PLOS ONE: Expression dérégulée du SRC, LYN et CKB kinases par méthylation de l'ADN et de son rôle potentiel dans le cancer gastrique et envahissement Métastase

Résumé

kinases sont des modulateurs et des effecteurs de plusieurs cascades de signalisation cellulaire en aval et jouent un rôle clé dans le développement de la maladie néoplasique. Dans cette étude, nous avons cherché à évaluer la SRC, LYN et la protéine CKB et l'expression de l'ARNm, ainsi que leur méthylation du promoteur, dans le cancer gastrique. Nous avons trouvé une expression élevée de la SRC et LYN kinase ARNm et la protéine, mais une diminution des taux de CKB kinase, des altérations qui peuvent avoir un rôle dans la propagation et la métastase des tumeurs gastriques. Expression des trois kinases étudiés était également associée à l'expression oncogène MYC, un biomarqueur possible pour un cancer gastrique. Pour comprendre les mécanismes qui régulent l'expression de ces gènes, nous avons évalué la méthylation du promoteur de l'ADN des trois kinases. Nous avons constaté que réduit SRC
et LYN de la méthylation et l'augmentation de CKB de la méthylation a été associée à un cancer gastrique. La réduction de SRC
et LYN de la méthylation a été associée à une augmentation des niveaux d'ARNm et l'expression des protéines, ce qui suggère que méthylation de l'ADN est impliquée dans la régulation de l'expression de ces kinases. A l'inverse, réduit CKB de la méthylation a été observée dans les échantillons avec l'ARNm réduite et l'expression des protéines, ce qui suggère l'expression de CKB a été trouvé pour être seulement en partie régulée par méthylation de l'ADN. En outre, nous avons constaté que des modifications dans le motif de méthylation d'ADN des trois kinases ont également été étudiés associés à l'apparition du cancer gastrique, un cancer gastrique avancé, l'invasion tumorale plus profonde et la présence de métastases. Par conséquent, SRC, LYN et CKB expression ou méthylation de l'ADN pourrait être des marqueurs utiles pour prédire la progression de la tumeur et le ciblage dans les stratégies anti-cancer

Citation:. Mello AA, Leal MF, le juge Rey, Pinto GR, Lamarão LM, Monténégro RC, et al. (2015) Expression dérégulée du SRC, LYN et CKB kinases par méthylation de l'ADN et de son rôle potentiel dans le cancer gastrique envahissant et Métastases. PLoS ONE 10 (10): e0140492. doi: 10.1371 /journal.pone.0140492

Editeur: Jose G. Trevino, Université de Floride, ÉTATS-UNIS

Reçu: 27 mai 2015; Accepté le 25 Septembre 2015; Publié: 13 Octobre 2015

Droit d'auteur: © 2015 Mello et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et

financement:. Cette étude a été soutenue par Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq; subventionsǗ072 /2012-5 et 402283 /2013-9; bourse pour MCS et RRB), Fundação de Amparo à Pesquisa do Pará (FAPESPA; accorder #ICAAF 123/2014 à RRB) et Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP; subventionÈ9 /07145-9; bourse pour MFL) comme subventions et bourses de recherche. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique (GC) est le quatrième type de cancer le plus fréquent et la deuxième cause de mortalité par cancer dans le monde [1]. Le traitement de GC à un stade avancé reste difficile, et le pronostic est encore faible, en partie à cause de récidive locale, l'invasion tumorale et /ou de métastases. Le taux de survie relative à 5 ans d'ensemble est actuellement inférieure à 20% [2]. Une meilleure compréhension de la biologie de la progression de cette néoplasie est essentielle pour réduire le taux de mortalité avec le développement de nouvelles gestion des patients et des stratégies thérapeutiques.

Phosphotransferases, aussi connu comme kinases, sont des modulateurs et des effecteurs de plusieurs aval des cascades de signalisation cellulaire et jouent un rôle clé dans le développement de la maladie néoplasique [3]. À ce jour, plusieurs protéines kinases médicaments interagissant ont été enregistrés pour les essais cliniques [4]. Nous avons déjà effectué le dépistage pour identifier les protéines kinases exprimées dans GC en utilisant la capture Composé Spectrométrie de masse [5, 6] (S1 fichier), et 22 protéines kinases, y compris SRC, LYN et CKB, ont été détectés (S1 Table). Ces trois kinases ont été sélectionnés pour d'autres investigations (S1 Fig).

