PLOS ONE: Carnosine inhibe la prolifération des cellules gastriques humaines du cancer SGC-7901 à travers deux mitochondrial Respiration et Pathways glycolyse

Résumé

Carnosine, un dipeptide naturel, a été récemment démontré posséder une activité anti-tumorale. Cependant, son mécanisme sous-jacent est incertain. Dans cette étude, nous avons étudié l'effet et le mécanisme de carnosine sur la viabilité et la prolifération cellulaire du cancer gastrique humain cultivé des cellules SGC-7901. traitement Carnosine n'a pas induit l'apoptose des cellules ou une nécrose, mais a réduit la capacité de prolifération des cellules SGC-7901. l'analyse a montré Hippocampe CGS-7901 cellules cultivées avec du pyruvate ont mitochondrie active et dépendent de la phosphorylation oxydative mitochondriale plus de la voie de la glycolyse pour la production d'ATP. Carnosine nettement diminué la valeur absolue de la respiration mitochondriale d'ATP lié, et réduit la consommation d'oxygène maximale et la capacité respiratoire de secours, ce qui peut réduire la fonction mitochondriale en corrélation avec le potentiel prolifératif. En même temps, la carnosine a également réduit le taux d'acidification extracellulaire et la glycolyse des cellules SGC-7901. Nos résultats suggèrent que la carnosine est un régulateur potentiel du métabolisme énergétique des cellules SGC-7901 à la fois dans l'anaérobie et les voies aérobies, et ont fourni un indice pour l'évaluation préclinique et clinique de carnosine pour le traitement du cancer gastrique

Citation:. Shen Y, Yang J, Li J, Shi X, L Ouyang, Tian Y, et al. (2014) Carnosine inhibe la prolifération des cellules gastriques humaines du cancer SGC-7901 à travers deux mitochondrial Respiration et Pathways glycolyse. PLoS ONE 9 (8): e104632. doi: 10.1371 /journal.pone.0104632

Editeur: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Etats-Unis d'Amérique

Reçu le 14 Février 2014; Accepté: 15 Juillet 2014; Publié: 12 Août, 2014

Droit d'auteur: © 2014 Shen et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce projet a été soutenu par la national Natural science Foundation de Chine (81102427), et en partie pris en charge par les Fondations provincial du Zhejiang recherche scientifique (Y2110322), le Programme de Zhejiang Equipe Responsable du S & T innovation (2010R50048) et la ville de Wenzhou la science et de projet de technologie (2010S0094 ). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est l'une des tumeurs malignes les plus courantes dans le monde. Dans les pays en développement économique, le cancer gastrique est la deuxième cause de décès liés au cancer [1], [2]. En dépit de l'amélioration dans le traitement chirurgical et multimodal, le taux global de survie à 5 ans est encore faible (15% à 35%) en raison des taux élevés de récidive, l'invasion et les métastases [3]. Par conséquent, dans le présent, pour découvrir des médicaments plus efficaces anti-tumorales avec moins d'effets secondaires est nécessaire
.

L-Carnosine (β-alanyl-L-histidine) est un dipeptide naturel qui est synthétisé par carnosine endogène synthétase. Il est largement distribué dans le cerveau des mammifères, le muscle squelettique, de l'estomac, les reins, le coeur et la peau [4], [5]. Jusqu'à présent, pas beaucoup est connu au sujet de sa fonction physiologique, mais plusieurs rôles putatifs ont été considérés comme un neurotransmetteur, un agent anti-inflammatoire, anti-radicaux libres, tampon organique mobile pH et chélateur métallique [6], [7]. Il a été rapporté que la carnosine est un agent thérapeutique potentiel pour le traitement de la maladie d'Alzheimer, les accidents vasculaires cérébraux, de diabète et d'autres maladies des organes sensoriels [8], [9]. Tout récemment, il a été démontré que la carnosine peut aussi avoir un effet anti-tumorigènes. Par exemple, la carnosine a été rapporté pour posséder la capacité d'inhiber la croissance de gliomes malins [10], et cet effet peut être médiée par une influence sur le métabolisme énergétique de la glycolyse, le meilleur phénotype métabolique caractérisée observée dans les cellules tumorales, connues sous le nom d'effet Warburg [11 ], [12].

que le métabolisme mitochondrial acide récemment, l'importance des mitochondries que les capteurs d'oxygène ainsi que les producteurs de l'ATP est devenu un point focal de la recherche sur le cancer, et des études ont montré un phénomène important, en particulier citrique activité du cycle est important pour la prolifération rapide de plusieurs types [13], [14] cellulaires cancéreuses. Cependant, dans le cas des cellules cancéreuses gastriques humaines, peu d'informations sont disponibles dans quelle mesure la glycolyse et la phosphorylation oxydative mitochondriale (OXPHOS) contribuent à la production d'énergie cellulaire et la prolifération rapide. Si la carnosine peut également inhiber la croissance des cellules cancéreuses gastriques humaines reste inconnue. Et si l'effet inhibiteur de carnosine sur la croissance des cellules tumorales est également liée à son action sur la respiration mitochondriale et OXPHOS reste incertaine.

