PLOS ONE: Carnosina inibe a proliferação de células cancerosas gástrico humano SGC-7901 através de ambos os da respiração mitocondrial e glicólise Pathways

Abstract

A carnosina, um dipeptídeo que ocorre naturalmente, foi recentemente demonstrado possuir propriedades anti-tumoral atividade. No entanto, o mecanismo subjacente não é clara. Neste estudo, foram investigados os efeitos e o mecanismo de carnosina na viabilidade celular e a proliferação do cancro gástrico humano cultivadas células SGC-7901. tratamento carnosina não induziu apoptose celular ou necrose, mas reduziu a capacidade proliferativa das células SGC-7901. A análise mostrou cavalo marinho SGC-7901 células cultivadas com piruvato têm mitocôndria activa, e dependem de fosforilação oxidativa mitocondrial mais do que via da glicólise para produção de ATP. Carnosina diminui acentuadamente o valor absoluto da respiração ligada ao ATP mitocondrial, e reduziu o consumo máximo de oxigênio e capacidade respiratória de reposição, o que pode reduzir a função mitocondrial correlacionada com potencial proliferativo. Simultaneamente, carnosina também reduziu a taxa de acidificação extracelular e glicólise de células SGC-7901. Os nossos resultados sugerem que a carnosina é um potencial regulador de metabolismo energético das células SGC-7901, tanto na anaeróbias e aeróbias vias, e fornecida uma pista para a avaliação pré-clínica e clínica de carnosina para a terapia do cancro gástrico

citação:. Shen Y, Yang J, Li J., Shi X, L Ouyang, Tian Y, et al. (2014) Carnosina inibe a proliferação de células cancerosas gástrico humano SGC-7901 através de ambos os da respiração mitocondrial e Glicólise Pathways. PLoS ONE 9 (8): e104632. doi: 10.1371 /journal.pone.0104632

editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 14 de fevereiro de 2014; Aceito: 15 de julho de 2014; Publicação: 12 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Shen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto foi apoiado pelo National Natural Science Foundation da China (81102427), e em parte apoiada por fundações Zhejiang Provincial de investigação científica (Y2110322), o Programa de Zhejiang equipe de liderança de S & T Inovação (2010R50048) e Wenzhou Cidade da Ciência e Tecnologia Projeto (2010S0094 ). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é um dos tumores malignos mais comuns no mundo. Nos países economicamente em desenvolvimento, o câncer gástrico é a segunda causa de morte relacionada ao câncer [1], [2]. Apesar da melhoria na terapia cirúrgica e multimodal, a taxa de sobrevida global em 5 anos ainda é baixa (15% a 35%) por causa das altas taxas de recorrência, invasão e metástase [3]. Portanto, no presente, para descobrir fármacos mais eficazes anti-tumorais com menos efeitos secundários é necessário.

L-carnosina (β-alanil-L-histidina) é um dipeptídeo de ocorrência natural que é sintetizado pela carnosina endógena sintetase. É amplamente distribuído no cérebro dos mamíferos, músculo esquelético, estômago, rins, coração e pele [4], [5]. Até o momento, não se sabe muito sobre sua função fisiológica, mas vários papéis putativos foram consideradas, como neurotransmissor, agente anti-inflamatório, limpador de radicais livres, pH orgânica móvel e quelante de metais [6], [7]. Tem sido relatado que a carnosina é um agente terapêutico potencial para o tratamento da doença de Alzheimer, acidente vascular cerebral, diabetes e outras doenças dos órgãos dos sentidos [8], [9]. Recentemente, foi demonstrado que a carnosina também podem ter um efeito anti-tumorigénica. Por exemplo, a carnosina tem sido relatado possuir a capacidade de inibir o crescimento de gliomas malignos [10], e este efeito pode ser mediado por uma influência sobre o metabolismo energético glicolítico, o melhor fenótipo metabólica caracterizada observada em células de tumor, conhecido como efeito Warburg [11 ], [12].

recentemente, a importância das mitocôndrias como sensores de oxigênio, bem como produtores de ATP tornou-se um ponto focal da pesquisa do câncer, e estudos mostraram um fenômeno importante que o metabolismo mitocondrial, particularmente ácido cítrico actividade do ciclo é importante para a rápida proliferação de vários tipos de células do cancro [13], [14]. No entanto, no caso de células de cancro gástrico humano, pouca informação disponível até que ponto a glicólise e a fosforilação oxidativa mitocondrial (FOX) contribuir para a produção de energia celular e proliferação rápida. Se a carnosina também podem inibir o crescimento de células de cancro gástrico humano permanece desconhecida. E se o efeito inibidor da carnosina no crescimento células tumorais também está relacionado com a sua acção sobre a respiração mitocondrial e OXPHOS permanece obscuro.