SRC a été le premier proto-oncogène découvert, et il joue un rôle central dans voies cellulaires de transduction. activité aberrante SRC est observée dans plusieurs cancers humains, y compris GC [09/07], et il peut être important pendant le développement et la progression tumorale [10, 11]. La fonction mitogene du SRC est, au moins en partie, à médiation par l'induction de MYC, un régulateur du cycle cellulaire et le facteur de transcription [12, 13]. Notre groupe a été décrit précédemment dans la régulation positive MYC GC humain et chez des primates non humains, la N-méthyl-nitrosourée traités [14-19]. Étant donné que l'activation de la SRC, ainsi que celle d'autres kinases, des effets pléiotropiques qui dépendent du type de cellule et du contexte [20], il est toujours important de comprendre les relations possibles entre les kinases et l'expression de Myc dans la cancérogenèse gastrique et le mécanisme moléculaire impliqués dans leur régulation.

LYN est un autre membre de la famille des kinases SRC, et le gène LYN
est situé sur le chromosome 8q13. Notre groupe précédemment signalé la présence de gains du chromosome 8 (sur lequel le MYC
gène est également situé) dans les cas de GC du nord du Brésil [16, 21-23] et dans toutes les lignées de cellules GC établies à partir de néoplasies en cette population [24, 25]. Par conséquent, ce chromosome peuvent contenir des gènes importants impliqués dans la carcinogenèse gastrique. À notre connaissance, aucune étude précédente a étudié le rôle de LYN et de sa réglementation en GC. Cependant, LYN surexpression a été rapporté dans plusieurs cancers [26-32]. En outre, la régulation de la LYN
par méthylation de l'ADN a été démontré par le cancer colorectal et le sarcome d'Ewing [33, 34], et LYN de la méthylation a été observée dans certains hématopoïétiques et non hématopoïétiques des lignées de cellules [35]. Méthylation de l'ADN est une modification moléculaire de l'ADN qui est étroitement associée à la fonction des gènes et la fonction des gènes spécifiques du type cellulaire [36]. En outre, la méthylation d'ADN peut être un marqueur biologique robuste, car il est beaucoup plus stable que l'ARN ou d'une protéine et est donc une cible prometteuse pour le développement de nouvelles approches pour le diagnostic et le pronostic du cancer [36].

CKB est l'un des deux isoformes cytosolique de la créatine kinase et peuvent participer à des processus métaboliques impliquant la glycolyse dans les cellules non-musculaires [37]. Contrairement aux cellules normales, qui génèrent principalement l'énergie par l'intermédiaire de la phosphorylation oxydative, la plupart des cellules cancéreuses préfèrent glycolyse aérobie, ce qui est connu comme l'effet Warburg [38]. Fait intéressant, l'oncogène MYC apparaît pour activer plusieurs transporteurs de glucose et d'enzymes glycolytiques, contribuant ainsi à l'effet Warburg [39]. Notre étude protéomique précédente a révélé que plusieurs protéines impliquées dans les processus de production d'énergie ont été déréglementés dans des échantillons de GC et a renforcé l'effet Warburg dans cette néoplasie [40]. Le rôle de CKB dans GC reste mal comprise: certaines études transcriptomiques ont rapporté la surexpression de CKB
dans des échantillons de GC [41, 42], alors que l'autre a montré CKB de la régulation négative [43]. En outre, comme pour le LYN
gène CKB de la méthylation a été décrit précédemment dans hématologique et des lignées de cellules cancéreuses solides, y compris des lignées cellulaires de GC [44]. La méthylation de CKB
semble être liée à son niveau réduit d'expression; Cependant, une enquête plus approfondie est encore nécessaire de comprendre la régulation de la CKB
par des modifications épigénétiques
.

Par conséquent, nous avons d'abord cherché à évaluer l'expression de l'ARNm et de protéines de SRC, LYN et CKB dans un grand ensemble d'échantillons de GC. Ensuite, nous avons évalué si ces gènes peuvent être réglementés par méthylation de l'ADN dans la cancérogenèse gastrique. En outre, nous avons étudié l'association possible entre l'expression de la kinase ou la méthylation et des variables cliniques ainsi que l'expression de MYC et la méthylation.

