PLoS ONE: probiootti Seos VSLNopeuttaa mahahaava Healing stimuloimalla endoteelikasvutekijä

tiivistelmä

Tutkimukset vaikutusta arvioitaessa ja mekanismi probioottien sairauksista ylemmän ruoansulatuskanavan (GI) myös mahahaavan rajoittuvat huolimatta paljon työtä ja lupaavia tuloksia hoitovaihtoehto muiden GI sairauksia. Tässä tutkimuksessa selvitettiin mekanismeja, joilla probiootti seos VSL(sekoitus kahdeksan probioottisten bakteerien kuten Maitohappobakteerien
, bifidobakteerien
ja Streptococcus
lajit) paranee etikkahappoa aiheuttama mahahaava rotilla. VSLannettiin oraalisesti matalalla (6 x 10 ^{9 bakteerit) tai korkea (1,2 x 10 10 bakteerit) annostuksin päivänä 3 sen jälkeen, kun haavauman induktion 14 peräkkäisenä päivänä. VSLhoitoa tehostaa merkittävästi mahahaavan paranemista annoksesta riippuvaisella tavalla. Arvioida mekanismi (t), jolloin VSLkohdistuu sen suojaava vaikutus, me määrällisesti geenin ilmentyminen useiden proinflammatoristen sytokiinien, proteiinin ja ilmentyminen mahan musiinia MUC5AC, sääntely sytokiini-IL-10, COX-2, ja erilaisia ​​kasvua tekijät. Kaikkien komponenttien tutkittu, vain ilmaisun ja proteiinin tuotanto VEGF nostettiin 332-kertaiseksi päivänä 7. haavauma kudoksissa hoidettujen eläinten VSL. Odotetusti, eläimet käsiteltiin VEGF neutraloivan vasta huomattavasti viivästynyt mahahaavan paranemista VSLhoidettujen eläinten. Tämä on ensimmäinen raportti osoittaa korkea tehokkuus probioottisten seoksen VSLparantamisessa mahahaava paranemista. Probiootti tehokkuus oli tehokas korkeammilla pitoisuuksilla VSLspesifisesti lisäämällä ilmaisun ja tuotanto angiogeneesin edistämisessä kasvutekijöitä, ensisijaisesti VEGF.}

Citation: Dharmani P, De Simone C, Chadee K (2013) Probiotic Mixture VSLNopeuttaa mahahaava Healing stimuloimalla endoteelikasvutekijä. PLoS ONE 8 (3): e58671. doi: 10,1371 /journal.pone.0058671

Editor: John Wallace, McMaster University, Kanada

vastaanotettu: 29 lokakuu 2012; Hyväksytty: 07 helmikuu 2013; Julkaistu: 06 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Dharmani et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Kanadan Institute for Health Research (CIHR, KC). PD rahoitettiin kanadalainen Association of Gastroenterology-Axcan Pharma-CIHR Research ja Fellowship Award. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat seuraavat kiinnostusta. PD rahoitettiin kanadalainen Association of Gastroenterology-Axcan Pharma-CIHR Research ja Fellowship Award. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

mahahaava paraneminen on spontaani, monimutkainen joukko erilaisia ​​mekanismeja, jotka toimivat rinnakkain ja korjata epätasapaino aggressiivinen (esim happo, pepsiiniä, proinflammatoristen sytokiinien ja helikobakteeri
) ja puolustava tekijät (esim limaa, bikarbonaatin, verenkiertoa ja kasvutekijöitä) vatsassa [1]. Prosessissa lieventäminen aggressiiviset luminal tekijät, täyttö limakalvon puutteellinen lisääntyvien ja vaeltavat epiteelisolujen ja ihonalainen komponentti jotta rekonstruoida limakalvon arkkitehtuuriin [2]. Me ja muut [3], [4], [5] ovat osoittaneet tehoa ja oletettua mekanismia erilaisten lääkkeiden ja yrtit parantaa prosessin spontaania haavojen paranemiseen eri in vivo
mahahaava malleja. Kuitenkin tutkimukset vaikutusta arvioitaessa probioottien sairauksista ylemmän ruoansulatuskanavan (GI) ja erityisesti mahahaava rajoittuvat huolimatta paljon työtä ja lupaavia tuloksia hoitovaihtoehto muiden GI sairaudet, kuten tulehduksellinen suolistosairaus [6], [ ,,,0],7], [8], [9].

