PLOS ONE: Helicobacter pylori Främjar Epithelial-Mesenkymala Övergång vid ventrikelcancer genom nedreglering programmerad celldöd Protein 4 (PDCD4)

Abstrakt

Helicobacter pylori
, en gramnegativ, mikroaerofil bakterie återfinns i magsäcken, antas vara associerad med karcinogenes, invasion och metastas i matsmältningssjukdomar. Cellgift associerade genen A (CagA) är en onkogen protein av H. pylori
som kodas för av en Cag patogenicitet ö hänför sig till utvecklingen av gastrisk cancer. Epitel-mesenkymala övergång (EMT) är det viktigaste biologiska händelsen i invasion eller metastas av epitelceller. H. pylori
kan främja EMT i humana gastriska cancercellinjer, men särskilda mekanismer är fortfarande oklar. Vi utforskade den underliggande molekylära mekanismen för EMT inducerad av H. pylori
CagA i magcancer. I vår artikel, upptäckte vi magcancer prover och angränsande icke-cancerprover genom immunhistokemi och fann ökat uttryck av EMT relaterade regulatoriskt protein TWIST1 och mesenkymala markör vimentin i cancervävnader, medan programmerad celldöd faktor 4 (PDCD4) och epitelceller markör E-cadherin uttryck minskade i cancerprover. Dessa förändringar var associerade med graden av vävnads malignitet. Dessutom har PDCD4 och TWIST1 nivåer relaterade. I gastric cancerceller samodlades med CagA expressionsplasmid, CagA aktiverad TWIST1 och vimentin uttryck, och hämmade E-cadherin uttryck genom nedreglering PDCD4. CagA främjade också rörlighet gastric cancerceller genom att reglera PDCD4. Således, H. pylori
CagA inducerad EMT i gastric cancerceller, som avslöjar en ny signalväg för EMT i magcancer cellinjer

Citation. Yu H, Zeng J, Liang X, Wang W, Zhou Y, Sun Y, et al. (2014) Helicobacter pylori
Främjar Epithelial-Mesenkymala Övergång vid ventrikelcancer genom nedreglering programmerad celldöd Protein 4 (PDCD4). PLoS ONE 9 (8): e105306. doi: 10.1371 /journal.pone.0105306

Redaktör: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA

emottagen: 12 februari 2014; Accepteras: 21 juli 2014. Publicerad: 21 augusti, 2014

Copyright: © 2014 Yu et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöddes av National Basic Research Program of China (nr 973 Program 2012CB911202.), National Natural Science Foundation i Kina (nos: 81.171.536, 81.371.781, 81.272.654, 81.372.680 och 81.170.514), den medicinska Science and Technology Development Program Shandong (ingen . 2013WS0209) och den oberoende Innovation Foundation Shandong University (nr. 2012TS106). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Helicobacter pylori
( H. pylori
) är en spiralformad, gramnegativ bakterie i samband med matsmältningssjukdomar, inklusive kronisk gastrit, magsår, magcancer, och mucosal-associerad lymfoid vävnad lymfom. H. pylori
har klassats som ett cancerframkallande ämne av Världshälsoorganisationen och International Agency for Research on Cancer (WHO /IARC) 1994 [1], [2].

H. pylori
gener har en cytotoxin associerad gen A (CagA) patogenicitet ö som kodar för den stora virulens protein CagA och en typ IV sekretionssystem (T4SS). CagA levereras till värdceller genom T4SS och inducerar cancer bildas och progression [3]. H. pylori
kan avreglera cellproliferation, påverka den normala apoptotiska vägen, påverkar cellform, avskaffa junktional aktivitet och underlätta en epitelial-till-mesenkymala övergång (EMT) fenotyp efter att den translokerar in i värdcellen [4], [5]. H. pylori
effektor protein CagA påverkar de flesta av dessa vägar. In vivo
experiment visade att transgent uttryck av CagA kan orsaka flera maligniteter hos möss, inklusive gastric epitelial hyperplasi, myeloid leukemi och B-cellslymfom, eller gastric polyper och adenokarcinom i magen och tunntarmen [6]. Men den molekylära mekanismen av H. pylori
CagA interagera på värdceller är fortfarande oklart.