Matériel et

Des échantillons de tissus
expression

Kinase de méthodes et modèles de méthylation ont été évalués dans 138 paires d'échantillons GC et leurs échantillons correspondants de tissus gastriques non néoplasiques obtenues à partir de patients ayant subi une gastrectomie dans le nord du Brésil. Tous les patients avaient des antécédents négatifs de l'exposition à la chimiothérapie ou la radiothérapie avant la chirurgie, et il n'y avait pas de co-occurrence d'autres cancers diagnostiqués. Cette étude a été approuvée par le comité d'éthique de João Barros Hôpital universitaire Barreto de (Protocole N ° 316737). Consentement éclairé écrit avec l'approbation du comité d'éthique a été obtenue à partir de tous les patients avant le prélèvement des échantillons.

Une partie de chaque échantillon de la tumeur disséqués était fixé au formol et inclus en paraffine (FFPE). Les sections de tissu FFPE ont été colorées à l'hématoxyline-éosine pour évaluation histologique ou utilisés pour l'immunohistochimie (IHC) analyse. Des portions supplémentaires de chaque tumeur et des spécimens de tissus non néoplasiques par paires ont été soumis à une congélation dans l'azote liquide et stockés à -80 ° C jusqu'à la purification des protéines et des acides nucléiques.

Tous les échantillons ont été classés selon Laurén [45 ] et les tumeurs ont été organisées en fonction des critères de stadification TNM [46]. La présence de Helicobacter pylori
, classe I carcinogène dans les échantillons gastriques a été détecté par le test d'uréase rapide, et son facteur de virulence cytotoxicité gène associé A (gène CagA) est détectable par PCR en utilisant l'ADN purifié en même temps que les protéines et l'ARNm, comme effectué précédemment par notre groupe [47]. le virus d'Epstein-Barr (EBV) a été détectée par hybridation d'ARN in situ [47].

49 de ces paires d'échantillons néoplasiques et non-néoplasiques, nous avons évalué la réactivité immunologique MYC, l'expression et l'état de méthylation des données d'ARNm précédemment publié par notre groupe [18].

la protéine, l'ARNm et l'ADN purification

protéine totale, l'ARNm et l'ADN a été isolé à partir à la fois des échantillons de tissus gastriques à l'aide du /ARN Kit AllPrep ADN /protéine ( Qiagen, Allemagne) selon les instructions du fabricant. Le culot protéique a été dissous dans un tampon contenant 7 M d'urée 2 M thiourée, 4% de CHAPS, 50 mM de DTT, 1% Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich, USA) et 0,5% pour chaque cocktail Phosphatase Inhibitor 1 et 2 (Sigma ALDRICH, USA), comme effectué précédemment par notre groupe [48]. Les concentrations en protéines ont été déterminées par la méthode de Bradford (Sigma-Aldrich, USA). La concentration et la qualité de l'ARN ont été déterminées à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop (Kisker, Allemagne) et 1% de gels d'agarose, respectivement. Les échantillons ont été stockés à -80 ° C jusqu'à utilisation.

Analyse de la protéine immunoréactivité

coupes de tissu tumoral (3 ou 4 mm d'épaisseur) ont été déparaffinées dans du xylene et réhydratées dans une série graduée d'éthanol. Après la récupération de l'épitope induite par la chaleur, les coupes de tissus ont été incubés avec des anticorps monoclonaux de souris primaire contre SRC (dilution 1: 400; clone 28, Life Technologies, USA), LYN (dilution 1: 400; clone C13F9; Life Technologies, États-Unis) ou CKB (dilution 1: 250; HPA001254, Santa Cruz Biotechnology, États-Unis). Un kit universel anticorps secondaire conjugué à la peroxydase (système LSAB, DakoCytomation, États-Unis) a été utilisé pour la détection. Nous avons utilisé 3,30-diamino-benzidine /H _{2O 2 (DakoCytomation, Danemark) comme chromogène et hématoxyline comme contre-coloration. Un échantillon de protéine immunoréactivité positive a été définie comme ayant 10% ou plus de cellules néoplasiques qui étaient positifs pour la protéine.}

Analyse L'expression des protéines

analyse Western blot a été réalisée comme décrit précédemment par notre groupe [49]. teneur réduite en protéines (25 pg) provenant de chaque échantillon a été séparé par 12,5% homogène par SDS-PAGE et électro-transférées sur une membrane de PVDF (Hybond-P, GE Healthcare, États-Unis). La membrane de PVDF a été bloquée avec une solution saline tamponnée au phosphate contenant 0,1% de Tween 20 et 5% de lait à faible teneur en matière grasse et on fait incuber pendant une nuit à 4 ° C avec les anticorps correspondants primaires: l'anti-SRC (dilution 1: 1000; clone 28, Life Technologies, USA), anti-LYN (dilution 1: 1000; clone C13F9; Life Technologies, USA), anti-CKB (dilution 1: 400; HPA001254, Santa Cruz Biotechnology, USA), et anti-ACTB (dilution 1: 250; Ac -15, Life Technologies, États-Unis). Après lavage intensif, un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase a été ajouté pendant 1 h à température ambiante. Les bandes immunoréactives ont été visualisées en utilisant le blot réactif Luminol ouest, et les images ont été acquises à l'aide d'un système ImageQuant 350 d'image numérique (GE Healthcare, Suède). ACTB a été utilisé comme témoin de référence de chargement.

