PLOS ONE: Helicobacter pylori Favorise épithéliale-mésenchymateuses Transition dans le cancer gastrique par régulation négative de Programmed Protein Cell Décès 4 (PDCD4)

Résumé

Helicobacter pylori
, une bactérie Gram-négatif microaérophile trouvé dans l'estomac, est supposé être associé à la carcinogenèse, l'invasion et les métastases dans les maladies digestives. gène Une cytotoxine-associé (CagA) est une protéine oncogénique de H.
pylori qui est codé par un îlot de pathogénicité Cag liée au développement d'un cancer gastrique. La transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) est le principal événement biologique dans l'invasion ou la métastase des cellules épithéliales. H. pylori
peut promouvoir EMT dans des lignées cellulaires de cancer gastriques humaines, mais les mécanismes spécifiques sont encore obscures. Nous avons exploré le mécanisme moléculaire sous-jacente de EMT induite par H. pylori
CagA dans le cancer gastrique. Dans notre article, nous avons détecté des échantillons de cancer de l'estomac et des échantillons non cancéreux adjacents par immunohistochimie et on a trouvé une expression accrue de la protéine régulatrice TWIST1 liée EMT et la vimentine marqueur mésenchymateux dans des tissus cancéreux, tandis que la cellule programmée facteur de mort 4 (PDCD4) et l'épithélium marqueur E-cadhérine expression a diminué dans les échantillons de cancer. Ces modifications ont été associées à degré de malignité du tissu. En outre, les niveaux PDCD4 et TWIST1 étaient liés. Dans les cellules cancéreuses gastriques co-cultivés avec l'expression CagA plasmide, CagA activé TWIST1 et l'expression de la vimentine, et inhibe l'expression E-cadhérine par régulation négative PDCD4. CagA favorise ainsi la mobilité des cellules du cancer de l'estomac en régulant PDCD4. Ainsi, H. pylori
CagA EMT induite dans les cellules de cancer gastrique, ce qui révèle une nouvelle voie de signalisation de l'EMT dans des lignées cellulaires de cancer gastrique

Citation:. Yu H, Zeng J, Liang X, Wang W, Zhou Y, Sun Y, et al. (2014) Helicobacter pylori
Favorise la transition épithéliale-mésenchymateuses dans le cancer gastrique par régulation négative de mort cellulaire programmée Protein 4 (PDCD4). PLoS ONE 9 (8): e105306. doi: 10.1371 /journal.pone.0105306

Editeur: Rajeev Samant, Université d'Alabama à Birmingham, États-Unis d'Amérique

Reçu 12 Février 2014; Accepté le 21 Juillet 2014; Publié le 21 Août, 2014

Droit d'auteur: © 2014 Yu et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenu par le Programme national de recherche fondamentale de la Chine (pas 973 Programme 2012CB911202.), la national Natural science Foundation de Chine (n °: 81171536, 81371781, 81272654, 81372680 et 81170514), le Programme de développement de la technologie du Shandong (sciences médicales et aucun . 2013WS0209) et la Fondation indépendante de l'innovation de l'Université du Shandong (. 2012TS106 pas). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

Helicobacter pylori
( H. pylori
) est une bactérie à Gram négatif en forme d'hélice associée à des maladies digestives, y compris gastrite chronique, ulcère gastro-duodénal, le cancer gastrique, et la muqueuse associée à un lymphome du tissu lymphoïde. H. pylori
a été classé comme cancérogène par l'Organisation mondiale de la Santé et l'Agence internationale pour la recherche sur le cancer (OMS /CIRC) en 1994 [1], [2].