EMT redovisades första gången som en del av embryogenes, en viktig process för morfogenes under embryonal och hjärtutveckling. Men det bidrar också till vävnadsfibros, tumörinvasion och metastas. EMT kännetecknas av flera olika egenskaper, såsom förlust av celladhesion, ökad rörlighet cell, resistens mot apoptos, och vissa egenskaper hos stamceller. Med EMT, epitelceller markörer såsom E-cadherin visar minskat uttryck och mesenkymala markörer som vimentin visar ökat uttryck. Andra reglerande molekyler såsom snigel, TWIST och SLUG visa ändrade uttryck [7], [8], [9]. Onkogena vägar som kan framkalla EMT inkluderar transformerande tillväxtfaktor β (TGF-P), Src, Ets, Ras, Wnt /β-catenin, Notch, nukleär faktor-kB och integrin [10], [11], [12].

Infektion med den mänskliga patogena faktorn H. pylori
antas leda till EMT, invasion eller metastaser av magcancer. Till exempel, uppreglering av matrix metalloproteinas 7 av patogena H. pylori
delvis beror på gastrin och kan ha en funktion i utvecklingen av magcancer, eventuellt genom EMT, genom att indirekt inducerar nivåer av löslig heparinbindande endothelial growth factor [13]. H. pylori
CagA är involverat i invasion av tumörceller genom att avreglera c-met receptor signalering [14]. Samt, CagA kan öka aktiveringen av Wnt /β-catenin signalväg genom att störa stabilisering av E-cadherin-β-catenin-komplexet. Således, CagA spelar en viktig roll i utvecklingen av intestinal metaplasi [15]. Dessutom föreslog microarray analys att fosforyleringen status CagA kan påverka uttrycket av EMT-relaterade gener i gastric cancerceller [16]. Men lite är känt om de mekanismer som ligger till grund för EMT induceras av CagA.

Programmerad celldöd protein 4 (PDCD4) är lokaliserad till kärnan i celler som förökar sig [17]. Som en viktig post-transkriptionell målet på mikroRNA (MIR) miR-21, PDCD4 är relaterad till tumörprogression och prognos vid human lunga, kolorektal, bröst och magcancer [18], [19]. Den tumörsuppressor PDCD4 kan binda till eIF4A eller eIF4G och inhiberar translation. PDCD4 kan reglera mitogenaktiverat protein 4 kinas 1 eller urokinasplasminogenaktivatorreceptorfunktion (uPAR) uttryck att inhibera carcinoma invasion och intravasering [20], [21]. PDCD4 skulle också kunna påverka transkriptionen av gener. Det interagerar med den DNA-bindande domänen av TWIST1 och hämmar Y-box-bindande protein 1 expression [22]. Som väl är förlusten av PDCD4 uttryck i samband med malign transformation i magcancer [23], [24]. Nedreglering av PDCD4 är relaterad till tumör differentiering i tarmcancer [25]. Men om PDCD4 deltar i EMT induceras av CagA i magcancer och den specifika mekanismen fortfarande behöver ytterligare förklaring.

Här utforskas vi regleringen av EMT-associerade proteiner och PDCD4 uttryck i gastric cancervävnad och CagA aktivering av TWIST1 uttryck och hämning av E-cadherin och PDCD4 uttryck i gastric cancerceller.

Material och metoder

Patienter och vävnadsprover

studien godkändes av den etiska Kommittén Shandong University School of Medicine, och alla prover och uppgifter samlades med skriftligt informerat samtycke. Gastric tumörvävnad och deras matchade godartade vävnader skördades från 30 patienter under kirurgi vid Qilu sjukhus, Shandong University (Jinan, Kina) från 2010 till 2012. Ingen av patienterna hade fått adjuvant kemoterapi eller strålbehandling före operation. Diagnos av magcancer har histopatologiskt bekräftats av hematoxylin och eosin färgning.