expression de l'ARNm analyse

Tout d'abord, l'ARN a été une transcription inverse en utilisant la haute capacité de kit Archive ADNc selon le protocole du fabricant (Life Technologies, États-Unis) . L'ADN complémentaire a été ensuite amplifié par inverse en temps réel la transcription PCR quantitative (RT-qPCR) en utilisant des sondes TaqMan achetées telles Assays sur demande Produits pour Gene Expression (Life Technologies, Etats-Unis) et un instrument PCR 7500 rapide en temps réel (Life Technologies , ETATS-UNIS). Le gène GAPDH de a été sélectionné comme un contrôle interne pour l'entrée de l'ARN et transcription inverse efficacité. Tous les RT-RCQP ont été réalisées en triple pour les deux gènes cibles ( SRC
: Hs01082246_m1; LYN
: Hs00176719_m1; CKB
: Hs00176484_m1) et le contrôle interne ( GAPDH
. NM_002046.3)

La quantification relative de l'expression du gène a été calculée selon la Livak et Schmittgen [50]. L'échantillon de contrôle correspondant a été désigné comme un calibrateur de chaque tumeur.

Analyse méthylation de l'ADN

Le modèle de méthylation et la fréquence des gènes de kinases ont été évalués par spécifique de la méthylation PCR (MSP) [51]. Le kit EZ méthylation de l'ADN-Lightning ™ (Zymo Research, USA) a été utilisé pour modifier le ADNg par traitement au bisulfite, la conversion des cytosines non méthylées en uraciles et en laissant cytosines méthylés inchangé. des amorces spécifiques pour les promoteurs de gènes sont décrits dans le tableau 1.

Les réactions de PCR ont été réalisées avec 0,1 pmol /L des dNTP, 2 pmol /L de MgCl _{2, 0,5 pmol d'amorces, 1,25 U d'ADN polymerase Taq, et 100 ng d'ADN au bisulfite modifié. Après dénaturation initiale de 5 min à 94 ° C, 40 cycles à 94 ° C pendant 45 s, la température de recuit (tableau 1) pendant 45 s et 72 ° C pendant 30 secondes ont été effectués, suivis par une extension finale pendant 5 min à 72 ° C. Les produits de PCR ont été directement chargés sur 3% des gels d'agarose et électrophorèse. Le gel a été coloré avec SYBR ^{® Safe DNA Gel Stain (Life Technologies, USA) et directement visualisés sous illumination UV. En tant que contrôle positif pour toutes les réactions MSP, un échantillon ADNg a été complètement méthylé en utilisant CpG méthylase (SssI, New England Biolabs, USA) en suivant les instructions du fabricant. En outre, des amorces pour la détection de la séquence de type sauvage ont été utilisés pour contrôler la conversion complète de l'ADN obtenu dans la réaction bisulfite}}

Les échantillons ont été stratifiés comme suit:. 1) un échantillon a été défini comme hypométhylés quand une amplification positif produit a été détecté uniquement dans la PCR avec des amorces spécifiques pour les séquences non méthylés; 2) un échantillon a été définie comme hyperméthylé lorsque l'amplification positive a été détectée seulement dans la PCR avec des amorces spécifiques pour les séquences méthylées; 3) un échantillon a été défini comme étant partiellement méthylée lorsque l'amplification positive a été détectée dans la PCR avec les deux ensembles d'amorces.