Recentemente, o Seahorse Bioscience XF96 Extracelular Flux Analyzer tem sido usada para monitorar simultaneamente e continuamente tanto a componentes aeróbios e glicolíticas de bioenergética celular [15]. Portanto, no presente estudo, exploramos os efeitos da carnosina no crescimento de células de cancro gástrico humano e para caracterizar ainda mais o perfil bioenergética da célula cancerosa SGC-7901 gástrico humano cultivadas e os papéis de carnosina no metabolismo de células de energia SGC-7901 com Seahorse Bioscience XF96 extracelular Flux Analyzer e outras tecnologias relacionadas.

Materiais e Métodos

Reagentes

L-carnosina, piruvato de sódio, rotenona, carbonil cianeto de p-trifluorometoxifenil-hidrazona (FCCP), antimicina A, 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-diphenyltetra-zolium brometo (MTT), metanol, ácido láctico eram da Sigma (St. Louis, MO, EUA). A penicilina, estreptomicina, L-glutamina, tripsina, meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), soro fetal de bovino eram de GIBCO-BRL (Grand Island, NY, EUA). Anexina V-FITC kit de detecção de apoptose /PI, BCA Kit de ensaio de proteína e ATP Assay Kit foram comprados de Beyotime Instituto de Biotecnologia ((Nanjing, China). Meio de ensaio XF e solução de calibração XF foram comprados de Seahorse Bioscience.

cultura celular

humano linha celular de cancro gástrico SGC-7901 (SGC-7901), linha celular do fígado humano carcinoma hepatocelular (HepG2) e a linha de células de glioma C6 de rato (C6) foram adquiridos a partir do banco de células de Shanghai Institute, Academia chinesa de Ciências (a fonte original é a American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA, EUA). as células foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 U /ml de penicilina G, e 100 ug /mL de estreptomicina, e mantidas a 37 ° C e 5% de CO _{2 numa incubadora humidificada. As células foram tratadas com tripsina em uma proporção de 01:03 após a confluência utilizando tripsina a 0,25%. As células foram subcultivadas semeadas em 96-, 24- ou placas de 6 poços a densidades de 2 × 10 ^{3, 5 × 10 4, 2 × 10 5 ou 1 × 10 6 células /poço, respectivamente.}}

redução do MTT ensaio

a actividade metabólica das células foi monitorada pelo ensaio de MTT colorimétrico tal como descrito anteriormente [16]. Resumidamente, as células foram cultivadas em placas de 96 poços e foram 6 poços em cada grupo. No final das experiências, as células foram incubadas com 0,5 mg /mL de MTT durante 4 horas a 37 ° C. Em seguida, a camada sobrenadante foi removida, e 100 mL de sulfóxido de dimetilo foi adicionado em cada poço. metabolismo de MTT foi quantificado espectrofotometricamente a 570 nm num leitor de microplacas BioRad. Os resultados foram expressos como a percentagem de redução de MTT, tendo a absorvência de células de controlo como 100%.

Colónia ensaio de formação de

As células foram plaqueadas em placas de seis poços a uma densidade de 100-200 células por poço, e depois foram tratados com carnosina (20 mM). Os clones foram deixadas a crescer durante 14 dias em meio de cultura DMEM suplementado com 10% de FBS, 100 U /ml de penicilina G, e 100 ug /ml de estreptomicina. As células foram subsequentemente fixadas com 70% de etanol e coradas com Azul Brilhante de Coomassie para a análise da formação de colónias, tal como descrito anteriormente [17].

