PLOS ONE: Variations dans Genes Helicobacter pylori cytotoxine-associés et leur influence dans la progression de cancer gastrique: Implications pour Prevention

Résumé

Helicobacter pylori
(HP) est une bactérie qui colonise la estomac humain et peut établir une infection à long terme de la muqueuse gastrique. L'infection persistante Hp induit souvent une gastrite et est associée au développement de la maladie peptique d'ulcère, gastrite atrophique, et l'adénocarcinome gastrique. Virulent HP isole hébergent le cag (gènes cytotoxine-associé) îlot de pathogénicité (cagPAI), un tronçon de 40 kb de l'ADN qui code pour les composants d'un système de type IV de sécrétion (T4SS). Cette T4SS forme un pilus pour l'injection de facteurs de virulence dans des cellules hôtes cibles, comme le CagA oncoprotéine. Nous avons analysé la variabilité génétique dans cagA
et d'autres gènes sélectionnés de la HP cagPAI ( CAGC
, CAGE
, CAGL
, CAGT
, cagV
et cag
Gamma) en utilisant l'ADN extrait à partir de biopsies gastriques congelés ou à partir d'isolats cliniques. Les sujets étaient 95 patients cagA de + qui ont été histologiquement diagnostiqués avec la gastrite chronique ou cancer gastrique au Venezuela et au Mexique, les zones à forte prévalence de l'infection Hp. Les réactions de séquençage ont été effectuées à la fois par Sanger et pyroséquençage la prochaine génération (454) Roche méthodes. Nous avons trouvé un total de 381 variantes avec des appels non ambigus observés dans au moins 10% des échantillons testés à l'origine et les souches de référence. Nous avons comparé les fréquences de ces variants génétiques entre le cancer de l'estomac et des cas de gastrite chronique. Vingt-six SNP (11 non-synonymes et 14 synonymes) ont montré des différences statistiquement significatives (P < 0,05), et deux SNP, en position 1039 et 1041 de CAGE
, a montré une association très significative avec le cancer (p -value = 2,07 × 10 ^{-6), et la variante codon a été localisé dans le domaine d'homologie VirB3 de Agrobacterium
. Les résultats de cette étude peuvent fournir des données préliminaires pour cibler un traitement antibiotique pour les personnes à haut risque, si les effets de ces variants sont confirmés dans d'autres enquêtes}

Citation:. Rizzato C, Torres J, Plummer M, Muñoz N, franceschi S, Ponce Camorlinga-M, et al. (2012) Les variations de gènes Helicobacter pylori cytotoxine-associés et leur influence dans la progression de cancer gastrique: Implications pour la prévention. PLoS ONE 7 (1): e29605. doi: 10.1371 /journal.pone.0029605

Editeur: Masaru Katoh, National Cancer Center, le Japon

reçues: 6 Octobre 2011; Accepté 1 Décembre 2011; Publié 3 Janvier, 2012 |

Droit d'auteur: © 2012 Rizzato et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. JT est bénéficiaire d'une bourse d'études Exclusivité de Fundacion IMSS, Mexique. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

Helicobacter pylori
(HP) est l'une d'infection bactérienne chronique la plus courante chez l'homme. Il a été estimé que plus de la moitié de la population adulte dans le monde est infecté par cet organisme [1]. Parmi ceux-ci, environ 10-15% des personnes infectées sont estimés à éprouver des séquelles cliniquement défavorable, y compris les ulcères peptiques, adénocarcinome gastrique et le lymphome gastrique de tissu lymphoïde associé aux muqueuses (MALT) [2]. À ce jour, en dépit des efforts importants dans le monde entier, ce qui détermine ces résultats cliniques variables n'a pas été complètement élucidé, mais qu'on croit être des combinaisons de l'environnement (par exemple, le tabagisme et l'alimentation) [3], la génétique de l'hôte et HP facteurs de virulence [3], [4 ], [5]. Travail en nous [6] et d'autres soutiennent que les facteurs bactériens sont susceptibles de jouer le rôle le plus décisif [7], [8].