Récemment, le XF96 extracellulaires Flux Analyzer Seahorse Bioscience a été utilisé pour surveiller simultanément et continuellement à la fois la composants aérobies et glycolytiques de bioénergétique cellulaire [15]. Par conséquent, dans la présente étude, nous avons exploré les effets de carnosine sur la croissance des cellules cancéreuses gastriques humaines et de caractériser davantage le profil bioénergétique de culture gastrique cellule cancéreuse SGC-7901 humain et les rôles de carnosine dans le métabolisme des cellules de l'énergie SGC-7901 avec le Flux Analyzer Seahorse Bioscience XF96 extracellulaires et d'autres technologies connexes.

Matériel et méthodes

Réactifs

l-Carnosine, pyruvate de sodium, la roténone, carbonyl cyanure p-trifluorométhoxyphényl-hydrazone (FCCP), antimycine A, 3- [2-4,5-diméthylthiazol-yl] bromure (MTT), le méthanol, l'acide -2,5-diphenyltetra-zolium lactique étaient de Sigma (St. Louis, MO, USA). Pénicilline, streptomycine, L-glutamine, la trypsine, le milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), le sérum fœtal bovin était de GIBCO-BRL (Grand Island, NY, USA). Annexin V-FITC kit de détection de l'apoptose /PI, BCA Protein Assay Kit et ATP Assay Kit ont été achetés à Beyotime Institute of Biotechnology ((Nanjing, Chine). XF milieu d'essai et une solution de calibrant XF ont été achetés à Seahorse Bioscience.

culture cellulaire

lignée cellulaire de cancer gastrique SGC-7901 humain (SGC-7901), la ligne de foie humain de cellules de carcinome hépatocellulaire (HepG2) et C6 de rat lignée cellulaire de gliome (C6) ont été achetés à partir de la banque de cellules Institut de Shanghai, Académie chinoise des sciences (la source originale est American type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA, USA). les cellules ont été cultivées dans un milieu DMEM additionné de 10% de sérum de veau fœtal (FBS), 100 U /ml de pénicilline G, et 100 pg /ml de streptomycine, et maintenus à 37 ° C et 5% de CO _{2 dans un incubateur humidifié. Les cellules ont été traitées à la trypsine dans un rapport de 1:03 après la confluence en utilisant 0,25% de trypsine. repiquées cellules ont été ensemencées sur 96-, 24- ou des plaques 6 puits à des densités de 2 × 10 ^{3, 5 x 10 4, 2 x 10 5 ou 1 x 10 6 cellules /puits, respectivement}}

la réduction du MTT

cellule activité métabolique a été surveillée par le test colorimétrique MTT comme décrit précédemment [16]. En bref, les cellules ont été cultivées sur des plaques à 96 puits et il y avait 6 puits dans chaque groupe. A la fin des expériences, les cellules ont été incubées avec 0,5 mg /ml de MTT pendant 4 h à 37 ° C. Ensuite, la couche de surnageant a été enlevé et 100 pi de diméthylsulfoxyde ont été ajoutés dans chaque puits. le métabolisme du MTT a été quantifié par spectrophotométrie à 570 nm dans un lecteur de microplaques Biorad. Les résultats ont été exprimés en pourcentage de réduction du MTT, en prenant l'absorbance des cellules témoins à 100%.

colonie de test de formation

Des cellules ont été étalées dans des plaques à six puits à une densité de 100-200 cellules par puits, puis ont été traités avec la carnosine (20 mM). Les clones ont été laissées se développer pendant 14 jours dans un milieu de culture DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 100 U /ml de pénicilline G et 100 ug /ml de streptomycine. Les cellules ont ensuite été fixées avec 70% d'éthanol et colorées avec Coomassie Brilliant Blue pour l'analyse de la formation de colonies comme décrit précédemment [17].