La spécificité de Les amorces et les résultats MSP ont été confirmés en utilisant une PCR (BSP) approche de séquençage bisulfite [52] . BSP a également été utilisé pour évaluer le pourcentage de méthylation. Les amorces et les températures de anneling BSP sont décrites dans le tableau 1. Après l'amplification, les fragments ont été purifiés en utilisant le gel NucleoSpin et PCR Kit de nettoyage (Macherey-Nagel, Allemagne) et ligaturé dans le pGEM T-easy Vector (Promega, Allemagne) et clone dans compétent E
. coli
cellules JM109. Après un temps d'incubation, des colonies blanches ont été choisies pour la PCR avec l'avant M13 (5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ') et inverse M13 (5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3') des amorces [53]. Après dénaturation initiale pendant 3 min à 94 ° C, l'amplification par PCR consistait en 35 cycles à 94 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 90 secondes ont été effectués, suivis par une extension finale pour 5 min à 72 ° C. Les produits de PCR ont été visualisés sur gel d'agarose. Six clones ont été sélectionnés pour la purification et séquencées dans un séquenceur automatique ABI310 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Toutes les séquences ont été alignées avec BioEdit v7.0.5 [54], et les analyses de méthylation ont été réalisées avec le logiciel Analyzer BiQ [55]. Le pourcentage de méthylation pour chaque échantillon a été calculé en divisant le nombre de CpG méthylés par le nombre total de CpG séquencés (CpG dans tous les six clones).

analyses statistiques

Les données sont présentées comme la fréquence, la médiane et interquartile (IQR). Le test de Shapiro-Wilk a été utilisé pour évaluer la distribution de l'âge, l'ARNm, l'expression des protéines et le pourcentage de données de méthylation et de déterminer le test suivant approprié pour les comparaisons statistiques. Le test de Mann-Whitney a été utilisé pour étudier les associations possibles entre l'ARNm de kinase ou l'expression de la protéine et les variables catégorielles, comme immunoréactivité, modèle de méthylation et les caractéristiques clinico. Le test de Mann-Whitney a été utilisé pour étudier les associations possibles entre le pourcentage de méthylation et immunoréactivité et des caractéristiques clinico. test de Wilcoxon a été utilisé pour comparer le pourcentage de méthylation entre les paires d'échantillons néoplasiques et non néoplasiques. Une association entre les variables catégorielles a été analysée en utilisant le chi carré (χ ^{2) test. Un test de corrélation de Spearman a été utilisé pour évaluer la corrélation possible entre l'ARNm et l'expression des protéines, ainsi que la méthylation du promoteur. Une valeur p inférieure à 0,05 a été considérée comme significative. ajustement de Bonferroni de la p-valeur a été appliquée lorsque plusieurs comparaisons ont été effectuées, avec le niveau alpha étant divisé par le nombre de comparaisons.}

expression Kinase

Résultats dans les tumeurs gastriques

cellules gastriques non atypiques ne présentaient pas SRC ou LYN immunoréactivité (figure 1A et 1C). Cependant, SRC immunoréactivité n'a été observée dans les cellules dysplasiques. Membrane cellulaire et immunoréactivité cytoplasmique pour la SRC et LYN a été détectée dans les cellules néoplasiques (figure 1B et 1D) et LYN ont également présenté une immunoréactivité nucléique. CKB immunoréactivité a été détectée dans le cytoplasme ou dans la membrane cellulaire dans les cellules gastriques non néoplasiques (figure 1E). En revanche, les cellules GC ne présentaient CKB immunoréactivité (figure 1F).

SRC LYN et CKB immunoréactivité a été détectée dans 72 (52,2%) 66 (47,8%) et 0 (0%) de la tumeur échantillons. SRC et LYN immunoréactivité étaient associés à des plus élevés d'ARNm et de protéines niveaux dans des échantillons de GC (p < 0,001 pour toutes les comparaisons, test de Mann-Whitney, la figure 2A, 2C, 2E et 2G). Les niveaux de SRC protéine et d'ARNm ont été augmentées d'au moins 1,5 fois (au moins une augmentation de 50% de l'expression) dans 67 (48,6%) et 80 (58%), respectivement, des échantillons GC par rapport à leur gastrique non néoplasique apparié échantillons (figure 2B, 2D et 2K). En outre, le taux d'ARNm de la protéine et LYN ont été augmentées d'au moins 1,5 fois dans 36 (26,1%) et 72 (52,2%) des échantillons de GC, respectivement (figure 2F, 2H et 2K). A l'inverse, la régulation négative de la protéine et de l'ARNm CKB (au moins 50% de diminution de l'expression) a été détectée dans 104 (75,4%) et 49 (35,5%) des échantillons de GC, respectivement (figure 2I, 2J et 2K). Une corrélation forte et directe a été observée entre l'ARNm et l'expression des protéines pour SRC (p < 0,001, ρ = 0,856, Spearman test de corrélation), LYN (p < 0,001, ρ = 0,762) et CKB (p < 0,001, ρ = . 0,819)