Le meilleur marqueur de virulence caractérisé HP est le gène îlot de pathogénicité cytotoxine-associé (cagPAI ), une région de 40 kb de l'ADN chromosomique codant pour environ 31 gènes qui forme un système IV de sécrétion de type (T4SS) pour déplacer les produits bactériens dans la cellule hôte. cagA
réside au sein de cagPAI et est responsable de la plupart des phénotypes malins HP-associés: il déclenche l'IL-8 sécrétion amorcer une réponse inflammatoire, favorise la prolifération cellulaire, la diffusion et la migration soit par le biais des mécanismes de phosphorylation-dépendants et indépendants [ ,,,0],9], [10]. Le cagPAI est présent dans environ 95% des Asie de l'Est isole et elle est moins fréquente dans les isolats des pays occidentaux à faible risque [11], [12], [13].

La plupart des fonctions de cagA résident dans un C-terminal tandem revêtit motif répétitif contenant les acides aminés Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala (Epiya motifs A, B, C et D). Souches hébergeant des copies multiples de type occidental Epiya-type C ou orientale Epiya-D sont proposés pour être plus associée au cancer gastrique et avec un cagA augmenté in vitro
d'activité [14], bien que ce soit controversé [15] . À ce jour, en dépit de la variabilité connue dans le cagA
gène N-terminal et d'autres gènes de l'île cagPAI, il y a eu très peu d'informations concernant la pertinence clinique de variants génétiques en dehors du EPIYAs. Ainsi, dans cet article, nous cherchons à identifier des variantes dans les gènes cagPAI CAGC
( HP0546
), CAGE
( HP0544
), CAGL
( HP0539
), cagV
( HP0530
), CAGT
( HP0533
), et cag Gamma
( HP0523
) des gènes, qui ont été désignés comme composants fonctionnels importants de T4SS bactérienne modèle, et sont connus pour être cruciale pour la fonction cagPAI de translocation ou présent extracellulaire, suggérant une possible interaction avec des cellules hôtes; et cagA,
dont la région Epiya a été démontré de façon constante en corrélation avec les résultats cliniques (cancer gastrique) [16].

statut cagA de
seule ne suffit pas à prédire résultats cliniques. En outre, il y a des indications que l'éradication HP réduit l'incidence du cancer gastrique que chez les individus sans lésions précancéreuses. Les résultats de cette étude peuvent fournir des informations précieuses pour cibler un traitement antibiotique pour les personnes à haut risque, si les effets de ces variantes sont confirmées dans d'autres investigations.

Déclaration d'éthique de matériaux et méthodes

Tous les participants ont signé un consentement éclairé par écrit. L'étude a été approuvée par les comités d'examen éthique des institutions chargées de recrutement des sujets dans chacun des centres de recrutement.

Pour les échantillons mexicains, l'étude a été approuvée par les comités d'éthique de l'Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS) et l'Hôpital général de la Secretaria de Salud (SS), Mexico, Mexique.

pour les échantillons du Venezuela, la clairance éthique pour l'étude a été obtenue auprès de l'Agence internationale pour la recherche sur le cancer (CIRC) Comité d'éthique à Lyon, France, et le Centre de lutte contre le cancer à San Cristobal, au Venezuela.

population
d'étude

Venezuela.

Nous avons utilisé 11 échantillons d'ADN provenant de biopsies gastriques chez des sujets atteints de gastrite chronique sans atrophie recrutés dans un essai de chimioprévention au Venezuela [17], [18]. Les sujets de l'étude (35-69 d'âge) dans cet essai ont été recrutés parmi les participants au Programme de lutte contre le cancer gastrique de l'Etat de Tachira, qui était basée sur un double contraste aux rayons X gastrique suivi d'un examen gastroscopie. Les sujets avec toute forme de cancer y compris le cancer gastrique, ou avec d'autres maladies graves comme le cœur, le poumon, le rein ou une insuffisance hépatique et les femmes enceintes n'étaient pas admissibles. Sept biopsies gastriques ont été prises à partir de sites prédéfinis, cinq pour l'évaluation histologique et deux ont été gelés pour H pylori
l'isolement ou la culture de l'ADN. pathologistes d'experts dans les lésions néoplasiques de l'estomac lus lames histologiques.

Mexique.