Probiootit ovat eläviä mikro-organismeja, jotka lisäksi ravintoarvon suoda useita terveyshyötyjä, kun annetaan runsaasti määrä. VSLon probiootti valmiste, joka sisältää seosta, jossa oli kahdeksan bakteerilajien, neljä lajia Lactobacilli
( acidophilus
, bulgaricus
, casei
, plantarum
), kolmen lajin bifidobakteerien
( breve
, infantis
, longum
) ja yksi Streptococcus
laji, jonka on osoitettu olevan kliinisesti tehokas estämään leimahduksia tulenkestäviä pouchiitti [8] ja johtaa peruuttaminen haavainen paksusuolen tulehdus [9]. Olemme aiemmin osoittaneet, että VSLtai sen erittyy tuotteet ovat tehokkaita paksusuolen mukiinia eritystä in vitro
ihmisen paksusuolen epiteelisoluissa ja paksusuolen silmukka tutkimuksissa eläinmalleissa [10]. Kuitenkin vaikutus probioottisten hoidon akuutista mahalaukun liittyvät vahingot maha- ei ole hyvin tutkittu. Ensisijainen syy on se, että suolen tarjoaa monia haitallisia fysiologisia tiloja, kuten hapan pH, ruoansulatusentsyymien, sappihappoja ja mekaanista rasitusta, joka vaimentaa selviytymisen ja kasvun probioottisten mikro-organismeja. Kuitenkin hoito on runsaasti määrä useita probioottisten mikro-organismien voi voittaa tämä rajoitus. On olemassa muutamia raportteja yksittäisten probioottisten bakteerien kuten Lactobacillus rhamnosus
[11], L. gasseri
[12], L. acidophilus
[13] ja Bifidobacterium
[14] annetaan suojaa mahahaavan edistämisessä haavojen paranemiseen eri in vivo
haavauma malleja. Kuitenkin tutkimukset vaikutusta probioottisten bakteerien parantamisesta H. pylori
hävittämistä olivat ristiriidassa niiden havaintojen [14], [15]. Tuore tutkimus on osoittanut, että riittävä otetulla seoksella 8 probioottien kantojen voisi hävittää H. pylori
[16]. Tällä hetkellä se ei vielä tiedetä, onko sekoitettu probioottibakteereille ovat tehokkaampia kuin yksittäiset kannat edistämisessä haavojen paranemiseen. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme solumekanismeja jolloin VSLprobiootti seos täydennettiin mahahaavan paranemista rotilla.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet

Kuusi viikkoa vanhoja Sprague-Dawley-rottia, jotka painoivat 150 ja 200 g (Charles River, St. Constant, Quebec) pidettiin häkeissä 2 per ryhmä tasaisessa huoneenlämmössä, jossa on 12-tunnin valo ja pimeä syklit, ja ruokitaan normaalia jyrsijöiden ruokaa ja vettä halun
. Seuraavat 7 päivän totutusjakson, rotat satunnaistettiin koe- ja kontrolliryhmissä induktion mahahaavan. Eläinkokeen eettinen komitea University of Calgary hyväksyi tutkimuksen.

Experimental Suunnittelu

vaikutuksen tutkimiseksi VSLprobiootti seos mahahaavan paranemista ja lieventäminen hyökkäävä luminal tekijöiden (pro -inflammatory sytokiinien) ja edistäminen cytoprotective puolustava tekijät (sääntely sytokiinit, musiinituoton ja kasvutekijät), rotat jaettiin kolmeen koeryhmään. Kontrollit eläimiä käsiteltiin ajoneuvon jälkeen haavauma induktion ja kaksi muuta ryhmää, jotka saivat joko matalan (6 x 109 bakteeria /eläin /päivä) tai korkea (1,2 x 1010 bakteeria /eläin /vrk) annos VSL. Eläimet lopetettiin päivänä 3, 7 ja 14 ajoneuvon tai VSLTreatment (perustelut, katso kappale mahahaava induktio ja VSLhoitoa). Yhteensä 18 eläintä käytettiin kunakin ajankohtana ( N
= 6 jokaisen tutkimuksen /ajankohtana) ja tutkimus tehtiin kolmena kappaleena. Vaikutuksen tutkimiseksi anti-verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF) on mahahaava paranemista, neutraloivia vasta-aineita VEGF: ää käytettiin. Tässä kokeessa neljä ryhmää käytettiin. Sen jälkeen haava induktio, kontrolliryhmä käsiteltiin ajoneuvon vain. Hoitoryhmien mukana rottia hoidettiin neutraloivilla VEGF-vasta yksin, rotat, jotka saivat suuren annoksen VSL(1,2 x 1010 bakteeria /eläin /vrk) yhdessä kontrolli IgG-vasta ja rotilla, jotka saivat suuren annoksen VSL(1,2 x 1010 bakteerit /eläin /vrk) yhdessä neutraloivat VEGF vasta-aineita. Vasta-aine testiryhmään (IgG ja neutraloivat VEGF-vasta-aine) annettiin vasta annoksella 10 mg /kg (varten perustelut, ks VEGF neutraloivat vasta-hoito). Eläimet lopetettiin katkaisemalla kaula päivänä 3, 7 ja 14 seuraavat anti-VEGF-hoidon. Yhteensä 24 eläintä käytettiin kunakin ajankohtana (n = 6 kussakin kokeessa /ajankohtana).