l'immunoréactivité du SRC a été associée à l'immunoréactivité de LYN (p < 0,001, χ ^{Test 2), avec 52 (37,7%) des échantillons de GC présentant une immunoréactivité pour les deux protéines. En outre, une corrélation directe a été observée entre la protéine SRC et LYN (p < 0,001, ρ = 0,556) et de l'ARNm (p < 0,001, ρ = 0,779) expression. Les niveaux de protéine CKB et l'expression de l'ARNm étaient inversement corrélées avec SRC (p < 0,001, ρ = -0,734; p < 0,001, ρ = -0,806, respectivement) et LYN (p < 0,001, ρ = -0,643; p <. 0,001, ρ = -0,703, respectivement)}

le tableau 2 montre les résultats pour SRC, LYN et d'expression de CKB et les caractéristiques clinico. Les tumeurs des patients atteints de GC à début tardif présentent SRC significativement plus élevée et la protéine LYN (par IHC et transfert de Western) et de l'ARNm (par RT-PCR quantitative) d'expression, ainsi que la réduction CKB expression de la protéine par transfert de Western, par rapport à l'apparition précoce CG des échantillons (p < 0,05 pour toutes les comparaisons; tableau 2). protéine accrue et expression de l'ARNm de la SRC et LYN et l'expression de CKB réduite étaient associés à un stade avancé, l'invasion tumorale plus profonde, et la présence de ganglions lymphatiques et les métastases à distance (p < 0,05 pour toutes les comparaisons, le tableau 2)
<. p> Une augmentation significative graduelle de la protéine Src (par western blot), et l'expression d'ARNm a été observée correspondant à la phase de la tumeur (p < 0,008, pour la plupart des comparaisons, test de Mann-Whitney, suivi par la correction de Bonferroni; la figure 3A et 3B) . En revanche, une diminution significative CKB progressive dans les protéines et l'expression d'ARNm a été observée correspondant à la phase de la tumeur (p < 0,008, pour la plupart des comparaisons, la figure 3G et 3H). En ce qui concerne l'expression LYN, on n'a pas observé de différence significative entre les stades I et II ou entre les stades III et IV. Cependant, les stades I et II étaient significativement différentes de stades III et IV (p < 0,008, pour ces comparaisons, la figure 3D et 3E).

Kinase gènes modèles de méthylation dans

Table des échantillons gastriques la figure 3 représente le schéma de méthylation des protéines kinases étudiées dans des échantillons gastriques néoplasiques et non néoplasiques par MSP. Environ 60% et 30% des échantillons GC présenté une amplification positive avec seulement le jeu d'amorces non méthylé (échantillons hypométhylée) pour le SRC
et LYN de gènes, respectivement (figure 4A et 4B). L'hypométhylation de ces gènes n'a pas été observée dans aucun échantillon non néoplasique. Par conséquent, la fréquence de SRC
et LYN de l'hypométhylation était significativement plus élevée dans le GC que dans les échantillons gastriques non néoplasiques (p < 0,001 pour toutes les comparaisons; χ ^{Test 2 suivi par des corrections de Bonferroni).}

l'analyse BSP a confirmé l'analyse MSP. Par BSP, 82 (59,4%) des échantillons néoplasiques et 0 (0%) des échantillons non-néoplasiques présenté une séquence clonée sans CpG méthylation dans SRC
promoteur. En outre, 4 (2,89%) et 1 (0,72%) des échantillons néoplasiques et non néoplasiques ont présenté une séquence clonée sans CpG méthylation dans LYN
promoteur, respectivement. Par BSP, le pourcentage de SRC
[0,135 (0,31) par rapport à
0,563 (0,23); p < 0,001] et LYN
[0,238 (0,40) par rapport à
0,7063 (0,26); p < 0,001] méthylation était plus faible dans les échantillons néoplasiques que dans les échantillons non néoplasiques (figure 5A et 5B).

