Gyomorrák szöveteket.
CSV letöltése CSV

CXCR4 elengedhetetlen indukáló invázió RhoE gyomorrákban sejtek katalógusa

hatásának vizsgálatára CXCR4 a képessége, RhoE működni a metasztázis gyomorrák, mi fokozott expresszióját CRCR4 a SGC7901-m-siRhoE sejtek lentivirális tranduction és a lefelé szabályozott expresszióját SGC7901-NM-RhoE sejtek siRNS interferencia. A fehérje szintet határoztuk meg Western-blot-analízis (ábra S2). A következő transwell assay, azt találtuk, hogy fokozott expressziójának CXCR4 helyreállíthatja invazív képességét SGC7901-m-siRhoE sejtekben, míg ezzel szemben silencing endogén CXCR4 elfojtott az invázió SGC7901-NM-RhoE sejteket (5. ábra). Ezek a megfigyelések azt mutatták, hogy RhoE indukált gyomor rákos sejtek invázióját, amelyet részlegesen által közvetített CXCR4. Ezek a megfigyelések azt is igazolták, hogy további CXCR4 volt downstream célpontja RhoE.

Vita katalógusa

abnormálisan expresszált RhoE gyakran összefügg a tumor progresszióját. Ugyanakkor a szerepe o RhoE eltolódhat között tumorszuppresszornak onkogén eredetétől függően a tumor [7-9]. Amint arról, gyomorrák továbbra is az egyik leggyakoribb rákos világszerte, különösen Kelet-Ázsiában. Korábban kimutatták, hogy az abnormális RhoE kifejezés jól korrelál a progresszió gyomorrák. Ahogy Zhou és Li leírt, a kifejezés a RhoE fokozott gyomorrák indukálása révén HIF-1α, és amelynek expressziója mehet kiegészített még több, amikor a rákos sejtek generálására ellenállás daganatellenes gyógyszerek. Emellett fokozott expressziója RhoE elősegíti a gyógyszer-rezisztencia elnyomásával Bax expresszió [13,24].

A jelen tanulmányban azt találták, hogy RhoE expresszió emelkedett a gyomorrák szövetekben mivel nem volt jelen, vagy gyengén kifejezett szomszédos, nem daganatos szövetekben. Továbbá, klinikai bizonyíték azt mutatta, hogy RhoE túlzott expresszió szignifikáns korrelációt mutatott a fokozatot a rákos sejtek differenciálódását és a TNM stádium, amely a tumor mérete (T), nyirokcsomó invázió (N) és metasztázis (M). Ennél is fontosabb, RhoE expressziós szintek voltak a független és jelentős kockázati tényezőt jelent a túlélés a gyomorrák. Sőt, akár szabályozott kifejeződése RhoE tudta megjósolni rossz eredményt gyomorrákos betegek. Mindezzel együtt, az adatok amellett szólnak, hogy RhoE volna szolgált egy onkogén gyomorrákban és pozitív szerepet játszott a gyomorrák progresszió, különösen a rák áttétet. Ez formálisan lehetséges, hogy RhoE lehetne új prognosztikai faktor gyomorrákos betegeknél. Így, figyelembe véve, hogy a metasztázis az egyik fő oka gyomorrák mortalitás, eredményeink is lehet, hogy új nyom vagy az új cél, hogy gátolják a tumor metasztázis gyomorrák, és talán végül segíti a fejlesztés a terápiás stratégiák, hogy meghosszabbítja a betegek túlélését.

Ennek ellenére a szerepe RhoE a rákos áttétek is részben meghatározva. A hepatocelluláris karcinóma és mesenchymalis tumorsejtek fokozott RhoE expressziója korrelál a csökkent metasztatikus képességét, míg a melanoma sejtek, RhoE elősegíti a sejtek migrációját és invázióját [10,12,25]. Ahhoz, hogy vizsgálja meg a szerepét RhoE metasztázisban gyomorrák, mi leütött RhoE a SGC7901-M sejt-vonal, amely nagy metasztatikus potenciállal és mi indukált expresszióját a SGC7901-NM sejt-vonal, amely gyenge a metasztázis . Ezt követően, in vitro
vizsgálatokban kimutatták, hogy a megnövekedett RhoE mozdítani sejtes motilitás és invazivitását, miközben csökkent RhoE vezetett non-invazív jellege gyomor rákos sejteket. Ezek az eredmények tovább erősítette a in vivo katalógusa vizsgálatban. Jól ismert, hogy a fokozott rák sejtek migrációját és invázióját elengedhetetlen lépései a végső metasztázis képződés. Ezért, a gyomor rákos sejtek, RhoE lehet egy funkcionális metasztázis elősegítő gént. Mindazonáltal azt is észrevette, hogy a sejt morfológiája sokat változott után megváltoztatását RhoE kifejezés. További vizsgálatok eredménye, hogy ez a morfológiai változás lehet okozta eltűnése stressz rost (ábra S3B), nem pedig a változás a sejtproliferáció.