Mahahaava induktio ja VSLhoitoa

Krooninen mahahaava aiheutettiin kokeellisesti rotat kuten aiemmin on kuvattu [17]. Nukutuksessa pentobarbitonilla (35 mg /kg kehon painoa, i.p.), vatsa avattiin jonka keskiviivan viillolla. Muovinen putki 6 mm, avataan molemmissa päissä sovellettiin tiukasti herakalvon pintaan etuseinämän mahassa juuri proksimaalisesti antral rauhanen alueelle. Pinnalle mahan, 60 ui 40%: ista etikkahappoa kaadettiin putken läpi 90 sekunnin ajan. Tämä tuotti välittömän nekroosi koko limakalvon ja osa-limakalvon alueella, jossa etikkahappo on sovellettu. Etikkahappo pinnalle jäänyt jälkeen pyyhitään steriilin suodatinpaperin ja avattiin vatsa suljettiin. Olemme aiemmin osoittaneet, että tämä menettely tuottaa histologisesti hyvin tunnettu haavojen 3 päivän kuluttua etikkahappoa altistuksen ja paranee täysin 3 viikon kuluessa ilman rei'itys tai tunkeutuminen ympäröivään elinten [3] - [4].

Hoito VSLmatalassa (6 x 10 ^{9 bakteerit) ja suurina annoksina (1,2 x 10 10 bakteerit) perustui tuloksiin alustavia tutkimuksia viidestä eri annostuksilla VSL(1,5 x 10 9, 3 x 10 9, 6 x 10 9, 1,2 x 10 10 ja 2,4 x 10 10 bakteeria /eläin /päivä, tässä järjestyksessä). VSLannokset 1,5 x 10 9 ja 3 x 10 9 bakteeria /eläin /vrk ei todettu tehokkaaksi keinoksi edistää mahahaavan paranemista, kun taas vaikutus annoksen 2,4 × 10 10, bakteerit /eläin /päivä mahahaava paranemiseen ei ollut merkittävästi erilainen kuin 1,2 × 10 10 bakteeria /eläin /päivä (Kuva S1). Hoito VSLaloitettiin, kun haava oli täysin kehittynyt 3. päivänä etikkahappoa annon; Tämän pidettiin päivä 1 hoidon seuraavien 14 päivän ajan. PH eri pitoisuuksia VSLoli 7,0. Eläimet lopetettiin päivänä 3, 7 ja 14 seuraavaa VSLhoitoa. Haavaumia ja ei-haavainen alue kustakin eläimestä huuhdeltiin jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella laitettiin jäihin ja kolmea poikkileikkauksia kerättiin. Kaksi poikkileikkaukset olivat snap-jäädytettiin nestetypessä ja varastoitiin -70 ° C: ssa RNA: n eristys ja proteiinin valmistamiseksi. Kolmas poikkileikkaus välittömästi kiinnitettiin 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin histologista analyysiä.}

Assessment of haavauma koko, prosenttiosuus paranemista ja histologinen tutkimus

Koko haavauman ja prosenttiosuus haavojen paranemiseen eri aikoina post käsittelyt arvioitiin rotilla vatsassa leikkaamalla pitkin suurempaa kaarta ja haavauma (mm ^{2) ala mitattiin. Kaksi eri yksilöiden mittasi haavauman sokkona. Prosenttiosuus paraneminen laskettiin:}

histologiset tutkimukset suoritettiin aikaisemmin kuvatulla menetelmällä [18]. Lyhyesti, haava kraatteri kunkin vatsa leikattiin pois ja kiinteä yön yli 10% neutraaleja puskuroituun formaliiniin, sitten dehydratoidaan vähitellen etanoliin ja upotettiin parafiiniin käyttäen neoclear välituotteena liuottimena. Jaksot 6 pm saatiin automatisoidussa mikrotomi. Haavainen leikkeet värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H &E) histologista arviointia paranemisen aikana. Mikroskooppisen, H &E-kudokset ilmoitettiin osoittaa: normaali ulkonäkö, lievä infiltraatit tulehdussolujen osaksi lamina propriaan limakalvon, joko lainkaan tai vain matalia eroosion tai syvä eroosio ja haavaumat.

