PLOS ONE: Affinity Maturation de l'anticorps monoclonal 1E11 par randomisation ciblée dans les régions CDR3 Optimise anticorps thérapeutique ciblant HER2-positif cancer gastrique

Résumé

Anti-HER2 murin 1E11 anticorps monoclonal a une activité anti-tumorale forte et synergique dans les cellules de cancer gastrique HER2 surexprimant lorsqu'il est utilisé en association avec le trastuzumab. Nous actuellement optimisé cet anticorps pour la thérapeutique humaine. D'abord, les régions déterminant la complémentarité (CDR) de l'anticorps de souris ont été greffées sur des gènes variables d'immunoglobulines de lignée germinale humaine. Aucune différence d'affinité et l'activité biologique a été observée entre chimère 1E11 (ch1E11) et 1E11 humanisé (hz1E11). Ensuite, la maturation d'affinité de hz1E11 a été réalisée par la répartition aléatoire des résidus CDR-L3 et H3, suivi par une sélection rigoureuse biopanning. la pression de sélection en faveur Milder la sélection d'une plus grande diversité des clones, tandis que les plus élevés stringence de sélection a donné lieu à la convergence de la sortie de panoramique sur un plus petit nombre de clones ayant une affinité améliorée. Le clone 1A12 avait quatre substitutions d'acides aminés dans les CDR-L3 et a montré une augmentation de 10 fois de l'affinité par rapport au clone parental et augmenter la puissance dans un in vitro
dosage de l'activité anti-proliférative avec un cancer gastrique HER2 overepxressing cellules. Le clone 1A12 a inhibé la croissance tumorale de modèle de xénogreffe NCI-N87 avec une efficacité similaire à trastuzumab seul, et le traitement combiné de 1A12 et trastuzumab complètement retiré les tumeurs établies. Ces résultats suggèrent que humanisé et maturation d'affinité anticorps monoclonal 1A12 est une molécule hautement optimisé pour le développement thérapeutique futur contre les tumeurs HER2-positives

Citation:. Ko BK, Choi S, Cui LG, Lee YH, Hwang IS, Kim KT, et al. (2015) Affinity Maturation de l'anticorps monoclonal 1E11 par randomisation ciblée dans les régions CDR3 Optimise Therapeutic Antibody Ciblage de HER2-positif cancer gastrique. PLoS ONE 10 (7): e0134600. doi: 10.1371 /journal.pone.0134600

Editeur: Mitchell Ho, National Cancer Institute, NIH, ÉTATS-UNIS

Reçu le 14 Avril 2015; Accepté 12 Juillet 2015; Paru le 30 Juillet, 2015

Droit d'auteur: © 2015 Ko et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et

financement:. Cette étude a été soutenue par AbClon Inc., et par la national Research Foundation de Corée (NRF) de subvention à HS pour Medicinal Bioconvergence Research Center (NRF-2013M3A6A4044991) . Le bailleur de fonds commercial (AbClon Inc.) fourni un soutien sous la forme de salaires pour les auteurs (BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK et JSL) mais n'a pas eu un rôle supplémentaire dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, décision de publier, ou de la préparation du manuscrit. Les rôles spécifiques de ces auteurs sont énoncés dans la section 'auteur de contributions

Intérêts concurrents:. BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK et JSL sont tous employés par AbClon Inc. et peut posséder son Stock. HS est le conseil versé à AbClon Inc. et possède également son stock. Abclon poursuit les brevets et le développement de produits sur des composés qui sont mentionnés dans le présent document. BKK, SC, LGC, YHL, ISH, KTK et JSL sont tous actuellement employés par le bailleur de fonds commercial de cette recherche AbClon Inc. et peuvent posséder son stock. HS est actuellement payé conseil à AbClon Inc. et possède également son stock. AbClon a un brevet enregistré en Corée (KR10-1453462, des anticorps capables de se lier spécifiquement à HER2) et a déposé une demande PCT (PCT /KR2014 /004317, des anticorps se liant spécifiquement à HER2) dans laquelle BKK, YHL, ISH, KTK et JSL sont répertoriés comme inventeurs. AbClon poursuit également le développement de produits sur les anticorps, d'affinité mûri humanisés qui sont mentionnés dans le présent document. Ceux-ci ne modifient pas l'adhésion des auteurs à tous les PLOS ONE politiques sur les données et les matériaux de partage.

