PLOS ONE: Podocalyxin comme un marqueur pronostique dans gastrique Cancer

Résumé

Contexte

Podocalyxin-like 1 (PODXL) est une glycoprotéine d'adhésion cellulaire associée à phénotype tumoral agressif et de mauvais pronostic dans plusieurs formes de cancer. Le but de cette étude était d'étudier l'expression de PODXL dans le cancer gastrique par l'utilisation de deux anticorps différents.

Méthodes

Par microarrays tumeur des tissus et immunohistochimie nous avons évalué l'expression PODXL dans des échantillons de tumeurs de 337 patients qui a subi une intervention chirurgicale pour adénocarcinome gastrique à l'hôpital universitaire d'Helsinki. Nous avons utilisé deux anticorps différents:. HPA2110, qui est un anticorps polyclonal et un anticorps monoclonal en interne appelé HES9, pour enquêter sur l'association d'expression PODXL avec des variables clinicopathologiques et la survie des patients

Résultats

PODXL coloration est positive par l'anticorps polyclonal 153 (57,5%) des cas et par l'anticorps monoclonal 212 (76%). expression d'anticorps polyclonaux a été associé à l'intestin type de cancer (p < 0,001). la coloration de l'anticorps monoclonal est associé à un âge supérieur à 66 (p = 0,001), avec cancer de l'intestin (p < 0,001), et la taille de la tumeur de petite taille (≤ 5 cm; p = 0,024). Les deux anticorps étaient associés à la fraction élevée de la phase S (p = 0,022, p = 0,010) et l'indice de prolifération tumorale élevée (Ki-67; p = 0,003, p = 0,001). PODXL positivité par l'anticorps polyclonaux indiquée réduite survie à 5 ans spécifique gastrique cancer de 24,0% (IC à 95% de 16,9 à 31,1), comparativement à 43,3% (IC à 95% de 33,7 à 52,9) pour les patients atteints de PODXL négativité (p = 0,001 ). Le résultat est resté significatif dans l'analyse multivariée. (HR = 3,17; IC à 95% 1,37 à 7,34, p = 0,007)

Conclusion

Dans le cancer gastrique, PODXL expression par le HPA2110 d'anticorps polyclonaux est un marqueur de mauvais pronostic indépendant

Citation:. Laitinen A, Bockelman C, Hagström J, Kokkola A, C Fermer, Nilsson O, et al. (2015) Podocalyxin comme un marqueur pronostique dans le cancer gastrique. PLoS ONE 10 (12): e0145079. doi: 10.1371 /journal.pone.0145079

Editeur: Yves St-Pierre, INRS, CANADA

Reçu 15 Septembre 2015; Accepté: Novembre 29 2015; Publié le 16 Décembre, 2015

Droit d'auteur: © 2015 Laitinen et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le papier

financement:. Cette étude a été soutenue par des subventions de Finska Läkaresällskapet, la och Fondation Kurt Doris Palander, la Fondation Sigrid Jusélius et Medicinska understödsföreningen Liv och Hälsa. Fujirebio Diagnostics AB et Onson Consulting fournies soutien sous la forme de salaires pour les auteurs des FC et ON, mais n'a pas eu un rôle supplémentaire dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit.

intérêts concurrents:. les auteurs ont déclaré qu'il n'y a pas des intérêts divergents existent

introduction

dans les dernières décennies, l'incidence du cancer de l'estomac a diminué, en particulier dans les pays occidentaux, apparemment en raison de la baisse de l'incidence de Helicobacter pylori
, à une meilleure hygiène, et de vivre moins de monde. Parce que le cancer gastrique a un mauvais pronostic, il est encore à l'échelle mondiale la deuxième cause la plus fréquente de décès liés au cancer [1]. Le taux de survie à 5 ans, en dépit de la chirurgie curative, est seulement d'environ 10-30% [2]. La mortalité élevée est principalement due à un diagnostic tardif.

L'UICC Tumor Node Métastase (TNM) classification est de loin le système le plus cohérent de classification pronostique aujourd'hui. Cependant, même dans les mêmes tumeurs du groupe de stade, le cours de la maladie peut varier. Créer des méthodes d'évaluation plus précise de l'agressivité de néoplasie serait de la valeur lors de l'évaluation du pronostic des patients atteints de cancer gastrique.

Podocalyxin-like 1 (PODXL) est une glycoprotéine transmembranaire anti-adhésif appartenant à la famille CD34 . Elle est exprimée normalement par les reins podocytes [3], les cellules progénitrices hématopoïétiques [4], endotheliales vasculaires [5], et les cellules épithéliales du sein [6].