Quantitative real-time PCR-analyysi

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi suoritettiin arvioimaan muutoksia geenien koodaavat eritys- musiinia (MUC5AC), syklo-oksigenaasi-2 (COX-2), pro-inflammatorisia (TNF-α ja IL- 1β) ja sääntelyn (IL-10 ja TGF-β) sytokiinien ja verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF), transformoiva kasvutekijä-β (TGF-β) ja epidermaalinen kasvutekijä (EGF). Kokonais-RNA uutettiin haavaumia ja ei-haavainen kudoksen TRIZOL-reagenssia (Invitrogen). Saanto ja puhtaus RNA määritettiin-analyysiä varten. 2 ug RNA: ta käänteiskopioitiin käyttämällä M-MLV käänteistranskriptaasia (Invitrogen), kuten valmistajan ohjeiden. Yksi ui cDNA: ta käytettiin reaaliaikaista PCR (Corbett Research). Reaaliaikainen alukkeita käytetään erityisiä hehkutus lämpötila on esitetty taulukossa 1. Amplifikaatiot suoritettiin Qiagen n Quantitect SYBR Green PCR -kittiä käyttämällä seuraavia sykliolosuhteita: 94 ° C pidä 15 min, jota seurasi 40 sykliä denaturointi 94 ° C: ssa 20 s, pariutuminen vastaavat lämpötiloissa 30 s ja pidennys 72 ° C: ssa 30 s. Erityisyys vahvistus tarkistettiin sulaa käyräanalyysi. MRNA ilmentyminen eri geenin normalisoitui vastaan ​​GAPDH, ja taita siirtyä kontrolli määritettiin mukaisesti ddCt menetelmä [19].

Protein Tasot VEGF, TGFp ja EGF mahalaukun kudoshomogenaatti

Mahalaukun kudokset homogenisoitiin kylmässä fosfaattipuskurisuolaliuosta (PBS, pH 7,4) käyttäen Polytron-homogenisaattoria. Kudoshomogenaattia sentrifugoitiin 20000 x g 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa, jolloin saadaan kirkas supernatantti ja proteiinin pitoisuudet mitattiin käyttäen BCA (bikinkoniinihappo) kit. Proteiini VEGF, TGF-β ja EGR homogenoitiin mahalaukun kudosten sekä haavaumia ja ei-haavainen limakalvon mitattiin käyttäen ELISA-kittejä mukaan valmistajan protokollan (rotan VEGF ELISA Kit, Ray Biotech, rotan TGF-β kit, ebioscience ja rotan EGF ELISA kit, Uscn Life Science Inc.). VEGF, TGF-β ja EGF tasolla ilmaistiin pg /mg kudosta.

neutraloinnin vaikutus anti-VEGF-vasta-aine on mahahaavan paranemista aiheuttama VSL

vaikutuksen arvioimiseksi neutraloivien anti-VEGF-vasta-aine on mahahaavan paranemista edistävät VSL, neljää eläintä käytettiin nimittäin, ohjaus, neutraloivat VEGF-vasta-aine (R &D systems), VSLkorkea annos + IgG (isoformi vasta-aine, R &D järjestelmät), ja VSLsuuri annos + neutraloivaa VEGF-vasta-aine (R &D systems). Alustavissa kokeissa, kolme annosta neutraloivaa VEGF-vasta-aineen (5, 10 ja 20 ug /eläin /päivä; ip) testattiin eläimillä, jotka saivat korkea annos VSL14 peräkkäisenä päivänä, ja annos 10 ug /eläin /päivä havaittiin merkittävästi vähentää paranemista ja valittiin käytettäväksi kaikissa seuraavissa kokeissa. Eläimet lopetettiin päivänä 3, 7 ja 14 päivää sen jälkeen, kun VSL+-vasta-hoitoa. Mahahaava alue mitattiin ja histologinen tutkimus, kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi ja ELISA-pohjainen proteiini-analyysi suoritettiin edellä kuvatulla tavalla.

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmoitetaan keskiarvoina ± SEM. Merkitys erot ohjaus ja VSLkäsitellyissä ryhmissä määritettiin käyttäen Kruskal-Wallisin testi Dunns testin jälkeen vertailla tietyille ryhmille. Valinta ei-parametrinen testi (Kruskal-Wallisin testi) sijaan parametrisen testin (varianssianalyysi, ANOVA) perustuu siihen, että ainakin yksi ryhmistä kaikissa paitsi kolmessa vertailuja oli ei-Gaussin. Yhdenmukaisuuden säilyttämiseksi, Kruskal-Wallisin testiä käytettiin kaikissa vertailuissa. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Graph Pad Instat ohjelmisto. P
arvon > 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