cytométrie de flux de dosage de la mort cellulaire

La mort cellulaire a été quantifiée par Annexin V-FITC-PI (iodure de propidium) double coloration, en utilisant un kit de détection de l'apoptose Annexin V-FITC selon la suggestion du fabricant. En bref, les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 6 puits dans du milieu DMEM. Les cellules ont été traitées avec 20 mM carnosine pendant 48 heures, puis ont été recueillies et lavées deux fois dans du PBS glacé, on remet en suspension dans du tampon de liaison à une densité de 1 x 10 ^{6 cellules /ml. Les cellules ont été incubées simultanément avec marqué à la fluorescéine annexine V et PI pendant 20 minutes et analysées par cytométrie en flux. Annexine V-FITC a généré des signaux ont été détectés avec un détecteur de signal de FITC (FL1, 525 nm). signaux de PI ont été surveillés à l'aide d'un détecteur réservé à la phycoérythrine émission (FL2, 575 nm). Les données ont été analysées en utilisant le logiciel Cell Quest de BD.}

Pour mesurer le taux de consommation d'oxygène (OCR) et le taux d'acidification extracellulaire (ECAR) des cellules dans des conditions différentes, une Seahorse XF96
extracellulaires Flux Technology extracellulaires Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, Billerica, MA, USA) a été utilisé. Cet instrument permet la mesure sensible de la glycolyse et de multiples paramètres de la fonction mitochondriale, y compris basale OCR, la capacité respiratoire de secours, maximale OCR, ATP lié à la respiration et fuite de protons à partir de cellules cultivées intactes adhérentes. Après les mesures de base, l'OCR et ECAR ont été mesurés après l'addition séquentielle à chaque puits 20 pi d'oligomycine, la roténone et FCCP, pour atteindre des concentrations de travail de 1 pg /ml, 1 pM et 1 pM, respectivement. Tous les essais ont été effectués en utilisant une densité d'ensemencement de 10000 cellules /puits dans 200 ul de DMEM XF96 dans une culture cellulaire microplaques (Hippocampe Bioscience). Les cellules ont été passés à DMEM sans tampon complété avec du pyruvate de sodium 2 mM et 20 mM carnosine 1 h avant le début de l'essai et on maintient à 37 ° C. OCR est rapporté dans l'unité de picomoles par minute et ECAR est rapporté en unités milli-pH (MPH) par minute.

Détermination de la production d'ATP

Le test ATP a été réalisée selon le fabricant instruction. En bref, les cellules cultivées récoltées ont été lysées avec un tampon de lyse, puis par centrifugation à 10 000 x g pendant 2 min, à 4 ° C. Enfin, dans des plaques à 6 puits, le niveau d'ATP a été déterminée en mélangeant 20 pi du surnageant avec 100 pi de réactif à la luciférase, qui catalyse la production de lumière à partir d'ATP et de luciférine. La luminance a été mesurée par un lecteur de microplaques monochromateur. courbe standard a également été générée et la concentration en protéines de chaque groupe a été déterminée en utilisant le kit de dosage de protéine BCA. Les niveaux d'ATP totaux ont été exprimés en nmoles /mg de protéine.
analyse

HPLC de l'acide lactique extracellulaire

La concentration en acide lactique dans le surnageant exempt de cellules a été mesurée par chromatographie liquide à haute performance (HPLC ) associé à un détecteur d'ultraviolet en utilisant la technique décrite précédemment. En bref, les analysates préparés ont été séparés sur Ecosil C-18 inversé colonne (3 pm, 250 mm x 4,6 mm) à l'aide de solvant A et de solvant B [0,1 mol /l NH _{4H 2PO 4 ( pH 3,4), dilué v /v dans du methanol 97:3] avec un débit de 0,5 ml /min. La température de la colonne a été maintenue à 25 ° C, et la longueur d'onde de détection UV a été réglé à 210 nm.}

potentiel de membrane mitochondriale évaluation

Les changements dans la membrane mitochondriale par rapport potentiel (Δ
Ψ m) ont été évalués en utilisant la sonde cationique lipophile JC-1 5,5 ', 6,6'-tétrachloro-1,1', 3,3'-tétraéthyl-iodure benzamid azolocarbocyanine (JC-1; Les sondes moléculaires). Le colorant JC-1 subit un changement réversible de l'émission de fluorescence du vert à l'orange verdâtre Δ m augmente de Ψ. Les cellules à haute Δ forme Ψ
m JC-1 agrégats et fluorescence rouge; ceux à faible Δ Ψ
m contiennent monomère JC-1 et une fluorescence verte. Après traitement avec la carnosine pendant 48 h, le milieu de culture a été éliminé et les cellules sont cultivées sur des lamelles couvre-objet, ont été mis en incubation dans l'obscurité avec JC-1 à une concentration finale de 2 uM pendant 20 min. Les cellules ont été rincées avec du PBS deux fois et excité à 488 nm avec un microscope à fluorescence Olympus BX-51.