H. Les gènes pylori de posséder une cytotoxine associée gène A (CagA) îlot de pathogénicité qui code pour la majeure CagA de protéines de virulence et d'un système de type IV de sécrétion (T4SS). CagA est livré aux cellules hôtes par T4SS et induit la formation du cancer et de la progression [3]. H. pylori
peut déréglementer la prolifération cellulaire, une incidence sur la voie apoptotique normale, la forme des cellules d'influence, d'abolir l'activité jonctionnelle et faciliter une transition (EMT) épithéliale-mésenchymateuse phénotype après translocation dans la cellule hôte [4], [5]. Le H. protéine effectrice de CagA de pylori affecte la plupart de ces voies. In vivo
expériences ont montré que l'expression transgénique de CagA pourrait causer de multiples tumeurs malignes chez les souris, y compris l'hyperplasie épithéliale gastrique, la leucémie myéloïde et lymphomes à cellules B, ou de polypes gastriques et adénocarcinomes de l'estomac et l'intestin grêle [6]. Cependant, le mécanisme moléculaire de H. pylori
CagA interagissant sur les cellules hôtes ne sait pas encore.

L'EMT a d'abord été reconnu comme une caractéristique de l'embryogenèse, un processus vital pour la morphogenèse au cours du développement embryonnaire et le cœur. Toutefois, il contribue également à une fibrose tissulaire, l'invasion tumorale et les métastases. EMT est caractérisée par plusieurs traits distincts, tels que la perte d'adhérence cellulaire, une augmentation de la mobilité cellulaire, la résistance à l'apoptose, ainsi que certaines propriétés des cellules souches. Avec EMT, marqueurs épithéliaux tels que E-cadhérine montrent une diminution des marqueurs d'expression et mésenchymateuses telles que vimentine montrent une expression accrue. D'autres molécules régulatrices telles que ESCARGOT, TWIST et SLUG spectacle a changé d'expression [7], [8], [9]. voies oncogéniques qui peuvent induire l'EMT comprennent la transformation β du facteur de croissance (TGF-ß), Src, Ets, Ras, Wnt /β-caténine, Notch, facteur nucléaire-kB et intégrine [10], [11], [12].

l'infection par le facteur pathogène humain H. pylori
est supposé conduire à EMT, l'invasion ou des métastases du cancer gastrique. Par exemple, la régulation positive de la matrice métalloprotéinase 7 par pathogène H. pylori
dépend en partie de la gastrine et peut avoir un rôle dans le développement du cancer gastrique, éventuellement par l'EGE, par des niveaux induisant indirectement solubles dans endothelial growth factor liaison à l'héparine [13]. H. pylori
CagA est impliqué dans l'invasion des cellules tumorales en déréglementant le récepteur c-met de signalisation [14]. En outre, CagA pourrait augmenter l'activation de la voie de signalisation /β-caténine en perturbant la stabilisation du complexe E-cadhérine-β-caténine. Ainsi, CagA joue un rôle vital dans le développement de la métaplasie intestinale [15]. En outre, l'analyse de puces à ADN a suggéré que le statut de phosphorylation de CagA peut affecter l'expression des gènes liés OGD dans des cellules de cancer gastrique [16]. Cependant, on sait peu sur les mécanismes qui sous-tendent l'EMT induite par CagA.

Programmed protéine de mort cellulaire 4 (PDCD4) est localisée dans le noyau dans les cellules proliférantes [17]. Comme une importante cible post-transcriptionnelle de microARN (miR) miR-21, PDCD4 est liée à la progression de la tumeur et le pronostic dans le poumon humain, colorectal, du sein et le cancer gastrique [18], [19]. Le suppresseur de tumeur peut se lier à PDCD4 eIF4A ou eIF4G et inhiber la traduction. PDCD4 peut réguler mitogen-activated protein kinase 1 4 ou d'un récepteur de l'activateur du plasminogène urokinase (uPAR) expression pour inhiber l'invasion et de carcinome intravasculaire [20], [21]. PDCD4 pourrait également influencer la transcription de gènes. Elle interagit avec le domaine de liaison d'ADN et inhibe TWIST1 Y-box binding protein 1 'expression [22]. De plus, la perte d'expression PDCD4 est associée à une transformation maligne dans le cancer gastrique [23], [24]. La régulation négative de PDCD4 est liée à la différenciation de la tumeur dans les cancers du tube digestif [25]. Cependant, si PDCD4 est impliqué dans l'EMT induite par CagA dans le cancer gastrique et le mécanisme spécifique encore besoin de plus amples éclaircissements.