Cellodling och transfektion

Mänskliga gastric cancercellinjer (AGS, BGC-823 och SGC-7901) erhölls från Kina Academia Sinica Cell Repository (Shanghai). Celler inkuberades i de rekommenderade media och en fuktig atmosfär innehållande 5% CO _{2 vid 37 ° C utan antibiotika. SGC-7901-celler och BGC-823-celler odlades i RPMI 1640-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), och AGS-celler odlades i F12-medium kompletterat med 10% FBS. Media och FBS köptes från Invitrogen (USA). Därefter celler transfekterades med plasmider pCDNA3.1 eller pCDNA3.1-CagA (en gåva från Dr. Yongliang Zhu, Zhejiang University, Kina) och pEGFP-C1 eller pEGFP-C1-PDCD4 (konstruerat och tillhandahållen av Dr. Youhai Chen , Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, USA) med hjälp av X-treme GENE HP transfektionsreagens (Roche Diagnostics, Tyskland) enligt tillverkarens protokoll.}

RNA isolering, omvänd transkription och QRT-PCR

Totalt RNA extraherades från celler genom användning av Trizol-reagens (Invitrogen, USA). Omvänd transkription inblandade Upphöjd III First Strand Synthesis Kit (Invitrogen). Uttryck av gener upptäcktes genom användning av kvantitativ realtids-PCR SYBR förblandning Ex Taq (Takara, Kina) och normalisering involverade två ^{- △△ ct metod i förhållande till p-aktin. Primersekvenser var för PDCD4, avkänning, 5'-CAGTTGGTGGGCCAGTTTATTG-3 'och antisens, 5'-AGAAGCACGGTAGCCTTATCCA-3'; E-cadherin, avkänning, 5'-AATCCAAAGCCTCAGGTCATAAACA-3 'och antisens, 5'-TTGGGTCGTTGTACTGAATGGTC-3'; CagA, avkänning, 5'-CCGGGGTACCAATTGGAGAGCAGAACCG-3 'och antisens, 5'-CCGTCGAGTTAAGATTTTTGGAAACC-3'; och TWIST1, avkänning, 5'-GGCATCACTATGGACTTTCTCTATT-3 'och antisens, 5'-GGCCAGTTTGATCCCAGTATT-3'; vimentin, avkänning, 5'-CTCTTCCAAACTTTTCCTCCC-3 'och antisens, 5'-AGTTTCGTTGATAACCTGTCC-3'; SNIGEL, avkänning, 5'-GGAAGCCTAACTACAGCGAGCT-3 'och antisens, 5'-TCCCAGATGAGCATTGGCA-3'; β-aktin, avkänning, 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3 'och antisens, 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3'.}

Western blot-analys

Protein extraherades från prover och separerades med SDS-PAGE , överförs sedan på PVDF-membran (Millipore Corp., Billerica, MA, USA), som har blockerats omedelbart med 5% fettfri mjölk i TBST innehållande 1% Tween-20 i 1,5 h vid rumstemperatur. Efter att ha tvättats i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) 3 gånger, inkuberades membranen med antikroppar mot PDCD4 (1:500; Cell Signa Technology, USA), TWIST1 (1:2000, Novus Biologicals, USA), SNAIL (1:1000 Cell Signaling Technology, USA), CagA (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), E-cadherin (1:1000, Cell Signaling Technology, USA), vimentin (1:1000, Cell Signaling Technology, USA ), och β-aktin (1:2000, Sigma-Aldrich, USA), som en normalisering kontroll, vid 4 ° C över natten, därefter med pepparrotsperoxidas-konjugerad sekundära antikroppar vid rumstemperatur under 1 h. Efter en tvättning immunoreaktiva band visualiserades genom förstärkt kemiluminescens (Millipore Corp., Billerica, MA, USA). Western blotting utfördes 3 gånger för varje prov. Protein laddades vid 20 till 50 ^ g per bana.

Immunohistokemi

Paraffininbäddade vävnadsprover de-paraffinized med xylen och dehydratiseras med en graderad serie av alkohol. Antigenåtervinning genom värmebehandling utförs i 0,1 M citrat-buffert. Och blockera endogen peroxidasaktivitet användes av 3% H _{2O 2. Sedan objektglasen inkuberades med antikroppar mot PDCD4 (1:200), TWIST1 (1:500), vimentin (1:100) eller E-cadherin (1:500), och motsvarande pepparrotsperoxidaskonjugerad sekundära antikroppar och DAB för kärnor. Antikroppar för immunohistokemisk färgning var de som används för western blöt. Slutligen hematoxylin användes för motfärgning diabilder. Tumör differentiering av cancervävnader bestämdes på ett blint sätt. Den första antikroppen ersattes med fosfatbuffrad saltlösning som negativ kontroll. Prover betraktades under ett Nikon Eclipse E800 (Nikon, Tokyo, Japan) mikroskop.}