Les anticorps monoclonaux Introduction des traitements traditionnels en oncologie et les maladies auto-immunes, et devraient jouer un rôle important à l'avenir du traitement de la maladie [1, 2]. Plus de 30 anticorps recombinants sont actuellement approuvés par la Food and Drug Administration, dont environ la moitié sont des anticorps anti-cancer. Le cancer gastrique est l'un des cancers les plus courants et est la troisième principale cause de décès par cancer dans le monde [3]. Dans le cancer gastrique, la surexpression du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), le récepteur du facteur de croissance épidermique humain 2 (HER2) et HER3 est corrélée à un mauvais pronostic [4, 5]. Récemment, le HER2 ciblant monoclonal trastuzumab d'anticorps a été approuvé pour le traitement du cancer métastatique de jonction gastrique et gastro- HER2-positif en fonction des résultats du trastuzumab avec la chimiothérapie dans le cancer avancé de l'estomac (TOGA) essai clinique HER2-positif [6].

des combinaisons particulières d'anticorps mutuellement non compétitifs ciblant l'activité anti-tumorale même augmentation des récepteurs in vitro
et in vivo
. Combinaison de l'HER2 ciblage des anticorps, trastuzumab et pertuzumab, montre une efficacité accrue dans les cancers du sein HER2 surexprimant [7]. Les avantages de la combinaison de pertuzumab et le trastuzumab ont encore été démontrée dans des essais précliniques et cliniques [8, 9]. D'autres anticorps HER2-ciblage montrant une meilleure efficacité en combinaison que comme agents simples, et ont montré cohérente régulation à la baisse des niveaux HER2 et les effets combinés bénéfiques dans des modèles de souris [10]. L'efficacité accrue des combinaisons d'anticorps a également été démontrée avec des anticorps ciblant l'EGFR [11, 12] et le récepteur du facteur de croissance endothélial vasculaire 3 (VEGFR3) anticorps ciblé vers [13].

anticorps thérapeutiques généralement sont largement conçus pour posséder des propriétés biologiques et physico-chimiques souhaitables, comme une faible immunogénicité, une grande affinité et spécificité, les fonctions effectrices optimales et une bonne solubilité et la stabilité [14]. En particulier, l'humanisation d'anticorps et la maturation d'affinité sont deux des procédés d'ingénierie les plus fréquemment utilisés durant l'élaboration des anticorps thérapeutiques candidats. Immunogénicité d'anticorps thérapeutique limite l'utilité et l'efficacité clinique par la production d'anticorps anti-drogue [15] et l'humanisation des anticorps de souris ou d'autres espèces est maintenant une procédure standard pour le développement d'anticorps thérapeutiques. Quelques méthodes d'humanisation ont été développés qui utilisent des approches soit rationnelles ou empiriques [16]. La région déterminant la complémentarité (CDR) de greffage approche, une méthode pour surmonter la réponse anticorps anti-chimérique humain (HACA) [17] est une méthode d'humanisation bien établie. Cependant, le greffage direct de CDR murins sur une séquence d'accepteur d'ossature humaine se traduit souvent par une perte d'affinité, de sorte de back-mutations de résidus de région d'ossature (résidus de la zone Vernier) supportant la structure des boucles CDR est souvent nécessaire [18]. Pour in vitro
maturation d'affinité, trois approches de diversification sont généralement utilisés: la mutagenèse aléatoire par exemple PCR error-prone, la randomisation des résidus ciblés à l'aide d'oligonucléotides dégénérés, et brassage de chaînes. Dans l'approche de randomisation ciblée, CDR sont la cible logique pour la randomisation dans la plupart des cas parce que hypermutation somatique a évolué pour favoriser des mutations dans les CDR d'anticorps [19], et CDR-H3 et CDR-L3 ont tendance à dominer l'interaction anticorps-antigène [ ,,,0],20]. L'un des principaux problèmes liés à la randomisation ciblée est de sélectionner les positions qui ne sont pas essentiels pour la liaison à l'antigène, mais qui peut améliorer l'affinité lorsque la substitution optimale des acides aminés est faite. balayage Alanine peut aider à déterminer les résidus à randomiser, surtout quand CDRs sont longues. Parfois, une mutation d'alanine lui-même augmente l'affinité des anticorps [21].