Ici, nous avons exploré la régulation des protéines EMT-associés et expression PDCD4 dans les tissus du cancer gastrique et CagA activation de l'expression TWIST1 et l'inhibition de la E-cadhérine et d'expression PDCD4 dans les cellules de cancer gastrique.

Matériel et méthodes

patients et échantillons de tissus

l'étude a été approuvée par l'éthique Comité de l'école de médecine de l'Université du Shandong, et tous les échantillons et les informations ont été recueillies avec le consentement éclairé par écrit. les tissus tumoraux gastriques et leurs tissus non cancéreux appariés ont été récoltées à partir de 30 patients pendant la chirurgie à l'hôpital Qilu, l'Université du Shandong (Jinan, Chine) de 2010 à 2012. Aucun des patients avaient reçu une chimiothérapie ou une radiothérapie adjuvante avant la chirurgie. Le diagnostic des cancers gastriques a été histopathologique confirmée par hématoxyline et éosine.

Culture cellulaire et transfection

lignées cellulaires de cancer gastrique humaine (AGS, BGC-823 et SGC-7901) ont été obtenus à partir de la Chine Cell Repository Academia Sinica (Shanghai). Les cellules ont été incubées dans les milieux recommandés et une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO _{2 à 37 ° C sans antibiotiques. les cellules CGT-7901 et BGC-823 cellules ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 additionné de 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) et les cellules AGS ont été cultivées dans du milieu F12 supplémenté avec 10% de FBS. Médias et FBS ont été achetés chez Invitrogen (USA). Ensuite, les cellules ont été transitoirement transfectées avec des plasmides pCDNA3.1 ou pCDNA3.1-CagA (un don du Dr. Yongliang Zhu, Université de Zhejiang, Chine) et pEGFP-C1 ou pEGFP-C1-PDCD4 (construits et fournis par le Dr Chen Youhai , Perelman School of Medicine, Université de Pennsylvanie, Philadelphie, Etats-Unis) en utilisant X-treme GENE HP transfection réactif (Roche Diagnostics, Allemagne) selon les protocoles du fabricant.}

isolement de l'ARN, la transcription et la qRT-PCR inverse

ARN total a été extrait des cellules en utilisant le réactif Trizol (Invitrogen, USA). La transcription inverse impliqué le kit Superscript III First Strand Synthesis (Invitrogen). L'expression des gènes a été détectée par l'utilisation de quantitative PCR en temps réel SYBR Prémélange Ex Taq (Takara, Chine) et la normalisation intervient le 2 ^{- △△ procédé ct par rapport à la ß-actine. Les séquences d'amorce étaient pour PDCD4, le sens, 5'-CAGTTGGTGGGCCAGTTTATTG-3 'et anti-sens, 5'-AGAAGCACGGTAGCCTTATCCA-3'; E-cadhérine, le sens, 5'-AATCCAAAGCCTCAGGTCATAAACA-3 'et anti-sens, 5'-TTGGGTCGTTGTACTGAATGGTC-3'; CagA, le sens, 5'-CCGGGGTACCAATTGGAGAGCAGAACCG-3 'et anti-sens, 5'-CCGTCGAGTTAAGATTTTTGGAAACC-3'; et TWIST1, le sens, 5'-GGCATCACTATGGACTTTCTCTATT-3 'et anti-sens, 5'-GGCCAGTTTGATCCCAGTATT-3'; vimentine, le sens, 5'-CTCTTCCAAACTTTTCCTCCC-3 'et anti-sens, 5'-AGTTTCGTTGATAACCTGTCC-3'; ESCARGOT, sens, 5'-GGAAGCCTAACTACAGCGAGCT-3 'et antisens, 5'-TCCCAGATGAGCATTGGCA-3'; β-actine, sens 5'- GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 'et anti-sens, 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3'.}