Alla färgade sektioner observerades och poängsätts av 2 oberoende förblindade utredare, och diabilder fick en total färgningsindex (SI) poäng enligt färgningsintensiteten och den procentuella andelen positiva tumörceller. Färgningsintensitet graderades som 0, ingen färgning; 1, svag färgning; 2, måttlig färgning; och 3, stark färgning. Tumörcell andel bedömdes som 0, ≤20% positiva tumörceller; 1, 20% -40% positiva tumörceller; 2, 40% -60% positiva tumörceller; 3, 60% -80% positiva tumörceller; och 4, ≥80% positiva tumörceller. Genom att bedöma SI, var färgningsresultaten slutgiltigt som 0-4, lågt uttryck; 6/4, moderat expression; och 6-12, högt uttryck. Om färgnings tolkning skilde mellan utredarna, var data för avsnittet kasseras.

Matrigel invasion analys

Matrigel invasion analys involverade en transwell kammare (Costar, New York, USA). SGC-7901 celler transfekterades med 2 mikrogram pCDNA3.1, pEGFP-C1; pCDNA3.1-CagA, pEGFP-C1; eller pCDNA3.1-CagA, pEGFP-C1-PDCD4. Efter 48 h, 1 × 10 ^{5 post-transfekterade celler trypsinerades och ströks ut på Transwell-kamrarna förbelagda med 20 | j, g Matrigel. Medium innehållande 20% FBS i den nedre kammaren tjänade som kemoattraherande och den övre kammaren fylldes med medium innehållande 10% FBS. Icke-migrerade celler avlägsnades med bomullspinnar efter 24 eller 48 timmar. Celler som migrerar till undersidan av filtret färgades med 0,1% kristallviolett och räknades på ett mikroskop. Slutligen tillsattes återstående cellerna skördas för protein och RNA-isolering. Varje behandling upprepades 3 gånger.}

Statistisk analys

Data uttrycks som medelvärde ± SD. Student t
test eller chitvåtest användes för att jämföra 2 grupper. Dataanalys inblandade SPSS 12.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). P Hotel < 0,05 ansågs statistiskt signifikant

Resultat

1.. Expression av TWIST1, E-cadherin, vimentin och PDCD4 i magcancer

För att undersöka sammanslutning av EMT och magcancer, skördade vi 30 kliniska vävnadsprover från patienter med ventrikelcancer. Biopsier delades in i mitten /låg differentiering vävnad, hög differentiering vävnad och icke-cancervävnaden intill carcinoma av hematoxylin och eosin färgning (Fig. 1A). På immunohistokemi, TWIST1 och vimentin expression var högre i malign vävnad än icke-cancervävnaden, medan uttrycket av E-cadherin och PDCD4 var motsatt den för TWIST1 (Fig. 1 A-E). TWIST1 och PDCD4 uttryck i samband med graden av tumör differentiering men inte kön eller ålder (p = 0,021 och p = 0,013, tabell 1). Samt minskade PDCD4 expression var omvänt förknippad med förändrad TWIST1 expression under magcancer (p = 0,035, Tabell 2). Därför kan EMT spela en viktig roll vid gastrisk carcinogenes och utveckling.

2. TWIST1, vimentin eller E-cadherin-uttryck i mag cellinjer regleras av CagA

Därefter undersökte vi om CagA, som en virulent faktor H. pylori
, påverkat EMT och därför främjat invasion och metastas i magcancer. Vi valde 3 humana magcancer cellinjer av differentieringsstatus (AGS, väl differentierade gastrisk epitelceller linje, SGC-7901, måttligt differentierad cellinje och BGC-823 dåligt differentierad cellinje). CagA-expressionsplasmiden transfekterades in i olika gastriska cellinjer. Även om morfologiska förändringar av CagA-transfekterade celler inte observerades (data visas ej), var ett uttryck för transkriptionsfaktorer och cellmarkörer påverkas av CagA. MRNA och proteinuttryck av TWIST1 och vimentin uppreglerades med CagA transfektion (Fig. 2A-G) och den för PDCD4 och E-cadherin var nedreglerad (Fig. 2A-G), men inga signifikanta förändringar i SNIGEL expression observerades i CagA transfektion grupp. Därför H. pylori
CagA kan påverka EMT regulatorer inklusive TWIST1. Dessutom E-cadherin, som en viktig epitel markör och vimentin, som mesenkymala markör regleras av TWIST1 var också påverkad av CagA och EMT-relaterad gen PDCD4 var nedregleras.