VSLprobiootti sekoitus kiihdyttää mahahaava paranemista

jälkeen herakalvon soveltaminen etikka happo 100% eläimistä kehittyi mahahaavan jälkeen 3 päivää. Tämän jälkeen mahahaava vähitellen parantunut jopa päivä 14 (Fig. 1a). Sen määrittämiseksi, oliko probiootti seos VSLvoisivat nopeuttaa mahahaava paranemista, eläimet käsiteltiin joko matala tai korkea annoksia VSLalkaen päivänä 3, kun haava oli täysin kehitetty seuraavan 14 peräkkäisen päivän ajan. Kuten kuvassa 1 a /b, haavojen paranemiseen päivänä 3 käsittelyn ollut merkittävä joko ohjaus tai VSLkäsitellyissä ryhmissä. Tämän jälkeen oli eteni nousu haavauman paranemista heijastaa lasku haavauman päivänä 7 eläimissä hoidettiin joko alhainen (p = 0,07) tai korkea (p = 0,003) annostukset VSLverrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin ( kuva 1 a). Erityisesti VSLsuurilla annoksilla 14 päivää johti täydellisen haavauman paranemista -50%: lla eläimistä (Fig. 1 a), ilman merkkejä haavaumia limakalvon. Muissa eläimissä oli merkittävä palauttaminen pintakudosta ja laaja kudosten uudistumista (Fig. 1b). Vaikka VSLsiirrettävä merkittävä kasvu haavan paranemisessa, suuren annoksen hoito (% paraneminen oli 57% ja 84% päivänä 7 ja 14, vastaavasti) merkittävästi päihitti pieni annos hoitoja (% paraneminen oli 30% ja 57% päivänä 7 ja 14 vastaavasti; Fig. 1a). Koska päivä 3 hoidon eivät osoittaneet merkittäviä eroja haavauman paranemista valvonta- ja VSLkäsiteltyjen ryhmien kaikki tulokset seuraavissa osissa näkyvät 7. ja 14. päivänä hoidon.

VSLhoitoa edistetään kudosten korjaamiseen on haavauma mahan limakalvon

H &E-värjäys paljasti erilaisia ​​histologisia merkkejä paranemista kesken eri ryhmissä. Päivänä 14, samanlainen kuin meidän brutto löydös haavauman mittaus-, ohjaus- Rotilla minimaalinen korjaus. Siellä vähenivät tulehdusnesteitä, erittäin vähäisestä limakalvon uudistumista, joilla on alentunut koko haava kraatterin. Emme havainneet paljon rauhas organisaatio verrokkirotissa (Fig. 2a). Kuitenkin eläimillä, joita hoidettiin suurella annoksella VSL, joka osoitti maksimi paranemista vähennys koon haavauman oli palauttaminen limakalvon epiteelin (re epiteelin) ja muutama tulehdussolujen. Kuten on esitetty kuviossa 2c, erittäviä rauhasia myös järjestää. Arviointi haavaumia kudosten VSLpieniannoksista hoidetussa ryhmässä esiintyi jonkin verran pinnallinen remodeling vaatimattomat tulehdusnesteitä ja in-täydellinen uudelleen epiteelin limakalvon. Asianmukaisesta järjestämisestä rauhaset nähtiin myös paikoin (Fig. 2b).

vaikutus VSLhoitoa MUC5AC, COX-1/2 proinflammatoristen ja sääntelyyn sytokiinien geeniekspression

lima kerros on ensimmäinen puolustava kerros mahalaukun limakalvon [20], jolla on merkittävä suojaava rooli vastaan ​​happoa ja pepsiiniä vatsassa. Koska MUC5AC on runsaimmin ilmaistuna mucin normaalissa mahalaukun limakalvon, me onko VSLhoidot vaikuttavat MUC5AC-geenin ekspressiota haavaumia ja /tai ei-haavainen kudoksissa. Kuten taulukosta 2, vaikka MUC5AC: n ekspressio oli hieman korkeampi VSLkäsitellyillä eläimillä ei ollut merkitsevästi erilainen ryhmien kesken testattu. Prostaglandiinit ovat muita tärkeitä puolustava tekijä kriittinen ylläpidosta mahalaukun limakalvon eheyden, joiden synteesiä säätelee nopeutta rajoittava entsyymi-syklo- oksigenaasin (COX), joka esiintyy kaksi isoformia-COX-1 ja COX-2 [21]. Konstitutiivisesti COX-1 havaittiin myös olevan ennallaan haavaumia ja ei-haavaumia kudoksiin taas ilmaus COX-2 oli merkitsevästi korkeampi VSLsuuren annoksen hoidetussa ryhmässä päivänä 7, mutta ei päivänä 14 (taulukko 2) .

proinflammatoristen sytokiinien TNF-α: n ja IL-1β on osoitettu olevan tärkeä rooli patogeneesissä mahahaavan aloittamalla aikaisin tulehduksellinen prosessi [22], kun taas sääntely sytokiinin IL-10 on tunnettua vaimentaa TNF-α tuotanto [23]. Expression sekä TNF-α: n ja IL-1β-geenien havaittiin koholla haavauma kudoksissa kolme ryhmää eläimiä. Kuitenkin, VSLhoito ei vaikuta IL-1β: n ja IL-10, ja hieman vähensi TNF-α on haavaumia kudokseen verrattuna vehikkelillä hoidetun (taulukko 2).