de citometria de fluxo de ensaio de morte celular

A morte celular foi quantificada por Anexina V-FITC-PI (iodeto de propídio) dupla marcação, utilizando um kit de detecção de apoptose anexina V-FITC de acordo com a sugestão do fabricante. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 6 poços em meio DMEM. As células foram tratadas com 20 mM de carnosina por 48 h, e, em seguida, foram recolhidas e lavadas duas vezes em PBS gelado, ressuspensas em tampão de ligação, a uma densidade de 1 x 10 ^{6 células /ml. As células foram incubadas simultaneamente com marcado com fluoresceína Anexina V e PI, durante 20 min e analisadas por citometria de fluxo. Anexina V-FITC gerados sinais foram detectados com um detector de sinal de FITC (FL1, 525 nm). sinais PI foram monitorados através de um detector reservado para emissão ficoeritrina (FL2, 575 nm). Os dados foram analisados ​​usando o software celular Busca de BD.}

Extracelular Tecnologia Flux

Para medir a taxa de consumo de oxigênio (OCR) e taxa de acidificação extracelular (ECAR) de células em condições diferentes, uma Seahorse XF96 Fluxo extracelular Analyzer (cavalo marinho Bioscience, Billerica, MA, EUA) foi utilizado. Este instrumento permite a medição sensível da glicólise e vários parâmetros da função mitocondrial, incluindo basal OCR, capacidade respiratória livre, máxima OCR, vazamento de respiração e de protões ATP ligada a partir de células cultivadas intactas aderentes. Após as medições da linha de base, o OCR e ECAR foram medidos depois de adicionar sequencialmente a cada poço 20 ul de oligomicina, FCCP e rotenona, para atingir concentrações de trabalho de 1 mg /ml, 1 uM e 1 uM, respectivamente. Todos os ensaios foram realizados utilizando uma densidade de sementeira de 10000 células /poço em 200 ul de DMEM numa microplaca de cultura de células XF96 (cavalo marinho Bioscience). As células foram transferidas para DMEM tamponado suplementado com piruvato de sódio 2 mM e 20 mM de carnosina 1 h antes do início do ensaio e mantida a 37 ° C. OCR é relatado na unidade de picomoles por minuto e ECAR é relatada em unidades de mili-pH (mph) por minuto.

Determinação da produção do ATP

O ensaio de ATP foi realizada de acordo com o fabricante do instrução. Resumidamente, células cultivadas colhidas foram lisadas com um tampão de lise, seguido por centrifugação a 10.000 x g durante 2 min, a 4 ° C. Finalmente, em placas de 6 poços, o nível de ATP foi determinada por mistura de 20 uL do sobrenadante com 100 uL de reagente de luciferase, que catalisou a produção de luz a partir de ATP e luciferina. Luminância foi medida por um leitor de microplacas monocromador. curva padrão foi também gerado e a concentração de proteína de cada grupo foi determinada utilizando o kit de ensaio de proteína BCA. Os níveis totais de ATP foram expressos como proteínas nmol /mg.
análise

HPLC de ácido láctico extracelular

A concentração de ácido láctico no sobrenadante isento de células foi medida por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC ) combinado com um detector de ultravioleta utilizando a técnica como descrito anteriormente. Em resumo, os analysates preparadas foram separados em ECOSIL reversa C-18 de coluna (3? M, de 250 mm × 4,6 mm) utilizando solvente A e o solvente B [0,1 mol /L NH _{4H 2 PO? 4 ( pH 3,4) diluídos v /v em metanol 97:3] com uma taxa de fluxo de 0,5 ml /min. A temperatura da coluna foi mantida a 25 ° C, e o comprimento de onda de detecção de UV foi regulado para 210 nm.}

potencial de membrana mitocondrial avaliação

As alterações na membrana mitocondrial potencial relativo (Δ Ψ
m) foram avaliados utilizando a sonda catiônica lipofílico JC-1 5,5 ', 6,6'-tetra-cloro-1,1', 3,3'-tetraetila benzamida iodeto de azolocarbocyanine (JC-1; molecular Probes). O corante JC-1 sofre uma mudança reversível em emissão de fluorescência de verde para laranja esverdeado como Δ ip
m aumenta. As células com alta Δ Ψ
m forma JC-1 agregados e fluorescência vermelha; aqueles com baixa Δ Ψ
m conter monomérica JC-1 e fluorescência verde. Após o tratamento com carnosina, durante 48 h, o meio de cultura foi removido e as células, cultivadas em lamelas foram incubadas no escuro com JC-1 a uma concentração final de 2 ^ M durante 20 min. As células foram lavadas com PBS duas vezes e animado a 488 nm com um microscópio de fluorescência Olympus BX-51.