84 échantillons provenaient de patients fréquentant l'Unité de gastroentérologie de l'Hôpital général México (Secretaría de Salud) et de l'Hôpital d'oncologie ( Instituto Mexicano del Seguro social), les deux hôpitaux de la ville de Mexico. Trente-cinq patients ont été atteints de gastrite chronique et 49 avec le cancer gastrique. Les patients étaient âgés de plus de 30 ans, a consulté en raison de symptômes gastro-duodénaux (General Hospital), ou à cause d'un cancer gastrique probable (hôpital d'oncologie), et ont été programmés pour l'endoscopie et la biopsie à des fins diagnostiques. Les sujets qui avaient déjà reçu le traitement du cancer, étaient sur les antibiotiques, la thérapie anti-HP ou des médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens deux semaines avant l'étude, ou a eu d'autres maladies chroniques graves ont été exclus. biopsies gastriques ont été placés dans une solution saline stérile à 0,9%, homogénéisés, et inoculées sur base de gélose au sang (BBL, MD) plaques supplémenté avec 5% de sang de mouton pour la culture HP. Les plaques ont été incubées à 37 ° C dans un CO de 9% _{2 atmosphérique pendant 5 jours. HP a été identifié par colonie et la morphologie microscopique et par oxydase positif, catalase, et des tests d'uréase. L'une de croissance primaire, de 7 à 10 colonies individuelles ont été isolées à partir de chaque niveau de l'antre et du corps et se sont propagées sur du milieu gélose au sang. Pour cette étude, nous avons analysé 43 échantillons de souches cultivées et 41 directement à partir de biopsies congelées.}

Les principales caractéristiques de la population sont décrites dans le tableau 1.

ADN extraction

pour les échantillons de biopsie du Venezuela et du Mexique l'ADN a été extrait à partir de tissus congelés à l'aide QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen, Hilden, Allemagne) selon les instructions du fabricant. Pour les souches cultivées ADN a été purifié en utilisant la méthode de guanidine thiocyanate-EDTA-Sarkosyl (GES) [19].

Design Primer

Nous avons utilisé des alignements de séquences HP à partir de bases de données publiques pour identifier les séquences appropriées pour la conception d'amorces de PCR. Nous avons limité nos recherches de bases de données à des souches occidentales de HP, qui sont plus susceptibles d'être similaires aux souches trouvées dans nos échantillons d'étude. Nous avons conçu amplicons carrelés dont la taille varie de 312 à 876 pb. La taille moyenne de la séquence se lit avec la technologie de séquençage 454 est de 450 pb, par conséquent vers l'avant et inverse lit lit se chevauchent au moins partiellement, ce qui améliore la fiabilité des résultats obtenus. Cinq des cagA
amplimères utilisés ont été publiés précédemment [20], [21]. Toutes les amorces utilisées pour cagA
, CAGC, CAGE, CAGL, cagV, CAGT
et cag gamma
ont d'abord été testé dans des réactions PCR sur un petit nombre d'échantillons d'étude ( n = 16) et les régions amplifiées ont été séquencées avec la technologie Sanger sur les mêmes échantillons pour confirmer la spécificité de l'amplification (voir tableau supplémentaire S1 pour les séquences d'amorces et les conditions d'amplification par PCR)
.

de plus, nous avons utilisé, comme référence, trois souches 26695 (NC_000195), J99 (NC_000921) et G27 (NC_0011333) dont les génomes ont été entièrement séquencé [22], [23], [24].

454 séquençage

Une fois que les conditions de PCR ont été optimisées, on resynthétisé les mêmes amorces utilisées pour la PCR avec des étiquettes de multiplexage (utilisés pour identifier des séquences spécifiques de chaque échantillon) et d'adaptateurs, et amplifié les régions cibles en utilisant des ADN à partir d'échantillons. Une deuxième PCR a été réalisée en utilisant les amorces marquées, afin d'augmenter la quantité de matière. Tous les amplimères PCR ont ensuite été purifiés, quantifiés par spectrophotométrie, et regroupé en quantités équimolaires.