La signification clinique de PODXL dans la progression du cancer a été étudiée dans divers types de cancer, d'abord en tant que marqueur de cellules souches dans le cancer du testicule [7]. Une découverte plus tard, est que l'expression des cellules tumorales spécifiques PODXL est associée à un phénotype plus agressif et le résultat négatif dans plusieurs types de cancer, par exemple dans le sein [6], de la prostate [8], de l'ovaire [9], du colon [10- 12], de la vessie urothéliales [13], du pancréas [14], et ampullome [15].

Le but de cette étude était d'étudier l'expression de PODXL dans le cancer gastrique pour révéler son rôle éventuel dans l'agressivité et le pronostic. Nous avons décidé d'utiliser deux anticorps PODXL reconnaissant des épitopes différents: un anticorps monoclonal dans la maison-HES9 et un anticorps polyclonaux HPA2110 disponible dans le commerce. Récemment, nous avons appris que ces deux anticorps sont des marqueurs indépendants de mauvais pronostic dans le cancer colorectal [12]. Les deux anticorps peuvent reconnaître deux groupes de patients atteints de cancer colorectal, qui ont tous deux un mauvais pronostic; utilisation combinée de ces anticorps a révélé un groupe de patients dont le pronostic est encore pire [16].

Les Matériaux et méthodes Patients

L'étude comprenait 337 patients consécutifs qui ont subi une intervention chirurgicale pour histologiquement vérifié adénocarcinome gastrique au Département de chirurgie de l'hôpital universitaire d'Helsinki, de 1983 à 1999. le diagnostic et la mise en scène selon la classification UICC fourni 100 (29,7%) stade IA-IB, 41 (12,2%) de stade II, 96 (28,5%) stade IIIA-IIIB, et 100 (29,7%) patients de stade IV. métastases ganglionnaire survenus dans 184 (55%) et des métastases à distance dans 93 (28%) des cas. L'âge médian était de 66 ans (extrêmes 30-87), et 163 (48%) étaient des femmes et 174 (52%) des hommes. gastrectomie totale ou partielle avec étendue (D2-D2 +) lymphadénectomie a été réalisée dans 34 (10%) patients, gastrectomie totale avec D1-lymphadénectomie dans 161 (48%), et gastrectomie subtotale avec D1-lymphadénectomie dans 142 (42%). Au total, 143 (43%) patients ont été opérés à visée curative, alors que 176 (52%) ont subi une chirurgie palliative. Aucun reçu un traitement néoadjuvant, mais 32 (9%) patients ont reçu un traitement adjuvant postopératoire (28 chimiothérapie, la radiothérapie 2; 2 ont reçu les deux). les données de survie et cause de décès jusqu'en Novembre 2013 provenaient de dossiers des patients, le registre central de la population de la Finlande, et de la statistique de la Finlande.

L'étude a été approuvée par le Comité d'éthique de chirurgie de l'hôpital universitaire d'Helsinki (Dnro HUS 226 /E6 /06, l'extension TMK02 §66 17/04/2013) et l'Autorité nationale de surveillance du bien-être et la santé ont donné l'autorisation d'utiliser les échantillons de tissus sans le consentement individuel dans cette étude rétrospective (Valvira Dnro 10041 /06.01.03.01 /2012).

des échantillons de tissus

formol-fixe et des échantillons de tissus chirurgicaux paraffine provenaient des archives du Département de pathologie. Les tissus du patient ont été dé-identifiées et analysées de manière anonyme. Histopathologique des zones représentatives des échantillons de tumeurs ont été définis et marqués sur des lames haematoxylin- et éosine teinté. Trois noyaux de chaque bloc de la tumeur ont été échantillonnés avec 0,6 mm puncheurs et intégrés dans un nouveau bloc de paraffine par un microarrayer de tissu semi-automatique (Tissue Arrayer 1, Beecher Instruments Inc., Silver Spring, MD, USA). Parmi les six blocs de tissus préparés matrice, chacun contenait 24-192 échantillons de tumeur. Les sections de 4 um chacune ont été coupées et traitées pour l'immunohistochimie.