cópia MtDNA medição do número de

mtDNA Absolute cópia número foi medida comparando a amplificação por PCR de uma mitocôndria amplicão [humana, cadeia NADH oxidoredutase ubiquinona-4 (ND4)] com um amplicão nuclear (humano, β-actina) a partir de ADN isolado utilizando um kit Qiagen de ADN de mini. As sequências dos iniciadores são como se segue: humano β-actina (para a frente: 5'-ACCCACACTGTGCC CATCTAC-3 '; reverso: 5'-TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA-3'); ND4 humano (para a frente: 5'-TCCTCCTATCCCTCAACCCC-3 '; reverso: 5'-CACAATCTGATGTTTT GGTTAAAC-3'). moldes de ADN foram feitas de regiões que medem cada fragmento amplificado por amplificação por PCR. As diluições de 1 × 10 ^{8 para baixo para 1 × 10 2 cópias do ADN isolado foram usadas para gerar uma curva padrão para quantificação. As condições dos ciclos de PCR consistiu de um passo de activação a 95 ° C durante 30 seg, seguido de 40 ciclos de 5 segundos a 95 ° C e 30 segundos a 58 ° C. Todos os PCRs foram realizados em um CFX Gestor Real-Time PCR System Bio-Rad (Biociências Aplicadas).}

Análise Estatística

Todos os dados representam três ou mais experiências independentes. Os dados foram expressos como média ± SD. As análises estatísticas foram realizadas pelo SPSS 11.5 for Windows. One-way ANOVA (análise de variância), seguido por LSD (diferença mínima significativa) ou T3 de Dunnett post-hoc
teste (onde variâncias iguais não foram assumidos) foi aplicada para comparações múltiplas, enquanto que o teste t de Student foi utilizada para comparação entre dois grupos. P Art < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

Efeito da carnosina no SGC-7901 células viabilidade

Para determinar o efeito da carnosina na. gástrica viabilidade células cancerosas SGC-7901 humano, foi usado ensaio de redução MTT. Os resultados mostraram que o tratamento de carnosina reduz significativamente a viabilidade celular de uma forma tempo e dependente da concentração. A carnosina em concentrações de 5 e 20 mM marcadamente reduzida viabilidade das células de 84,0% e 57,9% do controlo a 24 h, e de 73,5% e 45,9% do controlo a 48 h, respectivamente (Fig. 1A). No entanto, a carnosina em concentração de 1 mM não afecta SGC-7901 a viabilidade das células em 24 ou 48 h. Utilizou-se citometria de fluxo adicional para ensaiar se carnosina poderia causar necrose celular SGC-7901 ou apoptose. Surpreendentemente, os resultados mostraram que o tratamento durante 48 h carnosina não induzir a morte celular por necrose ou por apoptose em células SGC-7901 (Fig. 1B). Porque redução do MTT, também é interpretado como indicativo da actividade metabólica celular, e o valor de MTT de uma população de células é determinada tanto pelo número de células viáveis ​​presentes e as suas taxas metabólicas relativas, de modo que ao lado para calcular o número de células numa experiência paralela com células SGC-7901 identicamente tratados usando placa de contagem das células. Verificou-se que o número de células em carnosina tratadas durante 48 h grupo era semelhante ao do grupo de controlo (Fig. 1C), indicando que a viabilidade celular reduzida induzida pelo tratamento carnosina durante 48 h em células SGC-7901 foi devido a alterações metabólicas mas não devido à morte celular ou proliferação celular.

para verificar se essas ações de carnosina também existem em outras células cancerosas, foram utilizados HepG2 e células C6. Os resultados mostraram que 20 mM de carnosina tratamento durante 48 h não induzir a morte celular (Tabela. S1) ou proliferação, mas marcadamente reduzida actividade de redução de MTT tanto em células HepG2 e C6 (Fig. S1).

tratamento Choronic com carnosina inibida SGC-7901 formação de colónias de células

para examinar se a exposição a carnosina choronic poderia afectar a capacidade proliferativa de células SGC-7901, as células foram semeadas a uma densidade baixa (100-200 células /poço) e deixa-se formar colónias durante 14 dias em DMEM suplementado com 20 mM de carnosina. Como mostrado na Fig. 2, a exposição choronic à formação de carnosina reduzida colônias para 39,9% do controle.