génération Bibliothèque pour 454 séquençage de FLX a été réalisée en utilisant des protocoles standard du fabricant (454 Life Sciences Corporation, Branford, CT, USA). En bref, les adaptateurs du produit requis pour le traitement et le séquençage ont été ajoutés aux terminaisons de chaque pool de produits de PCR par ligature dans la catégorie. des molécules uniques des produits de PCR portant les adaptateurs corrects ont été hybridées à des billes individuelles, amplifiés par clonage dans une émulsion subséquente PCR et chaque pool chargés sur un 1/16 de picotiterplate pour le séquençage en utilisant la technologie 454 GS FLX titane. Après le traitement et la base appel en utilisant un logiciel propriétaire du fabricant (454 Life Sciences Corporation, Branford, CT, États-Unis, la version du logiciel 2.0.00 Octobre 2008), la résultante se lit ont été triées en fonction des six étiquettes pré-intégrées de base. analyse de la séquence génomique de 454 la technologie a été réalisée pour ces HP isolats > 200 fois la couverture moyenne (minimum 59x, 580X maximum). Les contigs résultants ont été assemblés en utilisant la séquence génique de la souche HP 26695 [23] comme échafaudage. On n'a pas observé d'importantes différences dans la qualité de la production entre l'ADN de la souche cultivée et de l'ADN à partir de biopsies. Afin d'évaluer le contrôle de la qualité des données, nous avons comparé 454 données de séquençage de la souche de référence 26695 et la séquence publiée dans la base de données NCBI (NC_000915); concordance était terminée > 99%. Nous avons également séquencé 9 échantillons du Venezuela avec la méthode traditionnelle de séquençage Sanger, en observant une concordance >. 99% entre les méthodes

Sanger séquençage

Le cagA
N-terminal (630bp ), C-terminal (position de 2670 à 3100) et Epiya motifs région ainsi que CAGL
gène ont été séquencés par la méthode de Sanger. Les réactions de séquençage ont été réalisées en utilisant le kit BigDyeR Terminator Cycle (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) dans des conditions thermiques comme suit: 96 ° C pendant 2 min, puis 27 cycles à 96 ° C pendant 30 s, 54 ° C pour 10 s et 60 ° C pendant 4 min. Les produits de réaction ont été précipités avec du 2-propanol, lavé à l'éthanol à 75%, dilué dans 25 ul d'eau et chargé sur un ABI prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). les données de séquençage primaires ont été analysées en utilisant un programme d'analyse de séquençage (Applied Biosystems).

Bioinformatique et méthodes statistiques

séquences brutes ont été analysées automatiquement par le logiciel 454, les scores de qualité ont été attribuées. La sortie de séquençage qui en résulte, à la fois en format 454 MFS et Sanger en format abi, ont été analysées avec un logiciel d'alignement de séquences multiples (par exemple, la plate-forme logicielle Geneious: http://www.geneious.com/), qui se réunit toutes les lectures appartenant à la même échantillon, puis les séquences de tous les échantillons ont été alignés sur une séquence de référence et de polymorphismes de nucléotides simples, ainsi que de petites insertions et suppressions ont été identifiées. Afin d'éviter des artefacts potentiels de séquençage et de limiter les variantes cliniquement et statistiquement les fréquences significatives, nous avons sélectionné des variants qui comprennent des appels non ambigus observés dans au moins 10% pour les synonymes (N = 175) et 20% pour les non synonyme (n = 206) des variantes de l'origine, échantillons testés et souches de référence (total 381).

SAS la version 9.2 a été utilisé pour estimer les rapports de cotes logit (OR) et l'intervalle de confiance de 95% (IC) pour le cancer gastrique associé à chaque variante, ainsi que pour calculer p -values ​​des différences dans les variantes des fréquences entre le cancer gastrique et la gastrite par le test exact de Fisher (2-sided). correction de Bonferroni a été appliquée pour calculer les valeurs p ajustées pour des comparaisons multiples en divisant les valeurs p premières avec 381.

La variabilité génétique dans sept gènes HP cagPAI

Un résumé de la variabilité génétique détectée dans le sept gènes sont rapportés dans le tableau 2. comme on s'y attendait, on a observé un degré élevé de variabilité (calculée comme le nombre de sites montrant une variante par rapport au total de sites dans un gène), tant au niveau de l'ADN et des acides aminés. La variabilité nucléotidique variait de 8,03% dans cagV
à 23,92% en CAGC
, tandis que la variabilité des acides aminés intéressant varie de 5,69% dans CAGT
, montrant le plus petit degré de variation, à 31,01% en cagA
.