copie ADNmt mesure du nombre

Absolute ADNmt nombre de copies a été mesurée en comparant l'amplification par PCR d'une mitochondries amplicon [, chaîne oxydoréductase NADH-ubiquinone humaine 4 (ND4)] avec un amplicon nucléaire (humaines, β-actine) à partir d'ADN isolé en utilisant un kit Qiagen DNA mini. Les séquences des amorces sont les suivantes: β-actine humaine (avant: 5'-ACCCACACTGTGCC CATCTAC-3 ', à l'inverse: 5'-TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA-3'); ND4 humaine (forward: 5'-TCCTCCTATCCCTCAACCCC-3 ', à l'inverse: 5'-CACAATCTGATGTTTT GGTTAAAC-3'). des matrices d'ADN ont été faites des régions couvrant chaque amplicon par amplification par PCR. Dilutions de 1 × 10 ^{8 vers le bas à 1 × 10 2 copies de l'ADN isolé ont été utilisés pour générer une courbe standard pour la quantification. Les conditions de cyclage de PCR consistaient en une étape d'activation à 95 ° C pendant 30 secondes, suivi de 40 cycles de 5 secondes à 95 ° C et 30 secondes à 58 ° C. Tous les ACP ont été effectuées sur un système Bio-Rad CFX Gestionnaire PCR en temps réel (Biosciences appliquées).}

Analyse statistique

Toutes les données représentent trois expériences indépendantes. Les données ont été exprimées en moyenne ± écart-type. Les analyses statistiques ont été réalisées par SPSS 11.5 pour Windows. One-way ANOVA (analyse de variance), suivie par le LSD (différence significative) ou T3 de Dunnett post-hoc
test (où les écarts égaux ne sont pas pris en charge) a été appliqué pour des comparaisons multiples, alors que le test t de Student a été utilisé pour les comparaisons entre les deux groupes. P
< 0,05 a été considérée comme statistiquement significative

Effet de

Résultats de carnosine sur SGC-7901 la viabilité des cellules

Pour déterminer l'effet de carnosine sur. gastrique humaine cellules cancer SGC-7901 viabilité, MTT test de réduction a été utilisé. Les résultats ont montré que le traitement à la carnosine réduit significativement la viabilité cellulaire d'une manière en temps et dépendant de la concentration. Carnosine à des concentrations de 5 et 20 mM nettement réduit la viabilité des cellules à 84,0% et 57,9% de contrôle à 24 h, et à 73,5% et 45,9% de contrôle à 48 h, respectivement (Fig. 1A). Cependant, la carnosine à une concentration de 1 mM n'a pas affecté SGC-7901 la viabilité des cellules à 24 ou 48 h. Nous avons utilisé plus de cytométrie en flux pour analyser si carnosine peut provoquer une nécrose des cellules SGC-7901 ou de l'apoptose. De manière surprenante, les résultats montrent que le traitement de la carnosine pendant 48 heures n'a pas induit la mort des cellules nécrotiques ou apoptotiques dans les cellules CGT-7901 (Fig. 1B). Étant donné que la réduction du MTT est également interprété comme une indication de l'activité métabolique cellulaire et la valeur MTT d'une population de cellules est déterminée par le nombre de cellules viables présentes et leur taux métabolique relative, donc nous avons ensuite de calculer le nombre de cellules dans une expérience parallèle avec identiquement traités SGC-7901 cellules en utilisant la plaque de comptage de cellules. Nous avons constaté que le nombre de cellules dans la carnosine traitée pendant 48 h groupe était similaire à celui dans le groupe témoin (Fig. 1C), indiquant ainsi que la viabilité cellulaire réduite induite par un traitement à la carnosine pendant 48 h dans des cellules CGT-7901 est due à des changements métaboliques mais pas due à la mort cellulaire ou la prolifération cellulaire.

pour vérifier si ces actions de carnosine existent également dans d'autres cellules cancéreuses, les cellules HepG2 et les cellules C6 ont été utilisées. Les résultats ont montré que 20 mM de traitement carnosine pendant 48 heures n'a pas induit la mort cellulaire (voir le tableau. S1) ou de la prolifération, mais une diminution marquée de l'activité MTT réduit à la fois dans les cellules HepG2 et C6 (Fig. S1).