3. Expression av TWIST1, vimentin och E-cadherin var påverkad av PDCD4

Vi analyserade nästa den molekylära mekanismen för EMT regleras av H. pylori
CagA i gastric cancerceller. PDCD4 undertrycker celltillväxt via en direkt interaktion med TWIST1 i human prostatacancer [22]. Immunohistokemi och statistisk analys visade betydelsen av PDCD4 och TWIST1 fanns i magcancer (fig. 1, tabell 2). Men mekanismerna bakom PDCD4 funktion i gastric cancerceller var inte klart. Så AGS? GSC-7901 och BGC-823 celler vi transfekterade med en plasmid av överuttrycker PDCD4. PDCD4 mRNA och proteinuttryck uppreglerades i alla plasmid-transfekterade cellinjer (Fig. 3A-G). Dessutom mRNA och proteinnivåer av TWIST1 och vimentin, men inte SNIGEL, minskades i olika grad, och E-cadherin-nivåer ökade (Fig. 3A-G). Därför kan TWIST1, vimentin och E-cadherin uttryck regleras av PDCD4 i gastric epitelceller.

4. EMT regleras av CagA via hämma PDCD4 i gastric epitelceller

Baserat på ovanstående resultat, hypoteser vi att EMT process som induceras av H. pylori
CagA inträffade genom att nedreglera PDCD4, vi samtransfekteras gastriska epitelceller med CagA plasmid och PDCD4 överuttryck plasmid. Den minskade uttrycket av PDCD4 utvanns med CagA och överuttryckt PDCD4 transfektion. Som väl var ökat uttryck av TWIST1 och vimentin hämmade och minskad expression av E-cadherin uppreglerade i samtransfekterade grupp. Dessa förändringar uppträdde vid både mRNA och proteinnivåer (Fig. 4A-G). Migreringen av human magcancer cellinje SGC-7901 transfekterad med plasmider bestämdes genom matrigel invasionsanalys. Resultaten visar att det var en följd av CagA plasmid. Cellmigrationsassay visade också att PDCD4 uttryck nedreglerade CagA-inducerad sin invasion och metastas förmåga (Fig. 5A). Fikon. 5B visar de migrerade cellantal av SGC-7901 i CagA transfektion grupp är uppenbarligen mer än kontrollgruppen, under det att mängden migrerade cell i samtransfektion gruppen är betydligt mindre än CagA transfektion grupp. De biologiska fenomen visar EMT främjande av CagA utvanns delvis av förhöjd PDCD4 uttryck. På grundval av bevis, dra slutsatsen det att PDCD4 kan krävas för H. pylori
CagA-medierad magcancer progression

Diskussion

De viktigaste resultaten av denna studie kan sammanfattas enligt följande:. 1) H. pylori
CagA är ansvarig för induktion av TWIST1 eller vimentin och hämning av E-cadherin i gastriska cancerceller. 2) CagA-inducerad epitel-mesenkymala övergång är delvis beroende av att reglera PDCD4. 3) TWIST1 och PDCD4 innebär i EMT av magcancer.

Gastric cancer är en flerstegs och gradvis sjukdom. Överskott proliferation av epitelceller är en viktig del av den ursprungliga tumören angiogenes eller tidig tillväxt [5]. Därefter cellinvasion, inledningsvis reflekteras genom basalmembranet, ansågs vara en prediktor för den sista etappen av cancer; det leder så småningom till metastatisk spridning och dödlighet [26]. Patogen infektion kan orsaka cancer tumorgenesis och malign transformation av värdceller. Som en viktig patogen riskfaktor, Helicobacter pylori
var nära släkt med magsår, slemhinnor associerad lymfvävnad lymfom av magen, och magcancer [20], [27], [28], [29] . CagA, en av de mest princip virulensfaktorer av H. pylori
inducerar förekomsten och utvecklingen av magcancer. Malign transformation av värdceller innefattar i regulationary nätverket, inklusive ett stort antal cellproteiner, icke-kodande RNA, och andra biologiska aktivitets molekyler. Men är så komplicerad och oklar mekanismen bakom CagA effekter på magslemhinnan.