Nous avons comparé les fréquences des 381 variants génétiques sélectionnés entre le cancer gastrique et les cas de gastrite chronique. Nous avons ensuite déterminé non synonymes (tableau 3) et synonymes (tableau 4) variantes qui ont montré des différences notables entre les cas de gastrite et le cancer, répondant à un des critères suivants, (1) absolue fréquence variant diffère d'au moins 25% entre les groupes de gastrite et le cancer; (2) la fréquence variant dans le cancer gastrique au moins deux fois plus élevé que dans la gastrite et (3) variant la fréquence dans la gastrite au moins deux fois plus élevé que dans le cancer gastrique. Vingt-cinq SNP (11 non synonymes et 14 synonymes) ont atteint des différences statistiquement significatives (p < 0,05, figure 1), situé dans cagA
, CAGE
, caggamma
et CAGL
, alors qu'aucun étaient situés dans CAGC
, CAGT
ou cagV
. Nous avons ensuite appliqué un seuil d'étude sage de p = 1,31 × 10 ^{-4 (0,05 /381) ajusté pour les comparaisons multiples, et seulement deux SNP, en position 1039 et 1041 dans CAGE
, a montré une p-valeur inférieure à ce seuil. Un SNP dans le CAGE
gène (position de 1905) montre une valeur p de 2,55 × 10 -4 très proche de la signification statistique étude sage.}

cagA
polymorphismes et types Epiya

la région C-terminale (positions 2670 à 3100) était très variable dans les isolats cliniques selon le motif des motifs Epiya (figure 2). Nous avons observé 524 sites polymorphes, dont nous avons analysé 148 sélectionné avec les critères décrits précédemment (le catalogue complet de cagA
SNPs est représenté en S1 de fichier supplémentaire). Fait intéressant, deux SNP montrent une récurrence différente entre gastrite et le cancer cas avec p < 0,05, même si elles ne sont pas considérés comme statistiquement significative en raison du grand nombre de tests; on est un SNP non synonymes (A2033G déterminer un changement d'acide aminé T /A, voir le tableau 3) et un SNP synonymes (A2547G, voir tableau 4).

L'analyse de la région Epiya a confirmé que toutes les séquences étaient du type cagA occidental, c.-à-ABC (82%), SCBA (13%), ABABC (3%), AABCC (1%) et ABCCC (1%). Nous n'avons pas observé une répartition différente de ces types de cagA entre les cas de cancer et gastrite (p = 0,2342), les résultats détaillés sont présentés dans le tableau 5 et la figure 2. Nous avons observé 3 variantes du motif Epiya: un échantillon de gastrite avait EPIYV dans un un motif, 50% des motifs B a montré la variante EPIYT (pas de distribution statistique différente dans le cancer et le cas de gastrite) et un motif C d'un cas de cancer a montré une variante de EPLYA.

Résultats de l'autre cag gènes
PAI

La variabilité génétique des CAGC cAGE
, CAGT, cagV
et cag Gamma
a été évaluée par séquençage 454 et c AGL
par séquençage Sanger. Le catalogue complet des polymorphismes observés dans ces sept gènes est représenté dans S1 de fichier supplémentaire.

Dans le CAGC
gène, nous avons détecté 83 SNP, dont 25 ont été sélectionnés comme décrit ci-dessus. Aucun de ces SNP a montré une distribution différentielle entre les cas de gastrite et le cancer.

Dans le CAGE
gène nous avons catalogué 308 sites polymorphes, 97 de ces polymorphismes ont été analysés. C1039T et T1041G ont montré une récidive différente statistiquement significative entre les cas de gastrite et le cancer avec p = 9,97 × 10 ^{-6. En outre un autre T1905C SNP a montré une récidive différente avec une valeur de p de 2,55 × 10 -4, ce qui est très proche du seuil d'étude sage. Neuf autres SNP montrent une récurrence différente entre les cas de gastrite et le cancer avec p < 0,05, six polymorphismes synonymes (T1032C, C1038T, T2092C, A2097G, G2121A et A2286G) et 3 variantes non synonymes: A76C (changement aminoacide de la lysine à la glutamine), T1853C (changement aminoacide de valine en alanine) et A2032G (changement aminoacide de asparagine en acide aspartique).}

La variante de C1039T, lorsque analysé comme seul changement, prédit un changement d'acide aminé de la lysine à phenilalanine (changement de codon de CTT à TTT), alors que le SNP T1041G se trouve à la troisième position du même codon et si analysé comme seul changement, il a prédit une variante synonyme (codon CTT changer à CTG). Cependant, dans tous les exemples que nous avons analysé les deux alleles variants ont été observés en même temps, par conséquent, nous avons observé que deux codons variants et (CTT TTG) qui codent pour le même acide aminé, la lysine. Le polymorphisme T1905C est une variante synonyme à la troisième position du GTT codon (variante codon GTC), qui code pour la valine.