Amint arról, RhoE szabályozza rák áttétek, méghozzá többnyire gátlásával ROCK /MYPT útvonal [26]. Ez a rész vizsgálták egy másik kutatási tanulmány által csoportban (nem közölt adatok). Ebben a vizsgálatban alkalmaztunk PCR Array analízis azonosítására egyéb downstream gének RhoE gyomorkarcinómában metasztázis, azzal a céllal, meghatározó az alapul szolgáló mechanizmusokat tumor metasztázist. Következésképpen, mi kapott 6 differenciáltan expresszálódó metasztázis kapcsolatos gének következő up-szabályozás RhoE (CXCR4, VEGFA, CTSK, MMP7, CD82 és CTSL1). MMP7 (mátrix metalloproteináz-7) tartozik, az MMP család fehérjék, amelyek részt vesznek a bontást az extracelluláris mátrix mind fizikai, mind patológiás állapot [27].

Azt jelentették, hogy a megemelkedett expressziója MMP7 fokozott az invazív képességét a rákos sejtek [28]. PCR array analízis MMP7 találták alulszabályozott erősen invazív SGC7901-NM-RhoE sejtek, ami ellentmond azoknak a korábbi jelentéseket. Így vettük MMP7 kevésbé fontos a vizsgálatba, és nem igazolja a kifejezés a Western blot. Hasonló okból, azt nem ellenőrzi a kifejezés CTSL1. Meglepetésünkre, többek között a 4-gének által észlelt Western-blot-analízis, csak a kifejezés a CXCR4 találták összhangban van a kapott eredményt PCR Array elemzést. A további vizsgálat azt mutatta, hogy up-reguláció CXCR4 gyomorrákban sejtek részben visszaállítják az invazív képesség, ami elnyomta RhoE knock-out. Ezzel szemben, down-regulációja CXCR4 csökkent az invázió gyomorrák sejtek, amelyek indukáltunk overexpresszált RhoE. Így CXCR4 felmerülhet down-stream effektor RhoE gyomorrákban áttét. Katalógusa

CXCR4, együtt ligand CXCL12 (azaz a CXCL12 /CXCR4 tengely), jól ismert tény, hogy sok tekintetben a tumorprogresszió, különösen a tumor metasztázist. Korábban jelentették, hogy a CXCL12 /CXCR4 tengely lényeges volt az áttétes rákos sejteket, hogy eloszlassa a szerveket, és ezáltal lehetővé teszi a tumorsejtek eléréséhez celluláris rések, amelyek kedveznek a tumor-sejtek túlélését és növekedését [29]. Amellett, hogy aktivált CXCR4 igényel kötődését a G-fehérjék átviteléhez extracelluláris jelek sejtek belsejébe történő, és kezdeményezi eltérő válaszokat [23]. Ezen kívül, ha figyelembe vesszük, hogy RhoE tagja a G-fehérje család, tekinteni, hogy RhoE lehetne bővíteni a repertoárját CXCL12 /CXCR4 tengely jeleket növelésével a kifejezés a CXCR4 receptor. Ezzel szemben RhoE esetleg kötődnek CXCR4 és közvetíteni a downstream jelátvitelt, ami végül eredményezhet rák metasztázis. Továbbá, azt korábban kimutatták, hogy RhoE részt vesz a hipoxiával indukált EMT, kulcsfontosságú folyamat, amely hozzájárul a rák metasztázis, amelyben a CXCR4 is részt vesz. Ezek szoros kapcsolat áll fenn RhoE és CXCR4 erősen ajánlott, hogy RhoE fokozott áttét akár szabályozó CXCR4 gyomorrákban. A részletes mechanizmus felelős ezen utak igényel további vizsgálatot.

Következtetés katalógusa

A vizsgálat kimutatta, hogy RhoE volt túltermelõdik gyomorrák és korrelál a daganatos progresszió.

• PLoS One: konvertálása microarray Signature egy diagnosztikai vizsgálat: A Trial of Custom 74 Gene Array Tisztázási és előrejelzése a gyomorrák prognózisa
• PLoS One: resveratrol gátolja a gyomorrák indukálva G1 fázis leállását és az öregedés egy Sirt1-függő módon