VSLhoito stimuloi kasvutekijöiden

rooli kasvutekijöiden VEGF, TGF-β ja EGF angiogeneesissä ja epiteelisolujen muuttoliike ja lisääntymistä mahahaava paraneminen on hyvin dokumentoitu [24], [25]. Kuten on esitetty kuviossa 3, oli merkittävä lisäys VEGF (P < 0,001) geenin ilmentymisen haavauma kudoksissa päivänä 7 eläimissä, jotka saivat pienen tai suurilla VSLverrattuna eläimillä, joita hoidettiin vain vehikkelillä (97 ja 332-kertainen kasvu geenin ilmentymisen VLSalhaisen ja korkean annoksen saaneilla rotilla, vastaavasti). Lisäys VEGF geeniekspression näkyi myös päivänä 14 ja oli näkyvimmin pieniannoksisten VSLhoidettujen rottien (Fig. 3, ylhäällä). VEGF: n ilmentyminen ei muuttunut ei-haavainen kudoksissa kaikki ryhmät tutkitaan. VEGF proteiinipitoisuus mahalaukun kudoshomogenaatti tukee havainnot VEGF-geenin ilmentymisen tiedot (Fig. 4, ylhäällä). Vastaavasti TGF-β ja EGF: ää (Fig. 3 keski- ja alapaneelit) geenin ja proteiinin tasot (Fig. 4 keskellä ja alapaneelit) on merkittävästi lisääntynyt VSLkäsitellyissä eläimissä, mutta muutos oli vähäisempää kuin havaittiin VEGF .

VEGF neutralisoivien vasta vaimentaa VSL-välitteisen mahahaava paranemista

tietojen perusteella kuvassa 3, jossa VEGF oli merkittävästi lisääntynyt vastauksena VSLhoitoa, joka parantaa mahahaava paranemista ( kuva 1), me arveltu, että VSLsuojaava vaikutus ja vaikutusmekanismi oli riippuvainen VEGF. Tämän tutkimiseksi eläimet käsiteltiin suurella annoksella VSL+ VEGF neutraloiva vasta-aine. Kuten kuviossa 5 on esitetty, eläimillä, joita hoidettiin VEGF neutraloivan vasta-aineen laski haavojen paranemiseen 34% ja 41% vastaavasti, päivinä 7 ja 14 verrattuna hoidettujen eläinten suuri annos VSL+ IgG tai ajoneuvon ohjaus (Fig. 5a). Makroskooppisia (Fig. 5b) osoitti, että limakalvon arkkitehtuuriin oli vähemmän koskemattomana VSL+ VEGF neutralisoivien vasta saaneilla rotilla kuin VSL+ IgG käsitelty rotalle päivinä 7 ja 14 hoidon. Eläimet käsiteltiin VEGF neutraloivan vasta-aineen yksinään osoitti vähenemistä haavan paranemisessa verrattuna kontrollieläimiin, mutta tulokset eivät olleet tilastollisesti merkitseviä (Kuva 5a).

Keskustelu

Tämä on ensimmäinen kattava tutkimus osoittamaan, että probiootti seos VSLvoi lisätä paranemista etikkahappoa aiheuttama mahahaavan. Tuloksemme osoittivat, että VSLoli annoksesta riippuvalla tavalla kasvavan ilmentymisen ja tuotannon VEGF, kasvutekijää, jonka tiedetään edistävän angiogeneesiä ja paranemista. VEGF oli ratkaisevan tärkeä mahahaava paranemista hoidon VEGF neutraloivan vasta hidastaa merkittävästi paranemisprosessia vuonna VSLhoidetuilla eläimillä.