Dans le CAGL
gène, nous avons observé 74 polymorphismes et dont 24 ont été analysés, 4 ont montré une répartition différentielle entre les cas de cancer et la gastrite (P < 0,05). Deux d'entre eux étaient non-synonyme: G166A (choisir aminoacide de l'alanine en thréonine) et A172G (variation aminoacide de l'asparagine en acide aspartique) et deux synonymes:. (A228G et C516T)

Dans le CAGT
gène, nous avons analysé 23 des 81 polymorphismes observés, alors que dans le cagV
gène, nous avons analysé 11 des 61 polymorphismes, et dans les deux gènes aucune du polymorphisme montré une distribution différentielle entre les cas de gastrite et le cancer.

Dans le cag Gamma
gène, nous avons observé 111 polymorphismes, dont 53 ont été encore analysés et 4 synonymes (A195TorC, T207A, C264T et A468G) et cinq non-synonymes (A38G, C47G, A200 /201T, A367C et G457A) a montré une p <. 0,05 pour la distribution différentielle entre les cas de gastrite et le cancer (figure 1)

Discussion

Depuis sa découverte en 1996 [25], la cagPAI, qui abrite les gènes de virulence de HP, a probablement été la partie la plus étudiée du génome HP. Le système de sécrétion de type IV code pour des protéines, qui forment une structure analogue à une aiguille de connexion HP vers le cytoplasme de la cellule de l'épithélium gastrique pour injecter la protéine et peptidoglycanes CagA oncogène. Les composants de cette structure comprennent a) des composants de pili, CAGC (homologue du Agrobacterium tumefaciens
VirB2) formant la structure extracellulaire principale, à laquelle la pointe CAGL est attaché à interagir avec β-1 intégrine; b) les protéines essentielles complexes, CAGW (VirB6), CAGT (VirB7), CagV (VirB8), CagX (VirB9) et réticent (VirB10) qui forment le noyau interne du pili; c) les facteurs énergétiques Cagβ (VirD4), Cagα (VirB11) et CAGE (VirB3 /VirB4), ATPases fournissent de l'énergie pour le système de travailler [26]. Dans cette étude, nous avons séquencé CAGC
( HP0546
), CAGL
( HP0539
) du pilus, cagV
( HP0530
), CAGT
( HP0533
), et cag Gamma
( HP0523
) à partir du complexe de base, et cAGE
( HP0544
) des enzymes de fourniture d'énergie à partir de souches isolées à partir de HP gastrite et les patients atteints de cancer gastrique. Ces gènes ont été choisis parce que leurs produits sont connus pour être essentiel pour la fonction T4SS et certains sont présentés par extracellulairement H. (CagA, CAGL, CAGC) de pylori, suggérant des interactions possibles avec la cellule hôte [27].

Nous avons trouvé la plus petite variation, tant au niveau du nucleotide et le niveau aminoacide, dans les composants internes de base de T4SS (CAGT , CagV et cAGE, 5,7%, 5,9% et 5,9% de variation aminoacide, respectivement), et la plus grande variation des composants exposés: protéine de liaison à l'intégrine CAGL, pilus extracellulaire principale composante CAGC et CagA de protéine sécrétée (12,2%, 23,5% et 31%, les variations d'acides aminés, respectivement). Ces résultats confirment que la variation génétique dans les composants cagPAI est principalement influencée par leur localisation dans la T4SS, avec des variations plus élevée dans les protéines exposées à la surface bactérienne, peut-être en tant que réponse à une pression immunologique. Il est intéressant de Cag Gamma est une exception (19,5% de variation d'acide aminé), cette protéine a été proposé de résider dans le périplasme HP sur lequel elle agit comme un peptidoglycane hydrolase, en perçant la membrane externe HP et contribuant ainsi à exposer le pilus T4SS au milieu extérieur [28]. Il est possible que Cag Gamma remplit cette fonction aussi comme une composante structurelle du pilus exposée, où il pourrait également agir sur la membrane de la cellule hôte.