Analyse par Western blot

La protéine a été extraite à partir d'échantillons et séparés par SDS-PAGE , puis transférés sur des membranes de PVDF (Millipore Corp., Billerica, MA, USA), qui ont été bloqués immédiatement avec 5% de lait écrémé dans du TBST contenant 1% de Tween-20 pendant 1,5 h à température ambiante. Après avoir été lavées dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 3 fois, les membranes ont été incubées avec des anticorps contre PDCD4 (1:500; Cell Signaling Technology, USA), TWIST1 (1:2000, Novus Biologicals, États-Unis), ESCARGOT (1:1000 , Cell Signaling Technology, USA), CagA (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), E-cadhérine (1:1000, Cell Signaling Technology, USA), vimentine (1:1000, Cell Signaling Technology, USA ) et de β-actine (1:2000, Sigma-Aldrich, USA), en tant que témoin de normalisation, à 4 ° C pendant une nuit, puis avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort à la température ambiante pendant 1 h. Après un lavage, bandes immunoréactives ont été visualisées par chimioluminescence amplifiée (Millipore Corp., Billerica, MA, USA). Transfert de Western a été effectuée 3 fois pour chaque échantillon. La protéine a été chargée de 20 à 50 pg par piste.

immunohistochimie

spécimens de tissu inclus dans la paraffine ont été retirés de paraffinées avec du xylène et déshydraté par une série graduée d'alcool. la récupération de l'antigène par traitement thermique réalisée dans 0,1 M de tampon citrate. Et bloquant l'activité de peroxydase endogène a été utilisé par 3% H _{2O 2. Ensuite, les lames ont été incubées avec des anticorps contre PDCD4 (1:200), TWIST1 (1:500), vimentine (1:100) ou E-cadhérine (1:500), et les anticorps correspondants de la peroxydase de raifort conjugué secondaire et DAB pour les noyaux. Anticorps pour la coloration immunohistochimique ont été ceux utilisés pour western blot. Enfin, l'hématoxyline a été utilisée pour contre-coloration des lames. la différenciation de la tumeur des tissus cancéreux a été déterminée d'une manière aveugle. Le premier anticorps a été remplacé par du tampon phosphate salin comme témoin négatif. Les spécimens ont été vus sous un Nikon Eclipse E800 (Nikon, Tokyo, Japon) microscope.}

Toutes les sections colorées ont été observés et notés par 2 chercheurs indépendants en aveugle, et les diapositives ont reçu un indice de coloration totale (SI) marquer selon l'intensité de la coloration et le pourcentage de cellules tumorales positives. intensité de coloration a été classé comme 0, aucune coloration; 1, faible coloration; 2, coloration modérée; et 3, une forte coloration. proportion de cellules de la tumeur a été notée comme 0 cellules tumorales, ≤20% de positifs; 1, 20% des cellules tumorales positives -40%; 2 40% de cellules tumorales positives, -60% de; 3 60% de cellules tumorales positives, -80%; et 4 cellules tumorales, ≥80% de positifs. En évaluant l'IS, les résultats de la coloration ont finalement été enregistrées comme 0-4, faible expression; 4-6, une expression modérée; et 6-12, haute expression. Si l'interprétation de coloration différait entre les chercheurs, les données de la section ont été rejetés.

Matrigel test d'invasion

Matrigel test d'invasion impliqué une chambre Transwell (Costar, New York, USA). cellules SGC-7901 ont été transfectées avec 2 pg pCDNA3.1, pEGFP-C1; pCDNA3.1-CagA, pEGFP-C1; ou pCDNA3.1-CagA, pEGFP-C1-PDCD4. Après 48 h, 1 × 10 ^{5 cellules post-transfectées ont été trypsinisées et étalées sur Transwell chambres prérevêtues avec 20 ug Matrigel. Un milieu contenant 20% de FBS dans la chambre inférieure a été le facteur chimiotactique, et la chambre supérieure est remplie d'un milieu contenant 10% de FBS. Les cellules non-migrés ont été enlevés avec des tampons de coton après 24 ou 48 h. Les cellules qui migrent vers la partie inférieure du filtre ont été colorées avec 0,1% de cristal violet et dénombrées au microscope. Enfin, les cellules restantes ont été récoltées pour la protéine et l'isolement de l'ARN. Chaque traitement a été répété 3 fois.}