ennaltaehkäisevä ja terapeuttinen rooli probioottien on hyvin raportoitu paitsi tapauksessa haavainen paksusuolen tulehdus ja Crohnin tauti [8] - [9], mutta myös olosuhteet, kuten kauppa- poltettu haavat ja ampumahaavoihin [26] - [27]. On kuitenkin olemassa rajallinen määrä tutkimuksia vaikutusten arvioimiseksi probioottien hoidon mahahaavan johtuu ensisijaisesti haitalliset fysiologiset olosuhteet mahan joka vähentää selviytymistä ja mikro-organismien kasvua. Kummallista, yksi tutkimus [28] osoitti, että bakteerikolonisaatiota usein nopeasti haavauma induktion ja etenkin kolonisaatio tietyt bakteerit kuten Lactobacillus
voisi parantaa merkittävästi mahahaava paranemista. Muut tutkimukset ovat osoittaneet, että probioottisten bakteerien Lactobacillus
lajeja, Saccharomyces boulardii
, Escherichia coli
-kanta Nissle 1917 estävät tehokkaasti ja akuutin mahalaukun liittyvät vahingot etikkahappoa [ ,,,0],12], stressi [13], aspiriinia [29], etanoli [30], ibuprofeeni [31] ja indometasiini [32] aiheuttama mahahaavan. Ihmisillä aihetodisteisiin viittaa siihen, että säännöllinen nauttiminen Lactobacillus
sisältävä tuote suojaa eheyden mahalaukun limakalvon este vastaan ​​indometasiinia [32], kun taas toiset [15] ovat raportoineet, että vaikutus käyttämällä probioottisten bakteerien pitkin kolminkertainen hoito ei ole parempi kuin kolmoishoito hoitoon yksin mahahaavan. Tuoreessa raportissa [13] ehdotetaan uutta symbioottinen lähestymistapa hoitoon, jossa probiootti ( L. Acidophilus
) ja inkivääri uute samanaikaisesti ja yksilöllisesti koteloitu /liikkumattomiksi alginaatin kelluva helmiä vaikuttanut merkittävästi mahahaavan paranemista rotilla. Vaihtoehtoista lähestymistapaa on käyttää toinen määrä usean kannan probiootteja edistää haavojen paranemiseen kuten IBD: tutkimukset ovat osoittaneet, että moni kanta probiootit ovat tehokkaampia kuin monostrain probiootit [33]. Tuloksemme vahvistavat nämä havainnot käyttäen VSL, sekoitus kahdeksan bakteeri- lajeista, jotka oli erittäin tehokkaasti parantaa epiteelisolujen muuttoliike ja lisääntymistä, angiogeneesin, ja tuotanto rakeistuksen kudosten mikä nopeuttaa paranemista mahahaavan.

puuttumaan mekanismeja, joilla VSLkiihtyi mahahaava paranemisen me määrällisesti loukkaavaa luminaalisen ja /tai edistämällä puolustava tekijät. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että probiootit käyttää erilaisia ​​mekanismeja, mukaan lukien vakauttaminen limakalvon syöttösolujen degranulaatio [29], induktio slgA tuotannon [29], vähennys solujen apoptoosia solujen lisääntymistä suhde mahassa [11], lisätään transepiteelisen resistenssin [34 ] ja edistämällä angiogeneesiä [11] välittävän mahahaava paranemista. Tässä osoitamme, että VSLedistää mahahaavan paranemista tehostamalla kasvutekijöiden ekspression pääasiassa VEGF useita poimuja. VEGF on keskeinen angiogeeninen tekijä, joka stimuloi granulaatiokudoksen muodostumista ja uusi mikro alusten kautta angiogeneesin [24], joka puolestaan ​​kiihdyttää maha- ja pohjukaissuolihaava paranemista [35]. Tähän mennessä on vain yksi raportti [11], jotka osoittavat L. rhamnosus
GG voi säätää ylös VEGF-proteiinin aikana haavojen paranemiseen. Tutkimuksissamme olemme huomanneet, että 7. päivänä hoidon korkealla annoksella VSL, VEGF ekspressio lisääntyi 332-kertaiseksi verrattuna kontrollieläimiin. Tämä kasvu ei pidetty näkyvästi päivänä 14 hoidon, pääasiassa koska suurin osa haavat olivat jo parantuivat tuolloin VSL-käsiteltyjen rottien. Vertailun vuoksi alhaisen annoksen VSLkäsitellyillä eläimillä jatkui korkea VEGF: n ilmentymistä sekä 7. ja 14. päivänä kuin haava oli edelleen parantunut. Päättämisestä VSL-aiheuttama mahahaava paranemista käsittelemällä eläimiä anti-VEGF neutraloiva vasta-aine vahvistivat, että VSLlisätyn mahahaavan paranemisen kautta VEGF-välitteistä mekanismia. Havainto alennetusta haavojen paranemiseen hoidettuihin eläimiin VEGF neutraloivan vasta-aineen yksinään verrattuna kontrolleihin tukea myös rooli VEGF spontaaniin mahahaava parantuminen [35]. Tärkeää on, vaikka VEGF tiedetään jopa säännellä COX-2 peräisin PGE _{2 [36], löysimme marginaalinen muutoksia ilmaus COX-2 in VSLsaaneilla rotilla viittaa siihen, että VSLindusoi VEGF ilme eivät ole COX-2-välitteisten.}