Études de l'Afrique [21], Italie [14], États-Unis [ ,,,0],8] et le Brésil [29] ont suggéré une association entre l'augmentation du nombre de Epiya C motifs et les maladies associées HP. En outre, Sicinschi et al. [30] ont observé une association entre l'augmentation des segments Epiya C et la présence de lésions précancéreuses gastriques. En revanche, des études en Colombie [8], [31], le Mexique (J. Torres, communication personnelle), et la Corée [32] ont pas trouvé une telle association. Dans notre étude, plus de 80% de tous les échantillons en provenance du Mexique et du Venezuela étaient du type ABC, et aucune association était évidente entre la progression du cancer gastrique et le nombre plus élevé de Epiya C motifs. De plus, des études récentes [15] ont montré l'importance des points variations dans Epiya B motif de l'activité sur les cellules épithéliales, nous avons observé quatre variations non synonymes dans ce motif, mais ces polymorphismes n'a pas montré une association avec le cancer gastrique.

des études récentes ont rapporté des activités pro-inflammatoires et pro-oncogènes importants de CagA qui sont indépendantes des motifs Epiya et qui pourraient être aussi importants pour la maladie [30]; ces résultats pourraient expliquer l'absence d'association des C motifs atteints de cancer signalés ici et dans les études précédentes. Le terminal C de la protéine CagA contient aussi le motif C-MET, qui a été proposé d'avoir plusieurs fonctions: la médiation CagA multimérisation et de ciblage membranaire [33], [34], d'interagir avec la kinase Par1b /MARK2 [35], et tous ceux-ci activités sont CagA-phosphorylation indépendante [36]. Cependant, dans notre étude, nous n'avons pas trouvé de différences significatives entre la gastrite et le cancer gastrique, soit dans l'ordre ou dans le nombre de multimérisation motifs.

Les domaines C-terminaux et N-terminaux de CagA sont tous deux nécessaires pour exploiter l'activité complète de la protéine, même si elles ont des fonctions distinctes. Récemment, il a été montré que l'extrémité N-terminale de CagA interagit avec le gène suppresseur de tumeur, protéine de stimulation de l'apoptose de la p53 (ASPP2) [37].

La présence de tous ces interactions entre les protéines bactériennes et CagA et humains suggèrent que il pourrait être très difficile pour la bactérie de maintenir l'ensemble de l'activité biologique en présence d'un niveau élevé de mutations, dont la plupart sans doute conduisent à la perte ou l'atténuation de la fonction.

Bien que cagA
est le marqueur le mieux établi de virulence cagPAI, cagA de statut seul ne suffit pas à prédire les résultats cliniques chez les populations à haut risque où la majorité des HP sont souches -positifs
cagA. Dans ce contexte, l'identification de nouveaux marqueurs de virulence moléculaire HP pour prédire le risque de cancer gastrique sera très important. Les progrès récents dans la méthodologie de génotypage nous permet d'utiliser l'ADN à partir de biopsies gastriques pour étudier microvariabilities séquence HP, qui ont été étudiées presque exclusivement dans des souches cultivées. Génotypage d'un nombre plus élevé d'échantillons gastriques nous permet d'élargir la détection des variantes génétiques cagPAI à d'autres gènes T4SS potentiellement importants. Cela est pertinent car les études antérieures ont porté principalement sur cagA
et l'utilité des autres gènes cagPAI comme marqueurs pour le risque de maladie est à peine étudié. Peu d'études ont cherché l'association de la présence de gènes cagPAI et la maladie, et aucun n'a étudié les polymorphismes dans les gènes cagPAI, autres que cagA.