Traitement choronic avec carnosine inhibé SGC-7901 formation
cellules des colonies

pour examiner si l'exposition choronic à carnosine pourrait affecter la capacité de prolifération des cellules SGC-7901, les cellules ont été ensemencées à une faible densité (100-200 cellules /puits) et a permis de former des colonies pendant 14 jours dans du DMEM supplémenté avec 20 mM carnosine. Comme on le voit sur la Fig. 2, l'exposition choronic à la formation de colonies de carnosine réduit à 39,9% du contrôle.

Caractérisation bioénergétique des cellules SGC-7901 cultivées

Nous avons étudié les OCRs et ECAR dans les cellules SGC-7901 cultivées en utilisant un Seahorse XF-96 analyseur de flux extracellulaire, comme décrit précédemment [18]. OCR cellulaire basale et ECAR ont été jugées 161,02 ± 29,58 pmol /min pour 10 × 10 ^{3 cellules (comptage cellulaire initiale), et 39,31 ± 4,29 mpH /min pour 10 × 10 3 cellules, respectivement (Fig. 3A). La respiration ATP lié (le taux basal total moins le taux d'oligomycine, où oligomycine est un inhibiteur de la synthèse de l'ATP) était de 96,15 ± 18,34 pmol /min pour 10 x 10 3 cellules, ce qui indique que -60% d'oxygène cellulaire la consommation est liée à la synthèse d'ATP. Simultanément ECAR a été porté à ~ 250% du taux de base en présence d'une dose efficace maximale de oligomycine (1 pg /ml), ce qui indique que les cellules déplacées à la respiration mitochondriale glycolyse. Roténone (1 uM) a réduit l'OCR pour 55,78 ± 8,86 pmol /min pour 10 × 10 3 cellules (~35% des taux de base). Le taux de roténone résistant reflète le taux de respiration mitochondriale non, qui comprend l'oxydation du substrat et de la consommation d'oxygène de la surface cellulaire [19]. Ainsi, la respiration non-mitochondrial représentait ~35%, alors que la respiration mitochondriale représentait ~65% de la respiration cellulaire totale. Ainsi, dans les cellules cultivées CGT-7901 ~92% (60% /65%) de la respiration mitochondriale a été couplé à la synthèse d'ATP et ~ 8% de la respiration mitochondriale a été comptabilisée par fuite de protons (Fig. 3B). En présence d'une dose efficace maximale de la FCCP (1 uM, un agent de désolidarisation qui permet le transport d'électrons maximale,), on a observé une augmentation concomitante de l'OCR, et il a été augmentée à 204 ± 30,24 pmol /min par 10 × 10 3 cellules.}

Nous avons également évalué la contribution relative de la glycolyse et OXPHOS du taux de production d'ATP dans les cellules SGC-7901. quantifications absolue des deux le taux glycolyse et le taux de consommation d'oxygène oligomycine sensibles ont été mesurés dans les cellules SGC-7901. Le taux d'acidification extracellulaire est principalement due à lactate et de la production de bicarbonate et, lorsqu'il est étalonné le taux de production de protons, indique le taux glycolyse [15]. Ainsi, nous avons utilisé oxamate pour inhiber la lactate déshydrogénase, qui convertit le pyruvate en lactate au cours de la dernière étape de la glycolyse, pour calculer le taux de production du proton (Fig. 3C). Il existe une relation un-à-un entre le taux de production de lactate et le taux de production d'ATP à partir de la glycolyse. La consommation d'oxygène oligomycine sensible a été converti en le taux de production d'ATP en utilisant un rapport P /O de 2,3 [20]. Les résultats ont montré que les cellules SGC-7901 cultivées en DMEM (riche en glucose) complété avec du pyruvate 2 mM fait au moins 93% de leur ATP en utilisant OXPHOS (Fig. 3D).