L'analyse statistique

Les données sont exprimées en moyenne ± SD. Student t
essai ou de test chi carré a été utilisé pour comparer les 2 groupes. L'analyse des données impliqué SPSS 12.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). P
< 0,05 a été considérée comme statistiquement significative

Résultats

1.. Expression de TWIST1, E-cadhérine, vimentine et PDCD4 dans le cancer gastrique

Pour étudier l'association des EMT et le cancer gastrique, nous avons récolté 30 échantillons cliniques de tissus provenant de patients atteints de cancer gastrique. Les biopsies ont été divisés en bas des tissus milieu /différenciation, des tissus de haute différenciation et les tissus non cancéreux adjacent au carcinome par hématoxyline et éosine (Fig. 1A). Sur immunohistochimie TWIST1 et l'expression de la vimentine étaient plus élevés dans les tissus malins que les tissus non cancéreux, alors que l'expression de la E-cadhérine et PDCD4 est opposée à celle TWIST1 (Fig. 1A-E). TWIST1 et PDCD4 expression est associée au degré de différenciation de la tumeur, mais pas le sexe ou l'âge (p = 0,021 et p = 0,013, Tableau 1). En outre, une diminution de l'expression PDCD4 était inversement associée à l'expression de TWIST1 changé au cours de cancer gastrique (p = 0,035, tableau 2). Par conséquent, EMT peut jouer un rôle important dans la carcinogenèse et le développement gastrique.

2. TWIST1, vimentine ou E-cadhérine expression dans des lignées cellulaires gastriques sont régies par

Next CagA, nous avons exploré si CagA, en tant que facteur virulente de H. pylori
, influencé l'EMT et donc promu l'invasion et les métastases dans le cancer gastrique. Nous avons choisi 3 gastriques lignes de statuts de différenciation (AGS, bien différencié lignée de cellules épithéliales gastriques; SGC-7901, lignée cellulaire modérément différencié et BGC-823 lignée de cellules peu différenciées) cellules cancéreuses humaines. CagA le plasmide d'expression a été transfecté dans diverses lignées de cellules gastriques. Bien que les modifications morphologiques des cellules transfectées CagA n'a été observée (données non représentées), l'expression des facteurs de transcription et des marqueurs de cellules ont été affectées par CagA. L'expression de l'ARNm et de la protéine de TWIST1 et la vimentine a été régulée positivement avec CagA transfection (Fig. 2A-G) et celle de PDCD4 et E-cadhérine a été régulée à la baisse (Fig. 2A-G), mais aucun changement significatif dans l'expression MOLLUSQUES ont été observées dans CagA groupe de transfection. Par conséquent, H. pylori
CagA peut affecter les régulateurs EMT dont TWIST1. Par ailleurs la E-cadhérine, en tant que marqueur épithélial importante et la vimentine en tant que marqueur mésenchymateux régulé par TWIST1 ont également été influencée par CagA et le gène lié PDCD4 EMT-a été régulée à la baisse.

3. Expression de TWIST1, vimentine et E-cadhérine a été influencé par PDCD4

Nous avons ensuite analysé le mécanisme moléculaire de l'EMT réglementé par H.
CagA pylori dans les cellules cancéreuses gastriques. PDCD4 supprime la croissance cellulaire par l'intermédiaire d'une interaction directe avec TWIST1 dans le cancer de la prostate humain [22]. Immunohistochimie et l'analyse statistique ont démontré la pertinence de PDCD4 et TWIST1 existait dans le carcinome gastrique (Fig. 1, Tableau 2). Cependant, les mécanismes sous-jacents fonction PDCD4 dans les cellules de cancer gastrique ne sont pas claires. Ainsi AGS? GSC-7901 et BGC-823 cellules transfectées avec nous un plasmide de surexprimant PDCD4. PDCD4 l'ARNm et l'expression des protéines a été régulée à la hausse dans toutes les lignées cellulaires transfectées avec des plasmides (Fig. 3A-G). En outre, les niveaux de TWIST1 et vimentine, mais pas MOLLUSQUES d'ARNm et de protéines ont été réduites à des degrés divers, et les niveaux E-cadhérine ont été augmentés (Fig. 3A-G). Par conséquent, TWIST1, vimentine et d'expression E-cadhérine peuvent être réglementés par PDCD4 dans les cellules épithéliales gastriques.