Le SRC
et Les profils de méthylation de LYN du néoplasique et non échantillons -neoplastic tandis trouvés associés (p < 0,001, pour les deux analyses; χ ^{2 test). Nous avons observé que 70/81 (86,4%) des tumeurs avec hypométhylée
SRC ont présenté une méthylation partielle de ce gène dans l'échantillon non néoplasique correspondant. En outre, nous avons constaté que 37/41 (90,24%) des tumeurs avec hypométhylée LYN
présenté méthylation partielle de ce gène dans l'échantillon non-néoplasique appariés. SRC
et méthylation partielle de LYN dans des échantillons non néoplasiques ont été plus fréquemment observés chez les individus présentant des échantillons de tumeur avec l'hypométhylation de ce gène par rapport aux tumeurs avec la méthylation partielle (p < 0,001, pour les deux analyses) ou hypermethylation (p < 0,001, pour les deux analyses). En outre, partiellement méthylée LYN
dans les échantillons non néoplasiques a également été détectée plus souvent chez des individus présentant des échantillons de tumeur avec une méthylation partielle de ce gène par rapport aux tumeurs avec hyperméthylation (p = 0,004). Par BSP, nous avons également observé que le pourcentage de SRC
(p < 0,001, ρ = 0,6902; la figure 5D) et (p <
LYN 0,001, ρ = 0,739; Fig 5E ) méthylation d'échantillons néoplasiques et non néoplasiques ont été corrélées.}

hypométhylation partielle et de CKB a été observée dans les deux échantillons néoplasiques et non néoplasiques. Cependant, 48 (39%) des échantillons de GC présenté CKB de l'hyperméthylation (figure 4C), qui n'a pas de détecter dans les échantillons non néoplasiques. En outre, la fréquence de échantillons -hypermethylated de CKB était significativement plus élevée chez néoplasique par rapport à des échantillons gastriques non néoplasiques (p < 0,001), et méthylation partielle de CKB a également été significativement plus fréquentes chez GC que dans les échantillons non néoplasiques (p < 0,001). Par BSP, le pourcentage de CKB de la méthylation était plus élevée dans les échantillons néoplasiques que dans les échantillons non néoplasiques [0,511 (0,42) contre
0,133 (0,12); p < 0,001; La figure 5C]. séquences clonées sans méthylation CpG a été détectée dans 4 (2,89%) et 0 (0%) des échantillons néoplasiques et non-néoplasiques, respectivement.

Le schéma de méthylation de CKB du néoplasiques et non échantillons -neoplastic semblaient être associés (p = 0,014, par χ ^{Test 2). Une analyse de 2x2 à l'aide du χ test 2 a révélé que les paires dans lesquelles des échantillons de tumeur ont présenté des hyperméthylés CKB hôtels et les échantillons non néoplasiques appariés présenté hypométhylation de ce gène ont été plus fréquents que les paires de tumeurs avec une hyperméthylation et appariés échantillons non néoplasiques avec méthylation partielle (p = 0,0381), mais ce résultat n'a pas atteint la signification statistique si l'ajustement Bonferroni a été appliquée (α ajusté = 0,05 /3 = 0,0167). Cependant, par BSP, nous avons observé que le pourcentage de CKB de la méthylation des échantillons néoplasiques et non néoplasiques étaient inversement corrélées (p < 0,001, ρ = -0.375; Fig 5F).}

Une corrélation directe a été observée entre le SRC
et les modèles de méthylation de LYN dans les échantillons non néoplasiques (p < 0,001, ρ = 0.627). En outre, une corrélation inverse a été détectée entre SRC
et CKB
(p < 0,001, ρ = -0,467) et LYN
et CKB
(p < 0,001, ρ = -0,359) méthylation. Cependant, dans des échantillons de GC, une corrélation directe a été observée chez le pourcentage de méthylation des trois kinases étudiées: SRC
et (p < 0,001, ρ = 0,840)
LYN; SRC
et CKB
(p < 0,001, ρ = 0,684); LYN
et CKB
(p < 0,001, ρ = 0,663).

Régulation de méthylation de kinases

Pour élucider la régulation épigénétique de l'étudié gènes, nous avons évalué l'association possible entre la méthylation du promoteur et de la protéine immunoréactivité et l'ARNm et l'expression des protéines (par western blot)

Nous avons observé que les deux l'ARNm et l'expression des protéines de SRC (p. < 0,001, ρ = -0,834; p < 0,001, ρ = -0,718; respectivement; la figure 6A et 6B) et LYN (p < 0,001, ρ = -0,792; p < 0,001, ρ = -0,654; respectivement; la figure 6D et 6E) était inversement corrélée au pourcentage de méthylation du promoteur. En outre, les tumeurs avec SRC [0,062 (0,08) par rapport à
0,375 (0,33); p < 0,001; test de Mann-Whitney; Fig 6C] et LYN [0,127 (0,11) par rapport à
0,500 (0,39); p < 0,001; Fig 6F] immunoréactivité présenté plus faible pourcentage de méthylation que la tumeur manque cette protéine immunoréactivité