CAGE
est unique gène qui code pour deux composants, T4SS VirB3 (N-terminale) et B4 (C-terminale) en tant que protéine de fusion [38], et B4 est la plus grande parmi ATPase plusieurs composants T4SS. Il génère de l'énergie pour le processus de sécrétion, ce qui est nécessaire pour la translocation substrat [39] et interagit avec de nombreuses autres protéines, y compris T4SS VirB2 [40]. Malgré sa localisation relativement intérieure, son rôle central dans l'IL-8 induction a été bien documenté [41], [42], [43]. Fait intéressant, nous avons observé une forte association entre deux SNP (C1039T et T1041G) du CAGE
et le cancer gastrique, une constatation non déclarée antérieurement. Ces SNP sont à la position un et trois du même codon et nous avons toujours observé ces deux codons variantes (CTT et TTG) qui codifient pour le même acide aminé, la lysine. Cette variante codon est situé dans le domaine d'homologie avec VirB3 de Agrobacterium
. L'association deuxième plus forte a été détectée dans un autre SNP synonyme en position 1905 et dans ce cas, les deux codons possibles étaient GTT et GTC, qui code pour la valine. Il est connu depuis longtemps que les autres codons synonymes ne sont pas utilisés avec les mêmes fréquences et les modes d'utilisation des codons varient selon les espèces [44]. L'usage des codons est plus biaisée dans les gènes exprimés à des niveaux [45], [46] plus élevés. L'utilisation de codons optimaux permet une utilisation plus efficace des ribosomes et conduit à rythme plus rapide de croissance [47]. Bien que le génome de HP a été rapporté pour contenir aucun biais de codon pour les gènes fortement exprimés [48], Kloster et Tang [49] ont identifié un biais dans le niveau des gènes où TTG codon est préféré au CTT codon, d'expression, ainsi que de le codon GTC sur GTT. Par conséquent, sur la base de ces données, nous pourrions supposer que la différence dans l'usage des codons peut avoir un impact sur le niveau d'expression d'un gène avec une pertinence fonctionnelle forte pour le système de sécrétion T4SS tels que CAGE
.

CAGL est une protéine de pilus spécialisé qui se lie à et active l'intégrine α5β1 récepteur sur les cellules épithéliales gastriques essentiellement par son arginine-glycine-aspartate (RGD), guidant le positionnement correct du T4SS et de faciliter la translocation de cagA [9], [50 ]. CAGL active également les kinases de la cellule hôte kinase adhésion focale (FAK) et Src pour assurer CagA la phosphorylation au niveau du site d'injection, tandis que l'intégrine β1 est requis pour la mobilité et l'allongement [51] Cellule hôte induite CagA. CAGL peut également être responsable de hypochlorhydria HP-induite par l'activation d'un disintégrine et métalloprotéase 17 et de NFkB [52]. Des deux CAGL
SNPs nous avons trouvé associés avec le cancer gastrique, le A172G SNP (N58D) est dans la même position dans laquelle Yeh et al [53] ont démontré que la présence simultanée de la tyrosine en position d'acide aminé 58 et de l'acide glutamique en position 59 (Y58E59) par rapport à l'acide aspartique combiné (D58) et Lysine (K59), induit plus efficacement un changement de corpus de gastrique intégrine α5β1 qui a été liée à la carcinogenèse gastrique. Nous n'avons pas observé la tyrosine (Y) l'acide aminé en position 58 dans un échantillon, même si nous avons constaté que les transporteurs d'acide aspartique (D) à cette position sont à faible risque de cancer gastrique par rapport à l'asparagine (N) transporteurs. En outre, nous avons observé le polymorphisme de l'acide aminé 59 à la fréquence inférieure, sans aucune différence entre les échantillons de cancer et la gastrite.

Dans des études précédentes [54] L'analyse de la séquence du gène de cagGamma a montré qu'il ports un domaine typique SLT catalytique entre les résidus 33 et 165, dont le "ES" et "motifs de AVGAY" ont été fortement conservée parmi les enzymes orthologues. Nous avons observé cinq variantes non synonymes avec une distribution différente dans les cas de cancer et de gastrite. Trois d'entre eux la carte dans le domaine catalytique, cependant aucun d'entre eux se trouve dans les parties les plus conservées du domaine.

Bien que cette étude a des limites à la taille de l'échantillon, il est le plus important jusqu'à présent en termes de nombre de gènes cagPAI étudié pour une séquence profonde analyse. Quelques échantillons ont été perdus en raison de l'échec de l'amplification par PCR, qui peut être due à microvariabilities de séquence HP.

• PLOS ONE: Effets de l'interleukine-10 polymorphismes, Helicobacter pylori infection, et le tabagisme sur le risque de cancer gastrique Noncardia
• PLOS ONE: La réparation de l'ADN Gene APE1 T1349G Polymorphisme et risque de cancer gastrique dans une population chinoise