4. L'EMT est régulée par CagA via l'inhibition de PDCD4 dans les cellules épithéliales gastriques

Sur la base des résultats ci-dessus, nous avons des hypothèses que le processus d'EMT induite par H. pylori
CagA est produite par la régulation négative PDCD4, on a cotransfecté des cellules épithéliales gastriques avec le plasmide et CagA PDCD4 surexpression plasmide. La diminution de l'expression PDCD4 a été récupéré avec CagA et surexprimé PDCD4 transfection. En outre, l'expression accrue de TWIST1 et la vimentine a été inhibée et la diminution de l'expression de la E-cadhérine a été régulée à la hausse dans le groupe cotransfectés. Ces changements se sont produits à la fois au niveau des ARNm et de protéines (Fig. 4A-G). La migration de la lignée cellulaire de cancer gastrique humaine CGT-7901 transfectées avec des plasmides a été déterminée par un essai d'invasion de Matrigel. Les résultats montrent qu'il a été induit par CagA plasmide. détermination de la migration cellulaire a également révélé que la surexpression PDCD4 régulée à la baisse CagA induite par leur invasion et leur capacité de métastases (Fig. 5A). Figue. 5B représente le nombre de cellules migrées de SGC-7901 dans le groupe de transfection CagA sont évidemment plus que le groupe de contrôle, alors que la quantité de cellules migrées dans le groupe co-transfection est beaucoup moins que le groupe de transfection CagA. Les phénomènes biologiques démontrent la promotion de l'EMT par CagA a été récupéré en partie par l'expression PDCD4 élevée. Sur la base des éléments de preuve, il déduit que PDCD4 peut être nécessaire pour H. gastrique progression du cancer du CagA médiée de pylori

Discussion

Les principaux résultats de cette étude sont résumés comme suit:. 1) H. pylori
CagA est responsable de l'induction de TWIST1 ou vimentine et l'inhibition de la E-cadhérine dans les cellules cancéreuses gastriques. 2) la transition épithéliale-mésenchymateuse induite CagA-est en partie dépendante de la régulation PDCD4. 3) TWIST1 et PDCD4 implique dans l'EMT du cancer gastrique.

Le cancer gastrique est un multi-étape et de la maladie progressive. prolifération excessive de cellules épithéliales est une partie importante de l'angiogenèse tumorale initiale ou la croissance précoce [5]. Par la suite, l'invasion cellulaire, qui se traduit d'abord à travers la membrane basale, a été considérée comme un facteur prédictif de la phase finale du cancer; il a finalement conduit à la dissémination métastatique et de la mortalité [26]. une infection pathogène peut provoquer la tumorigenèse du cancer et de la transformation maligne des cellules hôtes. Comme un important facteur de risque pathogène, Helicobacter pylori
étaient étroitement liées à la maladie peptique d'ulcère, lymphome du tissu lymphoïde associé aux muqueuses de l'estomac, et l'adénocarcinome gastrique [20], [27], [28], [29] . CagA, l'un des facteurs de virulence les plus principaux de H. pylori
, induit apparition et le développement du cancer gastrique. la transformation maligne des cellules hôtes dans le réseau comporte regulationary, y compris de nombreuses protéines cellulaires, l'ARN non codant, et d'autres molécules d'activité biologique. Cependant, le mécanisme des effets sous-jacents CagA sur la muqueuse gastrique est si complexe et peu claire.