En ce qui concerne la régulation de CKB, une corrélation directe a été observée entre le pourcentage de la méthylation et la CKB ARNm et l'expression des protéines (p <. 0,001, ρ = 0,684; p < 0,001, ρ = 0,686; respectivement; la figure 6G et 6H). Fait intéressant, l'augmentation de CKB protéines et expression de l'ARNm a été observée dans les tumeurs avec un hypométhylée CKB de promoteur par rapport aux tumeurs avec un promoteur partiellement méthylée (p = 0,015, p = 0,008, respectivement; test de Mann-Whitney suivie par des corrections de Bonferroni; S1 Fig). Cependant, les tumeurs avec un hyperméthylé promoteur CKB de a également présenté une augmentation des protéines et l'expression de l'ARNm par rapport aux tumeurs avec un promoteur partiellement méthylée (p < 0,001 pour les deux comparaisons).

méthylation des promoteurs de kinases et les variables clinicopathologiques

Dans la muqueuse gastrique non néoplasique, le pourcentage de SRC
(p = 0,010, ρ = -0,218) et (p
LYN = 0,003, ρ = -0,248) méthylation a été (faiblement) inversement corrélée à l'âge des patients à la chirurgie, mais aucune autre association n'a été observée entre le pourcentage de la méthylation et le sexe, H
. pylori
et l'infection EBV dans les échantillons non néoplasiques (p > 0,05; test de Mann-Whitney).

Le tableau 4 montre les associations entre le pourcentage de méthylation dans des échantillons de GC et les caractéristiques clinico . Dans les échantillons néoplasiques, le pourcentage de SRC
(p = 0,002, ρ = -0,267), (p = 0,014, ρ = -0,208) de LYN et CKB
(p = 0,024, ρ = -0,192) méthylation a été (faiblement) inversement corrélée à l'âge des patients à la chirurgie. De plus, le pourcentage de SRC
(p = 0,002), (p = 0,015) de LYN et CKB
(p = 0,024) méthylation était plus faible dans d'apparition tardive que dans les échantillons GC début précoce. De plus, nous avons observé que la méthylation SRC était plus faible chez les non-cardia GC par rapport à Cardia GC (p = 0,028).

pourcentage réduit de SRC
, LYN
et CKB de la méthylation ont été associés à un stade avancé, l'invasion tumorale plus profonde, et la présence de ganglions lymphatiques et les métastases à distance (p < 0,05 pour toutes les comparaisons, le tableau 4). La comparaison des SRC
et le modèle de méthylation de LYN par MSP et les caractéristiques clinico présenté des résultats similaires (S2 tableau). Cependant, la méthylation partielle de CKB
par MSP a également été plus fréquemment trouvé que hyperméthylation dans les tumeurs T3 /T4 (p = 0,008; S2 Tableau). méthylation partielle de CKB était également plus fréquente que hypermethylation (p < 0,001) et l'hypométhylation (p = 0,009; S2 Tableau). Dans les tumeurs des individus avec des métastases à distance par rapport aux tumeurs des individus sans métastases à distance

Une diminution progressive du pourcentage de SRC
et LYN de la méthylation a été observée correspondant au stade de la tumeur (p < 0,008, pour la plupart des comparaisons, test de Mann-Whitney suivie d'une correction de Bonferroni; la figure 3C et 3F). En ce qui concerne CKB de la méthylation, 12 sur 14 (85,7%) des échantillons de GC dans le stade I présenté 73,3% de la méthylation. Le pourcentage de CKB de la méthylation était plus élevé dans la phase I que dans les stades II, III et IV (p < 0,008, pour la plupart de ces comparaisons, la figure 3I). A l'inverse, le pourcentage de CKB de la méthylation a été significativement réduite dans le stade IV par rapport aux autres étages (p < 0.008 pour ces comparaisons, la figure 3I).

Kinases et les relations MYC

Nous avons examiné MYC immunoréactivité, expression de l'ARNm et des données d'état de méthylation pour un ensemble de 49 des paires d'échantillons étudiés néoplasiques et non néoplasiques. Yang et al. Li et al.

• PLOS ONE: Importance clinique de miR-137 Expression chez les patients atteints de cancer gastrique Après Radical Gastrectomy
• PLOS ONE: Association exclusive de p53 Mutation avec Super-High méthylation de gènes suppresseurs de tumeurs dans la voie de p53 dans un unique cancer gastrique Phenotype