Anticorps

Nous avons comparé deux anticorps PODXL contre des épitopes différents. L'anticorps polyclonal (HPA2110, Atlas Antibodies, Stockholm, Suède) a été produit contre un peptide ayant les résidus d'acides aminés 278-415 de PODXL et l'anticorps HES9 monoclonal interne [12] reconnaît les résidus d'acides aminés 189-192 de PODXL . Les deux epitopes se trouvent dans la partie extracellulaire de la molécule PODXL. La séquence d'épitope de la HPA2110 correspond à des variants d'épissage de PODXL codant trois protéines avec 100% (PODXL 001, 005, et 201, The Atlas des protéines humaines). La quatrième variante d'épissage correspond à 87% (PODXL 202). Les séquences d'épitope de la HES9 correspond à 100% avec tous les variants d'épissage. Les anticorps sont décrits en détail [12,17,18].

immunohistochimie

Les articles ont été fixés sur des lames et séchées pendant 12 à 24 heures à 37 ° C, puis ont été déparaffinées dans du xylène et réhydraté par des concentrations décroissantes progressivement de l'éthanol à l'eau distillée. Pour la récupération de l'antigène, les sections ont été traitées dans un module Prétraitement (Laboratoire Vision Corp., Fremont, CA, USA) dans un tampon Tris-HCl (pH 8,5) pendant 20 minutes à 98 ° C. Les sections ont été colorées dans un Autostainer 480 (Laboratoire Vision) par le système de détection Dako REAL EnVision, peroxydase /DAB +, Lapin /Souris (Dako, Glostrup, Danemark). Les lames ont été traitées pendant 5 minutes avec 0,3% Solution Dako REAL peroxydase-blocage pour bloquer les peroxydases endogènes. Par la suite, les lames ont été incubées pendant 1 heure avec un anticorps polyclonal (une dilution 1: 250 = 2,5 pg /ml) ou l'anticorps monoclonal (dilution 1: 500 = 5 pg /ml) à la température ambiante. En tant que contrôle positif pour chaque série de coloration, nous avons utilisé des échantillons de tissu rénal.

Notation des immunoréactivité

HPA2110 et HES9 immunopositivité a été notée dans tous les noyaux de tumeur disponibles. PODXL cytoplasmique et HES9 immunopositivité a été marqué comme 0 à 3 en fonction de l'intensité de l'immunoréactivité des cellules cancéreuses, et le score le plus élevé des trois noyaux servis pour une analyse ultérieure. immunoréactivité négative a été marqué comme 0, diffuse faible positivité cytoplasmique comme 1, modérément positif ou intensité focalement fortement positive que 2, et de l'intensité homogène forte que 3. Tous les échantillons ont été marqués de façon indépendante par deux chercheurs (AL et JH) aveuglés à l'état clinique et les résultats données. Spécimens avec des scores discordants ont été réévalués, et le score de consensus servis pour une analyse ultérieure. Nous avons été en mesure de traiter et de marquer HPA2110 coloration à 266 et HES9 coloration dans 279 échantillons.

L'analyse statistique

Associations entre HPA2110 et HES9 positivité et les variables clinicopathologiques ont été évaluées par le test du chi-carré ou test exact de Fisher. Corrélations entre les deux anticorps Podocalyxin ont été évalués par le test de corrélation de Spearman. la survie spécifique de la maladie-a été calculée à partir de la date de la chirurgie à la mort d'un cancer gastrique.

Les courbes de survie ont été construites selon la méthode de Kaplan-Meier et comparées avec le test de logrank. Pour l'analyse de survie univariée et multivariée, le modèle des risques proportionnels de Cox avait les covariables suivantes sont entrées: l'âge, le sexe, le stade, le grade, la classification LAURENS, taille de la tumeur, la localisation de la tumeur, l'expression PODXL déterminée par HPA2110 coloration et HES9 coloration, l'ADN ploïdie, S- la fraction de phase, Ki-67 d'expression et l'expression de p53. Stade, le grade, la classification LAURENS, taille de la tumeur, l'ADN ploïdie, fraction de phase S, et l'expression de PODXL, HES9, Ki-67, et p53 ont été inscrits comme covariables catégoriques. ploïdie d'ADN et de la fraction en phase S ont été évaluées auparavant par cytométrie de flux, et p53 et Ki67 expression tissulaire par immunohistochimie [19,20]. Une valeur de p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées avec IBM SPSS Statistics Version 20.0 pour Mac (IBM Corporation, Armonk, NY, USA).

Résultats

immunohistochimie

cytoplasmique HPA2110 réactivité, évaluées 266 cas, a été négative dans 113 (42,5%), faiblement positif dans 120 (45,1%), modérément positif dans 29 (10,9%), et fortement positif en 4 (1,5%) des cas. Sur les 279 cas tachés avec succès pour l'expression cytoplasmique par HES9, 67 (24,0%) étaient négatifs, 137 (49,1%) faiblement positif, 54 (19,4%) modérément positif, et 21 (7,5%) fortement positif. Dans l'analyse finale, faible à fortement HPA2110 positive et HES9 immunoréactivité (scores 1-3) a été considérée comme une expression positive. Des images représentatives de immunomarquages ​​sont dans la figure 1. Les deux HPA2110 et HES9 colorés uniformément dans le cytoplasme, avec nucléaire, ni cellule immunopositivité membraneuse notable. L'expression cytoplasmique de podocalyxine par les deux anticorps différents HPA2110 et HES9 corrélation (r _{s = 0,455, p < 0001, Spearman test de corrélation de rang).}