Caracterização bioenergética de células SGC-7901 cultivadas

Nós investigamos os OCRs e ECAR em células SGC-7901 cultivadas utilizando um Seahorse XF-96 analisador de fluxo extracelular, tal como descrito anteriormente [18]. OCR celular basal e ECAR foram encontrados para ser 161,02 ± 29,58 pmol /min por 10 × 10 ^{3 células (contagem de células inicial), e 39,31 ± 4,29 mph /min por 10 × 10 3 células, respectivamente (Fig. 3A). A respiração ATP ligado (a taxa basal total menos a taxa com oligomicina, onde oligomicina é um inibidor da síntese de ATP) foi 96,15 ± 18,34 pmol /min por 10 × 10 3 células, indicando que ~ 60% de oxigénio celular consumo foi relacionada com a síntese de ATP. Simultaneamente ECAR foi aumentada para -250% das taxas da linha de base na presença de dose máxima eficaz de oligomicina (1 ug /mL), indicando que as células deslocado respiração mitocondrial para a glicólise. Rotenone (1? M) reduziu OCR para 55,78 ± 8,86 pmol /min por 10 × 10 3 células (~ 35% sobre os preços de base). A taxa de rotenona resistente reflete a taxa de respiração de não-mitocondrial, o que inclui a oxidação do substrato e do consumo de oxigénio da superfície da célula [19]. Assim, a respiração mitocondrial não respondeu por ~ 35%, enquanto que a respiração mitocondrial representaram ~ 65% da respiração celular total. Assim, em células cultivadas SGC-7901 ~92% (60% /65%) da respiração mitocondrial foi acoplado a síntese de ATP, e ~ 8% da respiração mitocondrial foi explicada por vazamento de protões (Fig. 3B). Na presença da dose máxima eficaz de FCCP (1? M, de um agente de desacoplamento que permite o transporte de electrões máxima,), foi observado um aumento concomitante no OCR, e foi aumentada para 204 ± 30,24 pmol /min por 10 × 10 3 células.}

Nós também avaliamos a contribuição relativa da glicólise e OXPHOS na taxa de produção de ATP em células SGC-7901. quantificações absolutos tanto da taxa glicolítica e taxa de consumo de oxigênio sensível ao oligomicina foram medidos em células SGC-7901. A taxa de acidificação extracelular é devido principalmente à produção de lactato e de bicarbonato e, quando calibrada como a taxa de produção de protões, indica a taxa glicolítica [15]. Assim, foi utilizado para inibir a oxamato lactato desidrogenase, que converte piruvato em lactato durante o último passo da glicólise, para calcular a taxa de produção de protões (Fig. 3C). Existe uma relação de um-para-um entre a taxa de produção de lactato e a taxa de produção de ATP a partir de glicólise. O consumo de oxigénio sensível à oligomicina foi convertida na taxa de produção de ATP, utilizando um racio P /S de 2,3 [20]. Os resultados mostraram que as células SGC-7901 cultivados em DMEM (alto teor de glucose) suplementado com piruvato 2 mM feito, pelo menos, 93% do seu ATP usando OXPHOS (Fig. 3D).