Olemme myös havainneet, että kasvutekijät EGF ja TGF-β merkittävästi ylöspäin säännelty haavauma kudoksissa VSLhoidettujen rottien. TGF-β tiedetään vaikuttavan soluväliaineen joka muuttaa prosessi epiteelisolujen saattamisen päälle ja pois päältä, kun taas EGF edistää sekä epiteelin palautus- ja leviämisen ruuansulatuskanavassa [25]. Mielenkiintoista, VSLon todettu olevan tehokas ainoastaan ​​edistämään kasvutekijöitä eikä puolustava tekijät Muc5A ja COX2. On edelleen mahdollista, että VSLsaattaa vaikuttaa muihin puolustava tekijöitä ei analysoitu tässä tutkimuksessa. Olemme aiemmin osoittaneet, että VSLhoito parantaa paksusuolen Muc2 /MUC2 musiinieritystä rotan paksusuolessa ja ihmisen paksusuolen epiteelisoluissa. VSLhoitoon eläimillä ei myöskään merkittävästi vähentää ilmentymistä proinflammatoristen sytokiinien, IL-1β ja vähäisemmässä määrin TNF-α. Molemmat sytokiinien on ratkaiseva rooli muodostumista mahahaavan käynnistämällä varhaisen akuutti tulehdusreaktio [22]. Nämä havainnot vahvistavat tuoreessa raportissa, jossa arvioitiin 13 probioottikantojen on aspiriini aiheuttama mahahaava paranemista [29]. Tällä hetkellä emme tiedä mikä bakteerien lajia (t) tai yhdistelmät VSLprobiootti sekoitus vastaavat mahahaava paranemista. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että moni kanta probiootit (tarkemmin sanottuna, multi-suvun kannat) ovat tehokkaampia kuin mono-kanta probiootteja [33]. On myös mahdollista, että VSLseoksen ollessa neutraali liuos (eri pitoisuuksia VSLpH-arvo on 7,0) voivat vaikuttaa mahahapon paranemista laimentamalla happamuus mahanesteen. Kuitenkin tiedot esitetään tässä tutkimuksessa ei voi päätellä tästä, koska mahalaukun mehu happamuus ei mitattu. Kuitenkin, VSLolisi vain ottaa hapon laimentavaa eikä happoa neutraloiva vaikutus mahanesteessä, jos sellaisia ​​on. Todennäköisesti happo laimennusvaikutus VSLvain osaltaan toissijainen rooli vahvan cytoprotective toiminta osoittaa laaja ylössäätöä VEGF. Kuten VSLannosteltiin elävien solujen suspension, tämä muotoilu voisi on aiheuttanut sen suojaavia vaikutuksia elävien mikrobien, niiden aineenvaihduntatuotteita, soluseinäkomponentit ja /tai DNA-pitoisuus tai kaikkia edellä. Emme ole suorittanut kokeen verrata vaikutusta elävien mikrobien ja lämpöinaktivoitua probiootti seos arvioida tätä kysymystä, vaikka aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että lämmöllä tapettuja tai säteilyä inaktivoituja probioottibakteerit (annoksena samanlainen kuin elävien mikrobien) ei edistää haava paranemista [11], [12]. Edelleen, koska meillä ei arvioida angiogeneesiä, päätellä, että VSLon edistää mahahaavan paranemista angiogeneesiä vain spekuloitu perustuu VSLkyky aiheuttaa vankka säätelyn VEGF, mikä on ratkaisevan tärkeää angiogeneesissä [35].

Yhteenvetona tutkimuksemme osoittavat, että VSLprobiootti seos on erittäin tehokas augmenting mahahaava paranemista. Vaikutus on hallitseva suurilla pitoisuuksilla VSLseoksesta ja saadaan aikaan mekaanisesti stimuloimalla ilmentymistä ja eritystä angiogeneesin edistämisessä kasvutekijöitä, ensisijaisesti VEGF. Tutkimuksessa vahvistetaan mahdollisuus käyttää VSLprobiootti seos terapeuttisesti lisäämään mahahaavan paranemista.

tukeminen Information
Kuva S1.
Hoidon vaikutus erilaisten pitoisuuksien VSLetikkahapolla indusoitua mahahaavaa parantava rotilla. [A] Haava-alue (mm 2) piirretty eläimille etikkahapolla aiheuttama mahahaava päivänä 3, 7 ja 14 hoidon ajoneuvon (tummansininen), VSL1,5 × 10 9 bakteeria /eläin /päivä (vaaleankeltainen), VSL3,0 × 10 9 bakteeria /eläin /päivä (tummankeltainen), VSL6,0 × 10 9 bakteeria /eläin /päivä (vaaleanvihreä), VSL1,2 x 10 10 bakteeria /eläin /päivä (tummanvihreä), VSL2,4 × 10 10 bakteeria /eläin /päivä (vaaleansininen). Tiedot esitetään keskiarvoina ± SEM 6 eläimistä päivässä.

• PLoS ONE: In vivo Antioksidantit ja Haavaumalääkityksiä aktiivisuus Parkia speciosa Etanolista lehtiuutetta vastaan ​​etanolin aiheuttamia mahahaavan Rats
• PLoS ONE: Kaksisuuntainen välinen läpikuuluvuus stressin aiheuttama mahahaava ja masennus alle krooninen stressi