L'EMT est un processus biologique hautement conservée sur le développement d'organes embryonnaires, qui permet aux cellules épithéliales de perdre phénotype épithélial et obtenir mésenchymateuses phénotype. Ceci inclut la perte de la polarité cellulaire dans les cellules épithéliales, la perte de la capacité de liaison à la membrane basale, l'accès à mésenchymateuses phénotype tel que la migration ultérieure et l'invasion, l'anti-apoptose, et la capacité de dégrader la matrice extracellulaire [8], [30] . EMT joue un rôle essentiel dans les maladies inflammatoires chroniques, les maladies fibrotiques, la progression tumorale et processus de reconstruction tissulaire, en particulier dans l'acquisition de la migration et de l'invasion capacité des cellules épithéliales malignes. une activité anormale dans le epith EMT des cellules epitheliales adultes ont inhibé les molécules d'adhésion cellulaire, a provoqué une diminution des capacités d'adhérence cellulaire et, par conséquent permis aux cellules tumorales de se propager dans l'organisme, favorisant finalement les métastases tumorales [31], [32], [33]. Par conséquent, EMT est considéré comme le début de l'invasion et les métastases et est également un signe de forte capacité d'invasion et les métastases des cellules tumorales. H.pylori
induit la transition épithéliale-mésenchymateuse par le TNF-α induisant la protéine [34]. L'étude actuelle indique CagA peut conduire les cellules épithéliales à des changements morphologiques. Il a été proposé que l'expression de CagA était non seulement suffisante pour rompre les jonctions apicale, mais également ressembler à la transition épithélio-mésenchymateuse dans Madin-Darby cellules de rein canin [35]. Les cellules épithéliales infectées par les bactéries sont apparues diverses génomique changements, et l'effet sur les marqueurs EMT induits par H. pylori
était probablement sur une manière cagPaI liée. Les données ont montré que la transition épithéliale mésenchymateuses (EMT) de gènes étaient la PI en amont ou en-régulé par CagA positif H. pylori
souches dans AGS [36], [37]. Il faut noter que le réseau réglementaire de CagA impliquant dans l'EMT du cancer gastrique est encore besoin d'être clarifiée.

Pour étudier le mécanisme spécifique de EMT promu par CagA dans le cancer gastrique, nous avons comparé l'expression des gènes de la non- adjacente les tissus tumoraux et les tissus de carcinome gastrique par immunohistochimie. Les résultats indiquaient que l'expression TWIST1 /vimentine dans les tissus de carcinome étaient plus élevés que dans les tissus non tumoraux adjacents, et son expression dans des tissus de carcinome du milieu de différenciation faible /élevée que les tissus à forte différenciation. Cependant, la E-cadhérine et PDCD4 ont diminué dans le processus de transition épithéliale-mésenchymateuse dans le cancer gastrique. Fait intéressant, il existe une corrélation négative à l'expression de TWIST1 et PDCD4. Notre étude a suggéré des gènes liés EMT sont associés au processus du cancer gastrique, conformément aux recherches antérieures observant la perte de protéine et /ou l'acquisition de l'expression des protéines mésenchymateuses est produite dans le carcinome gastrique épithéliale. En outre, ils ont été respectivement corrélées à l'histologie peu différencié, stade avancé et les résultats des patients pauvres [38]. En outre, PDCD4 est une molécule nouvellement trouvé qui joue un rôle vital sur de nombreux processus biologiques qui peuvent causer des maladies ou l'apparition et le développement de la tumeur. PDCD4 inhibe le processus de traduction en se liant au facteur d'initiation de traduction eIF4A ou eIF4G. Différents inducteurs de l'apoptose stimulent les cellules et régulent positivement l'expression de PDCD4, ce qui pourrait en outre réglementer P21, Cdk4, l'anhydrase carbonique II et JNK /c-Jun /AP-1. PDCD4 pourrait inhiber l'invasion liée urokinase récepteur d'activateur de plasminogène d'expression, l'invasion ou l'infiltration de vaisseaux sanguins, et les métastases; Par conséquent, une diminution de l'expression de PDCD4 joue un rôle important dans l'apparition de la tumeur, le développement et le pronostic [17], [33], [39], [40]. Donc, nous nous demandions si TWIST1 et PDCD4 ont participé à l'EMT induite CagA.