Carnosina mudou a caracterização de bioenergética SGC- 7901 células

Nós investigamos os efeitos da carnosina na taxa de consumo de oxigênio e taxa de acidificação extracelular em células SGC-7901 cultivados. Os resultados na FIG. 4 mostrou que o tratamento com carnosina 20 mM durante 48 h reduziu o OCR basal e ECAR para 141,13 ± 27,06 pmol /min por 10 × 10 ^{3 células (-87% do controle), e 11,32 ± 2,49 mph /min por 10 × 10 3 células (~27% do controlo), respectivamente (Fig. 4A, B). A respiração ATP ligado, vazamento de prótons, e taxa de respiração não-mitocondrial foram 81,03 ± 17,97, 7,15 ± 3,6, e 52,96 ± 8,40 pmol /min por 10 × 10 3 células, respectivamente (Fig. 4C, D, E ). Assim, em células tratadas com carnosina SGC-7901, foi responsável por respiração mitocondrial ~62% da respiração celular total, e ~92% (57% /62%) da respiração mitocondrial foi acoplado a síntese de ATP, e ~ 8% da respiração mitocondrial estava explicados por vazamento de prótons. Portanto, o tratamento carnosina diminuiu o valor absoluto da respiração ATP ligado, mas não influenciou a taxa de contribuição relativa da respiração ATP ligado, vazamento de prótons, e respiração não-mitocondrial para a respiração celular total. Além disso, também descobrimos que o tratamento carnosina reduziu acentuadamente o OCR e reposição da capacidade respiratória máxima de 161,60 ± 28,46 pmol /min por 10 × 10 3 células (~79% do controle) e 20,47 ± 6,92 pmol /min por 10 × 10 3 células (~47% do controlo) (Fig. 4F, G).}

células HepG2 e C6 também foram utilizados para comprovar os efeitos da carnosina no metabolismo do câncer de células de energia. Os resultados mostraram que 20 mM de carnosina tratamento durante 48 h reduziu acentuadamente o OCR basal e ECAR das células HepG2 e C6, respectivamente. Além carnosina também reduziu a taxa respiratória de ATP ligado em células C6, mas não em células HepG2 (Fig. S2). No entanto, a carnosina 20 mM reduziu acentuadamente o teor de ATP celular tanto em células HepG2 e C6, indicando que a inibição da glicólise estava envolvido na acção carnosina, pelo menos em células HepG2 (Fig. S2J).

Carnosina diminuição do ácido láctico extracelular nível na cultura SGC-7901 células

Porque carnosina é um tampão de pH orgânica móvel, a taxa de acidificação extracelular ensaiadas no presente de carnosina usando o Seahorse XF96 extracelular Flux Analyzer não pode refletir a taxa de glicólise real. Assim, também foi utilizado HPLC para ensaiar o nível de ácido láctico extracelular para verificar o efeito da carnosina na glicólise em células SGC-7901. Os nossos resultados mostraram que o tratamento carnosina marcadamente reduzido o nível de ácido láctico extracelular para 84% do controlo (Fig. 5), o que indica que a carnosina tem um efeito inibidor potencial da glicólise em células SGC-7901 em cultura.

Carnosina mudou o contribuição relativa da glicólise e OXPHOS a carga de ATP em células SGC-7901 cultivados em DMEM falta de piruvato

caracterizado também o efeito da carnosina no mudanças de teor de ATP e a contribuição relativa da glicólise e OXPHOS a carga ATP em células SGC-7901 cultivados em DMEM falta de piruvato. Medimos concentração celular de ATP em células expostas durante 45 min a seis condições: veículo, o inibidor da glicólise 2-DG, FCCP, rotenona, FCCP mais rotenona, e 2-DG mais FCCP mais rotenona. Nós descobrimos que o tratamento carnosina por 48 h reduziu significativamente o conteúdo ATP a 62% de controle. Tratamento 2-DG marcadamente reduzido teor de ATP em 48% e 34% nos grupos ausentes e carnosina presentes carnosina quando comparados com os seus próprios grupos de veículo, respectivamente. FCCP e FCCP mais rotenona cada um também reduziu significativamente o conteúdo de ATP em 15% e 18% no grupo ausente carnosina. No entanto, essas drogas não afetou o conteúdo ATP no presente grupo carnosina. Rotenone não afetou o conteúdo ATP, tanto em grupos ausente ou presente de carnosina. 2-DG, em combinação com FCCP e rotenona essencialmente eliminada a produção de ATP em ambos estes dois grupos (Fig. 6). Assim, 2-DG diminuiu ATP cobrar mais do que FCCP ou rotenona fez, tanto na carnosina grupos ausentes e presentes. Estes dados indicam que a geração de deslocamentos de ATP a partir OXPHOS a glicólise quando a função mitocondrial é prejudicada. carga ATP não é totalmente mantida após a inibição de qualquer glicólise ou função mitocondrial no grupo ausente carnosina, enquanto carga ATP é mantida após a inibição da função mitocondrial no grupo atual carnosina. Assim, o tratamento carnosina alterou a contribuição relativa de OXPHOS e glicólise em taxa de produção de ATP em células SGC-7901.