EMT är en mycket konserverad biologisk process på embryonala organutveckling, vilket gör det möjligt för epitelceller att förlora epitelial fenotyp och få mesenkymala fenotyp. Detta inkluderar förlust av cellpolaritet i epitelceller, förlust av förmågan att ansluta med basalmembranet, tillgång till mesenkymala fenotyp såsom högre migration och invasion, anti-apoptos, och förmågan att bryta ned den extracellulära matrisen [8], [30] . EMT spelar en viktig roll i kroniska inflammatoriska sjukdomar, fibrotiska sjukdomar, tumörprogression och vävnadsrekonstruktion process, särskilt vid förvärv av migration och invasion förmåga till maligna epitelceller. Onormal aktivitet i EMT epith av vuxna epitelceller hämmade celladhesionsmolekyler, orsakade minskad cellvidhäftningsförmåga, och därigenom gjort det möjligt för tumörceller att sprida sig i kroppen, i slutändan främja tumörmetastas [31], [32], [33]. EMT anses därför i början av invasion och metastas och är också ett tecken på stark förmåga av invasion och metastas av tumörceller. H. pylori
inducerar epitel-mesenkymala övergång av TNF-α inducerande protein [34]. Den aktuella studien visar CagA kan leda epitelceller till morfologiska förändringar. Det har föreslagits att CagA uttryck inte bara var tillräcklig för att bryta apikala korsningar utan också likna epitelial till mesenkymala övergång i Madin-Darby Canine Kidney-celler [35]. Epitelceller infekterade av bakterien föreföll olika genomik förändringar, och effekten på EMT markörer som induceras av H. pylori
var förmodligen på en cagPaI relaterad sätt. Data visade att epitel mesenkymala övergång (EMT) -relaterade gener var upp- eller nedregleras av CagA-positiv H. pylori
stammar i AGS [36], [37]. Notera, är den rättsliga nätverk av CagA innebär i EMT av magcancer fortfarande behöver klargöras.

För att undersöka den specifika mekanismen för EMT främjas genom CagA i magcancer, jämförde vi gener uttryck av intilliggande icke- tumörvävnad och magcancer vävnader genom immunhistokemi. Resultaten visade att TWIST1 /vimentin uttryck i karcinomvävnader var högre än intilliggande icke-tumörvävnader, och dess uttryck i mitten /låg differentiering karcinomvävnader högre än hög differentierings vävnader. Men E-cadherin och PDCD4 minskade i färd med epitel-mesenkymala övergång i magcancer. Intressant nog finns det på en negativ korrelation till expression av TWIST1 och PDCD4. Vår studie föreslog EMT relaterade gener är förknippade med processen för magcancer, i linje med tidigare forskning att observera förlusten av epitelial protein och /eller förvärv av uttrycket av mesenkymala proteiner inträffade i magcancer. Dessutom var de respektive korrelerade till dåligt differentierade histologi, långt framskridna och dålig patient resultatet [38]. Dessutom är PDCD4 en nyfunna molekyl som spelar en viktig roll vid många biologiska processer som kan orsaka sjukdom eller förekomst och utveckling av tumör. PDCD4 hämmar översättningsprocessen genom att binda till translationsinitiering faktor eIF4A eller eIF4G. Olika inducerare av apoptos stimulerar celler och uppreglera uttrycket av PDCD4, vilket ytterligare skulle kunna reglera P21, Cdk4, karbanhydras II och JNK /c-Jun /AP-1. PDCD4 kunde hämma invasion relaterade urokinasplasminogenaktivatorreceptorfunktion uttryck, invasion eller infiltration av blodkärl och metastaser; därför, minskad expression av PDCD4 spelar en viktig roll i tumörförekomst, utveckling och prognos [17], [33], [39], [40]. Så undrade vi om TWIST1 och PDCD4 deltog i CagA-inducerad EMT.