Association des HPA2110 et HES-9 avec des variables clinicopathologiques et biomarqueurs

Les associations de HPA2110 et HES9 avec des variables clinicopathologiques et biomarqueurs moléculaires sont les suivants: positifs (scores 1-3) HPA2110 coloration a été associée à l'intestin type de cancer (p < 0,001), la coloration de HES9 positif a été associée à âge supérieur à 66 (p = 0,001), avec le cancer intestinal (p < 0,001), et avec une petite taille (≤ 5 cm) de la tumeur (p = 0,024). Deux HPA2110 et HES9 étaient associés à la fraction élevée de la phase S (SPF, p = 0,022, p = 0,010) et l'indice de prolifération élevé de la tumeur (Ki-67, p = 0,003, p = 0,001) (tableaux 1 et 2).

Survival analyse

expression positive HPA2110 indiqué une survie à 5 ans spécifique du cancer gastrique de 24% (IC à 95% de 16,9 à 31,1), comparativement aux patients avec coloration négative HPA2110 avec 5 ans survie de 43% (IC à 95% de 33,7 à 52,9) (p = 0,001 test log-rank) (figure 2 et le tableau 3). La survie à 5 ans spécifique du cancer gastrique des patients atteints de la coloration de la tumeur HES9 positive était de 30% (IC à 95% de 23,1 à 36,1), et pour ceux qui ont une coloration négative, 40% (IC à 95% de 27,7 à 52,1; p = 0,130 log Test -rank) (figure 2).

dans l'analyse de sous-groupe, HPA2110 était un marqueur important de mauvais pronostic chez les groupes de patients plus jeunes (âge de moins de 66 ans) (p = 0,006), et pour le sexe masculin (p = 0,002), les patients de type diffus cancer (p = 0,001), et la phase I (p = 0,048) (figure 3 et tableau 3). Dans les autres sous-groupes étudiés, HPA2110 n'a pas servi comme un marqueur pronostique

L'expression de HPA2110 est restée significative dans l'analyse multivariée. (HR = 3,17; IC à 95% 1,37 à 7,34; p = 0,007; tableau 4). D'autres facteurs pronostiques indépendants dans l'analyse multivariée étaient stade, le grade, et l'ADN ploïdie.

Discussion

Nous montrons ici que 5 ans survie spécifique au cancer était significativement meilleure pour les patients atteints de cancer gastrique ayant un PODXL tumeur séronégatifs. En fait, parmi les étapes 1 patients atteints de tumeurs PODXL-négatives, un seul patient est décédé d'un cancer. En analyse multivariée, l'expression de PODXL positif servi comme un marqueur indépendant de mauvais pronostic. l'expression PODXL positive à la fois par le HPA2110 anticorps polyclonal et l'anticorps monoclonal HES9 est associé à indice de protection élevé par cytométrie en flux et Ki-67 coloration, les deux étant des marqueurs de la prolifération importante des cellules cancéreuses, et donc de plus mauvais pronostic.

positif l'expression de PODXL par les deux anticorps a été associé avec le type de cancer de l'intestin, mais une tumeur PODXL négatif avéré ne pas être un marqueur de pronostic dans le cancer de l'intestin. A l'inverse, la survie à 5 ans spécifique du cancer dans le sous-groupe de cancer de type diffus était significativement plus mauvais pour les patients atteints d'une tumeur PODXL-positive. En général, le type de cancer diffuse a été associée à un pronostic pire que a le type intestinal [21].

Au meilleur de notre connaissance, nous sommes les premiers à signaler une valeur pronostique pour PODXL dans le cancer gastrique. Cela a été évident pour plusieurs autres types de cancers, comme ceux du sein [6], de la prostate [8], de l'ovaire [9], colorectal [10-12], de la vessie urothéliales [13], du pancréas [14], et ampullome [15] . Une étude sur le cancer colorectal montrent la concordance entre les tumeurs primaires et les métastases des ganglions lymphatiques correspondants chez les patients individuels, et l'expression de PODXL reste également affecté par la radiothérapie néoadjuvante. Ces résultats confirment l'utilité clinique de PODXL comme un marqueur de mauvais pronostic [22]. Ici, nous n'avons pas étudié l'expression de PODXL dans métastases ganglionnaires dans le cancer gastrique, et aucun des patients de cette cohorte reçu une chimiothérapie préopératoire, bien qu'il soit actuellement assez de routine. Ces effets de la chimiothérapie préopératoire sur l'expression PODXL dans le cancer gastrique a besoin une évaluation plus poussée.