Carnosine a changé la caractérisation bioénergétique de SGC- 7901 cellules

Nous avons étudié les effets de carnosine sur le taux de consommation d'oxygène et le taux d'acidification extracellulaire dans les cellules SGC-7901 cultivées. Les résultats de la Fig. 4 a montré que le traitement avec 20 mM carnosine pendant 48 h réduit le OCR basale et ECAR à 141,13 ± 27,06 pmol /min pour 10 × 10 ^{3 cellules (~87% du contrôle), et 11,32 ± 2,49 mpH /min par 10 × 10 3 cellules (~27% du contrôle), respectivement (Fig. 4A, B). La respiration ATP liée, fuite de protons, et le taux de respiration non-mitochondrial étaient 81,03 ± 17,97, 7,15 ± 3,6 et 52,96 ± 8,40 pmol /min pour 10 × 10 3 cellules, respectivement (Fig. 4C, D, E ). Ainsi, dans les cellules traitées carnosine CGS-7901, la respiration mitochondriale a représenté ~62% de la respiration cellulaire totale et ~92% (57% /62%) de la respiration mitochondriale a été couplé à la synthèse de l'ATP, et ~ 8% de la respiration mitochondriale était représenté par fuite de protons. Par conséquent, le traitement de carnosine a diminué la valeur absolue de la respiration ATP lié, mais il n'a pas influencé le taux de contribution relative de la respiration ATP liée, fuite de protons, et la respiration mitochondriale non à la respiration cellulaire total. En outre, nous avons également constaté que le traitement de carnosine nettement réduit la capacité respiratoire maximale OCR et de secours à 161,60 ± 28,46 pmol /min pour 10 × 10 3 cellules (~79% du contrôle) et 20,47 ± 6,92 pmol /min pour 10 × 10 3 cellules (~47% du contrôle) (Fig. 4F, G).}

cellules HepG2 et C6 ont également été utilisés pour vérifier davantage les effets de carnosine sur le métabolisme des cellules cancéreuses de l'énergie. Les résultats ont montré que 20 mM de traitement carnosine pendant 48 h nettement réduit l'OCR de base et ECAR des cellules HepG2 et C6, respectivement. addition carnosine a également réduit la respiration liée à l'ATP dans les cellules C6, mais pas dans les cellules HepG2 (Fig. S2). Cependant mM carnosine 20 nettement réduit la teneur en ATP cellulaire à la fois dans les cellules HepG2 et C6, ce qui indique que l'inhibition de la glycolyse a été impliqué dans l'action de la carnosine, au moins dans les cellules HepG2 (fig. S2J).
D'acide lactique extracellulaire

carnosine diminué niveau de culture SGC-7901 cellules

Parce que carnosine est un tampon de pH organique mobile, le taux d'acidification extracellulaire dosé dans le présent de carnosine utilisant le XF96 extracellulaires Flux Analyzer Seahorse peut ne pas refléter le taux de glycolyse réel. Donc, nous avons également utilisé HPLC pour doser le niveau d'acide lactique extracellulaire pour vérifier l'effet de carnosine sur la glycolyse dans les cellules SGC-7901. Nos résultats ont montré que le traitement à la carnosine réduit significativement le taux d'acide lactique extracellulaire à 84% du témoin (fig. 5), ce qui indique que la carnosine a un effet inhibiteur potentiel sur la glycolyse dans les cellules CGT-7901 en culture.

carnosine a changé le contribution relative de la glycolyse et OXPHOS à la charge de l'ATP dans les cellules SGC-7901 cultivées en DMEM absence de pyruvate

Nous avons également caractérisé l'effet de carnosine sur les changements de teneur en ATP et la contribution relative de la glycolyse et OXPHOS à la charge ATP dans les cellules SGC-7901 cultivées en DMEM absence de pyruvate. Nous avons mesuré la concentration cellulaire ATP dans les cellules exposées pendant 45 min à six conditions: véhicule, l'inhibiteur de la glycolyse 2-DG, FCCP, roténone, FCCP, plus roténone, et 2-DG, plus FCCP, plus roténone. Nous avons constaté que le traitement de carnosine pendant 48 h significativement réduit la teneur en ATP à 62% du contrôle. traitement 2-DG nettement réduit la teneur en ATP de 48% et 34% dans les groupes absents et carnosine présents carnosine par rapport à leurs propres groupes de véhicules, respectivement. FCCP et FCCP ainsi roténone chacun ont également réduit de manière significative la teneur en ATP de 15% et 18% dans le groupe absent de carnosine. Toutefois, ces médicaments ne portent pas atteinte à la teneur en ATP en carnosine présente groupe. Roténone n'a pas d'incidence sur la teneur en ATP à la fois dans les groupes absents ou présents carnosine. 2-DG en combinaison avec FCCP et roténone essentiellement éliminé la production d'ATP à la fois dans ces deux groupes (Fig. 6). Ainsi 2-DG a diminué ATP demander plus que FCCP ou roténone a fait dans carnosine groupes absents et présents. Ces données indiquent que les changements de génération d'ATP de OXPHOS à glycolyse lorsque la fonction mitochondriale est altérée. frais ATP est pas entièrement maintenue après l'inhibition de la glycolyse ou soit la fonction mitochondriale dans le groupe absent de carnosine, alors que la charge ATP est maintenue après l'inhibition de la fonction mitochondriale en carnosine présente groupe. Ainsi, le traitement de carnosine modifié la contribution relative des OXPHOS et de la glycolyse dans le taux de production d'ATP dans les cellules SGC-7901.