Sedan upptäckte vi EMT-associerade transkriptionsfaktorer och markörer uttryck i CagA-transfekterade gastric cancercellinjer. Våra data visade att H. pylori
CagA kan uppreglera uttrycket av TWIST1 och vimentin men inte snigel, och nedreglerar E-cadherin och PDCD4 i mag cellinjer (AGS, SGC-7901 och BGC-823). Resultaten påverkades inte av differentieringsstatusen av transfekterad cell. Även om vi inte observera morfologiska förändringar av CagA-transfekterade celler kunde invasion och metastas förmåga gastric cancerceller påskyndas genom CagA via transwell cellinvasion analys. Detta beror delvis på grund av den funktionella heterogenitet CagA i olika vävnader. Så effekten av EMT inducerad av H. pylori
fortfarande behövde undersökas ytterligare. MIR-21 främjade TGF-β-inducerad myofibroblast differentieringsprocess genom att rikta PDCD4. TGF-β-inducerad MIR-21 uttryck i fibroblaster och mir-183 nedreglerade PDCD4 och hämmade TGF-β-inducerad apoptos i humana hepatocellulära karcinomceller [41], [42]. Samtidigt TGF-β regleras snigel, TWIST, eller ZEB1 och påverkade EMT och metastaser [43]. Dessutom var PDCD4 befunnits vara involverade i transkription också. I själva verket var den COOH-terminalen av TWIST1 innehåller grundläggande helix-loop-helix domän föreslog att medierad direkt interaktion med PDCD4 proteiner. Så, PDCD4 interagerar med den DNA-bindande domänen av TWIST1 och hämmar dess DNA-bindande förmåga att rikta in gener i humana prostatacancerceller [22] .Därför, testade vi vidare om PDCD4 kunde reglera TWIST1 i gastriska cancerceller. Vår studie visade att TWIST1 ner reglerades av PDCD4 hög expressionsplasmid genom realtids-PCR och Western blotting, medan E-cadherin uttryck var motsatsen till TWIST1 i AGS, SGC-7901 och BGC-823. MRNA uttryck för SNIGEL var nedregleras i AGS och SGC-7901, medan preotein uttryck observerades inte samma förändringar. Det kan vara på grund av komplexiteten av proteinsyntes. Det vill säga, proteinet är inte bara regleras på transkriptionsnivå, utan även översättning och vända nivå. Det verkar ibland att mRNA är inte en direkt indikation på proteinnivå i celler. Slutligen genomförde vi ytterligare forskning om vilken roll PDCD4 i CagA-inducerad epitel-mesenkymala övergång. Gastriska epitelceller transfekterades med CagA expressionsplasmid och PDCD4 överuttryck plasmid samtidigt. Restaurering av PDCD4 uttryck kunde hämma TWIST1 och vimentin, och inducerar E-cadherin som regleras av CagA var PDCD4 också certifierad som skulle kunna påverka invasion och metastas förmåga gastric celler genom matrigel invasionsanalys. Även om ytterligare studier är nödvändiga för att testa denna hypotes, vi slutsatsen i princip att CagA-inducerad epitel-mesenkymala övergång är delvis beroende av att reglera PDCD4.

Sammanfattningsvis visar vi att H. pylori
CagA inducera TWIST1 uttryck och EMT i gastric cancerceller genom att reglera PDCD4 (Fig. 6). Vi erbjuder en inblick i den molekylära nätverk av magcancer inducerad av H. pylori
infektion, och leverera en teoretisk grund för PDCD4 som ett biologiskt mål för diagnos eller behandling av cancer. Framtida modeller forskning som avser mus kan leda till en bättre förståelse för den roll som PDCD4 i H. pylori
inducerad EMT av magcancer.

• PLOS ONE: MIR-30b, nedregleras i magcancer Främjar Apoptos och dämpar tumörtillväxt genom att rikta plasminogenaktivatorinhibitor-1
• PLOS ONE: Helicobacter pylori från Gastric Cancer och duodenalsår Visa Samma Phylogeographic ursprung i den andinska regionen i Colombia