Nous avons utilisé deux anticorps reconnaissant PODXL, un HPA2110 d'anticorps polyclonaux disponibles dans le commerce et un anticorps monoclonal en interne HES9 [16]. Immunoexpression par le HES9 anticorps monoclonal était plus forte que par l'anticorps polyclonal. Les deux anticorps colorés de façon uniforme dans tout le cytoplasme et les noyaux ni ni membrane cellulaire colorées. La variété de l'intensité et de la distribution de coloration était plus légère lors de l'utilisation de l'anticorps polyclonaux, ce qui rend le score plus difficile. Fondamentalement PODXL est une molécule transmembranaire, et il est donc surprenant de ne pas trouver sur les membranes cellulaires dans les cellules de cancer de l'estomac, soit par un anticorps. Le sens de cytoplasmique, non-membraneuse, l'expression de PODXL, son rôle et sa fonction, besoin une évaluation plus poussée.

Ces différents anticorps, nous avons utilisé reconnaître les parties inégales de la molécule d'PODXL, sans doute expliquer pourquoi leur expression dans une partie de la spécimens différaient et les résultats ne sont pas identiques. Kaprio et al. [16], utilisé ces mêmes anticorps dans le cancer colorectal, et a trouvé une différence intéressante entre les motifs de coloration. Le résultat positif d'anticorps polyclonaux a été membraneux [9,10], mais la positivité des anticorps monoclonaux était évidente principalement dans le cytoplasme. Dans le cancer colorectal, une forte positivité à la fois avec l'anticorps monoclonal et l'anticorps polyclonaux a révélé un sous-groupe de patients avec une survie encore pire. Nous n'avons pas trouvé ce genre de corrélation dans les échantillons de cancer gastrique. Dans l'ensemble, la positivité chez les patients atteints de cancer gastrique a été plus faible que chez les patients atteints de cancer du côlon. Dans le cancer colorectal environ 94% des cas étaient positifs pour PODXL avec ces deux anticorps, alors que dans la positivité du cancer gastrique est apparu dans 76% des cas avec l'anticorps monoclonal et à 58% avec l'anticorps polyclonal. La fréquence de PODXL positivité dans le cancer gastrique était proche de celle observée dans le sein et cancer de l'ovaire (40% et 67%) [6,9].

PODXL est une glycoprotéine transmembranaire. Il a été démontré que les mucines, qui sont également des glycoprotéines jouent un rôle dans la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) [23,24]. Le rôle de PODXL dans le cancer est inconnu, mais il peut être également émis l'hypothèse que PODXL peut avoir un rôle dans l'OGD. EMT peut expliquer pourquoi les patients présentant une expression élevée de PODXL ont une moins bonne survie.

La force de cette étude est une grande cohorte de patients atteints de cancer gastrique et un long suivi avec le temps de suivi clinique fiable et les données de survie. Par la technique TMA, seules de petites zones de la tumeur sont évalués par rapport à l'ensemble des sections de tissus. Dans le cancer colorectal, Larsson et al. [22] ont trouvé que l'utilisation de sections entières a permis d'identifier un plus grand nombre de tumeurs que PODXL-positive que fait l'analyse TMA. Parce que l'expression PODXL est hétérogène, l'utilisation de la technique TMA peut conduire à une sous-estimation des cas positifs. La notation des deux monoclonal-anticorps polyclonaux et d'expression d'anticorps a été pour certains spécimens difficiles; cas avec seulement quelques cellules cancéreuses et celles dans lesquelles la valeur des cellules cancéreuses était non identifiables ont donc été exclus de l'analyse. Ceci, en partie, explique le nombre élevé de cas exclus. D'autre part, la technique TMA permet l'analyse de grandes cohortes de patients avec une méthode de coloration homogène.

En conclusion, PODXL immunocoloration sert comme un marqueur indépendant de mauvais pronostic dans le cancer gastrique. Ceci est, à notre connaissance, le premier rapport sur la valeur pronostique de l'expression PODXL dans le cancer gastrique. Les études futures devraient confirmer cette association et de résoudre les mécanismes par lesquels PODXL affecte le développement et le comportement du cancer gastrique.

Remerciements

Nous remercions Päivi Peltokangas et Elina Aspiala pour leur excellente assistance technique.

• Les types de cancer de l'estomac
• PLOS ONE: DBGC: Une base de données de cancer gastrique humain