Effet de pyruvate sur l'action inhibitrice de carnosine sur les cellules SGC-7901 la fonction mitochondriale

Afin de déterminer si l'augmentation du niveau de pyruvate peut inverser l'effet inhibiteur de la carnosine sur la respiration mitochondriale des cellules CGS-7901, les cellules ont été exposées à différentes concentrations de pyruvate. Comme on le voit dans le tableau. 1, l'augmentation du niveau de pyruvate n'a pas pu inverser l'effet inhibiteur de carnosine sur les cellules SGC-7901 respiration mitochondriale. En outre, l'essai MTT a également montré que l'augmentation du niveau de pyruvate n'a pas pu inverser l'action de la carnosine sur les cellules CGT-7901 métabolisme mitochondrial (fig. 7).

Effets de carnosine sur la teneur en ADN mitochondrial et le potentiel de la membrane mitochondriale dans SGC-7901 cellules

membrane mitochondriale potentiel (Δ Ψ
m) représente la majorité de la force proton-motrice utilisée pour entraîner la synthèse de l'ATP et a donc un rôle important dans l'ATP maximal capacité générant [21]. Par conséquent, nous avons également utilisé la sonde cationique lipophile JC-1 pour déterminer si la carnosine supprime la phosphorylation oxydative par la suppression du potentiel de la membrane mitochondriale (Δ
Ψ m). Les résultats ont montré que le traitement de la carnosine pendant 48 heures n'a pas pu induire une altération évidente de Δ Ψ m
dans les cellules cultivées CGT-7901 (Fig. 8A).

Pour remédier à la diminution de la respiration mitochondriale apparemment induite par carnosine, nous avons également quantifié l'ADN mitochondrial (ADNmt) nombre absolu, qui est étroitement régulée pour maintenir les besoins en énergie cellulaire [22]. A notre grande surprise, les résultats ont révélé que par rapport aux cellules de contrôle, les ADNmt absolus le nombre de copies de cellules carnosine traitées 7901 ont augmenté de façon marquée, et les ADNmt moyennes absolues nombre de copies étaient 141,49 ± 7,42 dans les cellules de contrôle et de 360,0 ± 59,84 dans la carnosine cellules traités par (Fig. 8B).

Discussion

à notre connaissance, ceci est le premier rapport du profil bioénergétique des cellules SGC-7901 cultivées traitées avec et sans carnosine. Nos principales conclusions sont les suivantes. Tout d'abord, carnosine réduit la capacité proliférative des cellules SGC-7901. Deuxièmement, les cellules cultivées en DMEM (glucose élevé) additionné de 2 mM pyruvate fait ~93% de leur ATP en utilisant OXPHOS. En troisième lieu, la carnosine exerce son effet inhibiteur sur SGC-7901 prolifération des cellules en inhibant la glycolyse et la phosphorylation oxydative de la respiration mitochondriale des cellules, et ces actions de carnosine ont également été trouvées dans les cellules HepG2 et C6. Ainsi, la carnosine doit être pris en compte avec l'armement croissant de composés à divers stades de développement de médicaments ciblant le métabolisme de la tumeur, l'une des caractéristiques clés de la tumeur [23].

En raison de son large spectre d'activité, carnosine considerded peut être un facteur thérapeutique dans le traitement de nombreuses maladies. Par exemple, le zinc Carnosine a été utilisé pour la santé gastrique et intestinale réparation [24]. des cellules récemment, des études ont montré transformées ne croissent dans du MEM contenant des concentrations élevées de carnosine et carnosine peuvent être administrés sous la forme d'un médicament in vivo pour inhiber la croissance des cellules malignes [25]. Cependant, il fallait se demander si carnosine peut empêcher la croissance des cellules tumorales gastriques humaines en plus des cellules malignes qui ont été rapportés précédemment. Dans la présente étude, nous avons constaté que la carnosine est également capable d'inhiber la croissance des cellules SGC-7901 cultivées de manière temps et liée à la concentration, et cet effet n'a pas été accompagnée par apoptose ou une nécrose, mais peut être plutôt causé par la réduction prolifération. Cependant, les mécanismes détaillés sous-tendent l'effet inhibiteur de carnosine sur SGC-7901 la prolifération des cellules sont encore peu claires.