Ensuite, nous avons détecté des facteurs et des marqueurs de transcription EMT associé expression dans des lignées cellulaires de cancer gastrique CagA-transfectées. Nos données ont montré que H. pylori
CagA pourrait réguler à la hausse l'expression de TWIST1 et vimentine mais pas ESCARGOT, et vers le bas réguler la E-cadhérine et PDCD4 dans des lignées cellulaires gastriques (AGS, SGC-7901 et BGC-823). Les résultats ne sont pas affectés par l'état de différenciation des cellules transfectées. Bien que nous n'avons pas observé les changements morphologiques des cellules CagA transfectées, l'invasion et la capacité de la métastase des cellules de cancer gastrique pourrait être accélérée par CagA via Transwell dosage de l'invasion des cellules. Cela est en partie due à l'hétérogénéité fonctionnelle des CagA dans différents tissus. Ainsi, l'effet de EMT induite par H. pylori
encore besoin d'être davantage explorées. MiR-21 promu TGF-β induite par processus de différenciation des myofibroblastes en ciblant PDCD4. Le TGF-β induite par miR-21 expression dans les fibroblastes et miR-183 et d'une régulation négative PDCD4 inhibé l'apoptose TGF-β induite dans les cellules de carcinome hépatocellulaire humain [41], [42]. Pendant ce temps, le TGF-β réglementé ESCARGOT, TWIST ou ZEB1 et affecté l'EMT et les métastases [43]. En outre, PDCD4 a été trouvé pour être impliqué dans la transcription aussi. En effet, l'extrémité COOH de TWIST1 contenant le domaine basique hélice-boucle-hélice a été suggéré que la médiation de l'interaction directe avec des protéines PDCD4. Ainsi, PDCD4 interagit avec le domaine de liaison à l'ADN et inhibe TWIST1 sa capacité de liaison d'ADN pour cibler des gènes dans les cellules cancéreuses de la prostate humain [22] .Par conséquent, nous avons testé en outre si PDCD4 pouvait réguler TWIST1 dans les cellules cancéreuses gastriques. Notre étude a montré que TWIST1 est en baisse régulée par PDCD4 haute expression plasmidique par PCR en temps réel et western blot, tandis que l'expression E-cadhérine était opposée à TWIST1 dans AGS, SGC-7901 et BGC-823. L'expression de l'ARNm de ESCARGOT a été downregulated dans AGS et SGC-7901, tandis que preotein expression n'a pas été observé les mêmes changements. Elle peut être due à la complexité de la synthèse protéique. Autrement dit, la protéine est non seulement réglementé au niveau de la transcription, mais aussi la traduction et retourner niveau. Il semble parfois que l'ARNm est pas une indication directe du niveau de protéines dans les cellules. Enfin, nous avons effectué de nouvelles recherches sur le rôle de PDCD4 en transition épithéliale-mésenchymateuse induite CagA. les cellules épithéliales gastriques ont été transfectées avec le plasmide d'expression de CagA et PDCD4 surexpression plasmide simultanément. Restauration d'expression PDCD4 pourrait inhiber TWIST1 et vimentine, et d'induire la E-cadhérine qui régulée par CagA, PDCD4 a également été certifié qui pourrait affecter l'invasion et les métastases capacité dans les cellules gastriques par dosage d'invasion matrigel. Bien que des études supplémentaires sont nécessaires pour tester cette hypothèse, nous avons conclu essentiellement que la transition épithéliale-mésenchymateuse induite CagA-est en partie dépendante de la régulation PDCD4.

En résumé, nous démontrons que H. pylori
CagA induire l'expression de TWIST1 et EMT dans les cellules de cancer gastrique en régulant PDCD4 (Fig. 6). Nous fournissons un aperçu du réseau moléculaire du cancer gastrique induite par H. pylori
infection, et de fournir une base théorique pour PDCD4 comme une cible biologique pour le diagnostic ou le traitement du cancer. des modèles de souris de recherche impliquant l'avenir peut conduire à une meilleure compréhension du rôle de PDCD4 dans le H. pylori
EMT induite du cancer gastrique.

• PLOS ONE: miR-30b, régulée à la baisse dans le cancer gastrique, favorise l'apoptose et supprime la croissance des tumeurs par le ciblage Plasminogen Activator Inhibitor-1
• PLOS ONE: Helicobacter pylori du cancer gastrique et ulcère duodénal Voir Same phylogéographique Origin dans la région andine dans Colombia