Efeito do piruvato na ação inibidora da carnosina em células SGC-7901 a função mitocondrial

para investigar se o aumento do nível de piruvato pode reverter o efeito inibidor da carnosina na respiração mitocondrial de células SGC-7901, as células foram expostas a diferentes concentrações de piruvato. Como se mostra na Tabela. 1, aumentando o nível de piruvato não podia reverter o efeito inibidor da carnosina em células SGC-7901 da respiração mitocondrial. Além disso, o ensaio de MTT, também mostraram que o aumento do nível de piruvato não podia reverter a acção carnosina em células SGC-7901 metabolismo mitocondrial (Fig. 7).

Efeitos de carnosina em teor de ADN mitocondrial e potencial de membrana mitocondrial no SGC-7901 células

potencial de membrana mitocondrial (Δ Ψ
m) representa a maioria da força motriz protónica utilizada para a condução de síntese de ATP e, portanto, tem um papel significativo no ATP máxima capacidade -generating [21]. Por isso, também usou a sonda catiônica lipofílico JC-1 explorar se carnosina suprime OXPHOS via supressão do potencial de membrana mitocondrial (Δ Ψ
m). Os resultados mostraram que o tratamento durante 48 h carnosina não poderia induzir uma mudança evidente de Δ Ψ
M em células SGC-7901 em cultura (Fig. 8A).

Para abordar a aparentemente diminuiu respiração mitocondrial induzida pela carnosina, nós também quantificado o número absoluto de DNA mitocondrial (mtDNA), que está fortemente regulada para manter os requisitos energéticos celulares [22]. Para nossa surpresa, os resultados revelaram que, em comparação com células de controlo, as mtDNA absolutos copiar números de células 7901 tratou-carnosina foram marcadamente aumentada, e as mtDNA média absoluta copiar números foram 141,49 ± 7,42 em células de controlo e de 360,0 ± 59,84 na carnosina células tenha sido tratada com (Fig. 8B).

Discussão

Para nosso conhecimento, este é o primeiro relatório do perfil bioenergético das células SGC-7901 cultivadas tratadas com e sem carnosina. Nossas principais conclusões são as seguintes. Em primeiro lugar, a carnosina reduz a capacidade proliferativa de células SGC-7901. Em segundo lugar, as células cultivadas em DMEM (alto teor de glucose) suplementado com piruvato 2 mM feita ~93% do seu ATP usando OXPHOS. Em terceiro lugar, carnosina exerceu seu efeito inibidor sobre SGC-7901 a proliferação das células através da inibição da glicólise, OXPHOS e respiração mitocondrial das células, e essas ações de carnosina também foram encontrados em células HepG2 e C6. Assim, a carnosina devem ser considerados, juntamente com a crescente armamento dos compostos, em vários estágios de desenvolvimento de drogas que têm como alvo o metabolismo do tumor, uma das características principais de tumores [23].

Devido ao seu largo espectro de actividade, a carnosina pode ser considerded como factor terapêutico no tratamento de muitas doenças. Por exemplo, zinco carnosina tem sido utilizado para a saúde e para o reparo gástrico intestinal [24]. células recentemente, estudos mostraram não transformadas crescem em MEM contendo altas concentrações de carnosina, e carnosina pode ser administrada como um fármaco in vivo para inibir o crescimento de células malignas [25]. No entanto, teve que ser questionado se carnosina pode impedir o crescimento de células de tumor gástrico humano além de as células malignas que foram relatados anteriormente. No presente estudo, verificou-se que a carnosina também é capaz de inibir o crescimento de células SGC-7901 em cultura de uma forma tempo e relacionado com a concentração, e este efeito não foi acompanhado por apoptose ou necrose, mas podem ser, em vez causada pela reduzida proliferação. No entanto, os mecanismos detalhados subjacentes ao efeito inibidor da carnosina na SGC-7901 proliferação de células ainda não estão claros.