Il est largement admis que les changements métaboliques sont l'une des caractéristiques du cancer. Otto Warburg a décrit d'abord l'utilisation accrue du métabolisme anaérobie en présence d'oxygène suffisante par les cellules cancéreuses par rapport à leurs contreparties normales: appelé «l'effet Warburg« [26]. Toutefois, récemment, il a été souligné que le ciblage moléculaire de OXPHOS peut avoir une efficacité pour le mélanome avancé qui ont des niveaux élevés de OXPHOS [14]. Ainsi, différents types de tumeurs sur leurs stades de développement différents ont leurs propres caractéristiques métaboliques. Par conséquent, les stratégies et les mécanismes de traitement différent des tumeurs basées sur le métabolisme énergétique thérapeutiques sont différents. Dans la présente étude, nous avons utilisé d'abord une technologie de flux extracellulaire nouvelle pour évaluer plusieurs paramètres de la fonction mitochondriale et le taux d'acidification extracellulaire en parallèle avec la détermination de la concentration d'ATP pour explorer la caractérisation bioénergétique des cellules SGC-7901 de cancer gastrique humain. Notre analyse Seahorse a montré des cellules SGC-7901 ont mitochondries actif, et dépendent de OXPHOS mitochondriales plus que les voies de la glycolyse pour la production d'ATP dans les conditions de culture avec une grande glucose et pyruvate, ce qui suggère que la respiration mitochondriale peut être une cible thérapeutique potentielle dans le cancer gastrique humain.

Cependant, lorsque les cellules ont été cultivées dans du DMEM absence de pyruvate, ils dépendent de la glycolyse plus que cultivées dans du DMEM fourni avec 2 mM de pyruvate, car l'inhibition de la glycolyse par le 2-DG conduisant à une baisse de ~48 % teneur en ATP cellulaire. De plus, ces données indiquent également que les cellules CGT-7901 manquent probablement plasticité lors de la commutation de la glycolyse à la respiration mitochondriale lors de la production d'ATP glycolytique est abolie dans les conditions de culture manque de substances énergétiques. D'autre part, Wu et al
. ont signalé qu'il y avait une surexpression compensatoire efficace de glycolyse après l'administration de oligomycine pour bloquer la phosphorylation oxydative, et cette réponse a pu maintenir le niveau d'ATP dans les non-petites lignées de cellules de carcinome de cellules humaines H460 et A549 [15]. Nos résultats ont également montré que les cellules SGC-7901 ont la capacité d'augmenter la glycolyse lorsque la fonction mitochondriale est bloquée par oligomycine. En outre, lorsque la fonction mitochondriale a été supprimée par la roténone, une régulation positive compensatoire efficace de la glycolyse a été accurred, et cette réponse a pu maintenir le niveau d'ATP dans les cellules SGC-7901. Cependant, les cellules ne pouvaient réguler positivement la capacité suffisante de la glycolyse pour maintenir le niveau de l'ATP pour le désaccouplement de la respiration mitochondriale de la synthèse d'ATP induite par FCCP, (fig. 6). Par conséquent, les cellules SGC-7901 possèdent la glycolyse importante et la capacité de respartion mitochondrial, et il rend les cellules se développent dans des conditions différentes.

Tout récemment, il a été démontré que la carnosine réduit la prolifération de gliome malin par une influence sur la glycolyse et de l'ATP synthèse [27]. Dans notre étude, nous avons également constaté que le traitement avec carnosine était capable de diminuer le taux d'acidification extracellulaire et le niveau d'acide lactique, ce qui indique que la carnosine a un effet inhibiteur sur la glycolyse dans les cellules SGC-7901. Cependant, la carnosine n'a pas complètement, mais la capacité de la glycolyse partiellement inhibée des cellules, car l'inhibition pharmacologique de la respiration mitochondriale par la roténone, ou désaccoupler le gradient de protons mitochondrial provenant de la production d'ATP par FCCP, ou traité avec la roténone et FCCP simultanément, les cellules étaient toujours en mesure à upregulate glycolyse pour compenser l'épuisement de l'ATP (Fig. 6). Chose intéressante, on a trouvé que la carnosine possède également un nouveau rôle en tant que régulateur de la respiration mitochondriale. Carnosine supprimé niveaux de base de la respiration mitochondriale, ce qui est principalement due à la respiration ATP liée a diminué, ce qui indique que les mitochondries ATP diminue la production dans les cellules SGC-7901 carnosine-traitée.

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