É amplamente aceito que as alterações metabólicas são uma das marcas de câncer. Otto Warburg primeiro descreveu o aumento da utilização do metabolismo anaeróbico na presença de oxigênio adequado por células cancerosas em comparação com os seus homólogos normais: denominado o "efeito Warburg" [26]. No entanto, recentemente, tem sido apontado que a segmentação molecular de OXPHOS pode ter eficácia para o melanoma avançado que têm níveis elevados de OXPHOS [14]. Assim, diferentes tipos de tumores nas suas diferentes fases de desenvolvimento têm as suas próprias características metabólicas. Portanto, as estratégias e mecanismos de tratamento de tumores diferentes com base no metabolismo energético terapêuticas são diferentes. No presente estudo, foram utilizados pela primeira vez uma nova tecnologia de fluxo extracelular de avaliar vários parâmetros da função mitocondrial e taxa de acidificação extracelular em paralelo com a determinação da concentração de ATP para explorar a caracterização bioenergético das células SGC-7901 câncer gástrico humanos. A nossa análise do cavalo marinho mostrou células SGC-7901 têm mitocôndria activa, e dependem OXPHOS mitocondriais mais do que vias da glicólise para produção de ATP na condição de cultura com glucose elevada e piruvato, o que sugere que a respiração mitocondrial pode ser um potencial alvo terapêutico no cancro gástrico humano.

no entanto, quando as células foram cultivadas em DMEM falta de piruvato, que dependem de glicólise mais do que cultivadas em DMEM fornecido com piruvato 2 mM, porque a inibição da glicólise por 2-DG levando a uma queda de ~48 % de teor de ATP celular. Além disso, estes dados indicam também que as células SGC-7901 provavelmente falta a plasticidade na interrupção da glicólise para respiração mitocondrial quando a produção glicolítica do ATP é abolida na ausência de substâncias condição de cultura de energia. Por outro lado, Wu
et ai. relataram que houve uma regulação positiva de compensação eficaz da glicólise após a administração de oligomicina para bloquear a fosforilação oxidativa, e esta resposta foi capaz de sustentar o nível de ATP nas linhas de não-pequenas células humanas de carcinoma de células H460 e A549 [15]. Os nossos resultados também mostraram que as células SGC-7901 tem a capacidade de aumentar a glicólise quando a função mitocondrial está bloqueada por oligomicina. Além disso, quando a função mitocondrial foi suprimida por rotenona, uma regulação positiva de compensação eficaz da glicólise foi accurred, e esta resposta foi capaz de sustentar o nível de ATP em células SGC-7901. No entanto, as células não podia regular positivamente a capacidade de glicólise suficiente para sustentar o nível de ATP quando desacoplamento respiração mitocondrial da síntese de ATP induzida por FCCP, (Fig. 6). Portanto, as células SGC-7901 possuem glicólise substancial e capacidade respartion mitocondrial, e que faz com que as células crescem sob condições diferentes.

Apenas recentemente, foi demonstrado que a carnosina proliferação de glioma maligno reduzida por uma influência sobre glicolítico e ATP síntese [27]. Em nosso estudo, nós também descobriram que o tratamento com carnosina foi capaz de diminuir a taxa de acidificação extracelular e nível de ácido láctico, o que indica que a carnosina tem um efeito inibidor sobre a glicólise em células SGC-7901. No entanto, a carnosina não totalmente, mas a capacidade de glicólise parcialmente inibido das células, porque a inibição farmacológica da respiração mitocondrial por rotenona, ou desacoplada do gradiente de protões mitocondrial de produção de ATP por FCCP, ou tratados com rotenona e FCCP simultaneamente, as células foram ainda capazes para regular positivamente a glicólise para compensar a depleção de ATP (Fig. 6). Curiosamente, verificou-se que a carnosina também possui um novo papel como regulador da respiração mitocondrial. A carnosina suprimiu os níveis basais de respiração mitocondrial, e isto foi principalmente devido à respiração de ATP ligado diminuiu, indicando que a diminuição da saída de ATP mitocondrial em células SGC-7901 tratou-carnosina.

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