Nous avons déjà mis au point un anticorps murin ciblant HER2 (clone 1E11), qui montre une activité antitumorale synergique en association avec le trastuzumab dans surexprimant HER2 lignées cellulaires de cancer gastrique [22 ]. Dans ce rapport, nous décrivons comment nous avons optimisé l'1E11 pour un anticorps thérapeutique par greffage de CDR à immunoglobulines de lignée germinale humaine gènes variables et la maturation d'affinité par randomisation ciblée de CDR-H3 et CDR-L3. L'anticorps 1E11 optimisé (clone 1A12) montre une activité antitumorale synergique dans des modèles de xénogreffe de cancer gastrique HER2-positif en association avec le trastuzumab. Il a été observé que pour le 1E11 de clone, les gènes variables germinales humaines sont des accepteurs appropriés pour l'humanisation sans réduction d'affinité, et la substitution des résidus CDR-L3 qui ne sont pas essentiels pour la liaison d'antigène a été suffisant pour améliorer l'affinité de plus de 10 fois.

matériels et méthodes

lignées cellulaires et matériaux

cellules NCI-N87 ont été achetés auprès de American type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) et OE-19 cellules ont été obtenus à partir de la collection européenne de la culture cellulaire (ECACC, Porton Down, Royaume-Uni). Le milieu de culture cellulaire est un milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) et les antibiotiques et les cellules ont été cultivées à 37 ° C sous 5% de CO _{2. Trastuzumab et palivizumab a été produit par Genentech (South San Francisco, CA, USA) et MedImmune, LLC (Gaithersburg, MD, USA), respectivement. ChromPure IgG humaine (Jackson Immuno, West Grove, PA, USA) a été utilisé comme anticorps de contrôle IgG humaine pour in vitro
essais. Les anticorps IgG ont été produits en utilisant le système Freestyle 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) et purifiés en utilisant une protéine-chromatographie d'affinité (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Endotoxine a été enlevé avec un Kit endotoxines Removal (GenScript, Piscataway, NJ, USA), et les niveaux d'endotoxines ont été déterminées en utilisant un kit de détection d'endotoxines (GenScript). Les protéines recombinantes ont été produites sous forme de protéines sécrétées en utilisant le système Freestyle 293 et ​​purifiés en utilisant la protéine A ou la chromatographie Ni-NTA (Qiagen, Valencia, CA, USA) pour Fc-tagged ou marquage His protéines, respectivement.}

mutagenèse alanine-scanning et Fab purification

la mutagenèse dirigée par balayage d'alanine a été réalisée par mutagenèse par PCR en utilisant QuickChange kit de mutagenèse dirigée sur site (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). des protéines Fab mutants ont été exprimés et purifiés afin d'évaluer l'importance de chaque résidu pour l'activité de liaison à l'antigène. En bref, Escherichia coli
cellules DH5a transformées avec le vecteur pComb3X hébergeant les gènes Fab mutants ont été cultivées à 28 ° C dans un bouillon SB. L'expression a été induite avec 1 mM d'isopropyl β-D-thiogalactopyranoside 1 lorsque la densité optique (600 nm) de la culture atteint 0,8. Les culots cellulaires ont été remis en suspension dans un tampon d'extraction refroidi (120 mM de Tris, pH 8,0, EDTA 0,3 mM et 300 mM de saccharose) et on a incubé sur de la glace pendant 30 minutes pour l'extraction périplasmique. Le chlorure de magnésium (2,5 mM) a été ajouté à l'extrait clarifié après centrifugation pour récupérer l'EDTA libre avant la Chromatographie d'affinité d'ions métalliques immobilisés (IMAC) purification. protéines Fab purifiées ont été utilisées pour l'essai de liaison ELISA et k
_{off analyse par résonance plasmonique de surface (SPR).}

Affinity maturation

humanisé 1E11 clone dans pComb3X vecteur en tant que format de Fab a été utilisé comme matrice pour une extension de chevauchement de la réaction en chaîne par polymérase (PCR), la mutagénèse, comme décrit précédemment [23]. Les oligonucléotides dégénérés (DNA Technologies intégré, Coralville, IA, USA) 5'-CTGCCCGAAGGTCCAGGGMNNMNNMNNMNNCTGCTGGCAGTAATAAGTAGC-3 '(inverse) et 5'-GTCTACTATTGTGCTAGA42S43S11S11S24S14S34STTCGACTACTGGGGCCAGGG-3; (Avant) ont été utilisées pour la bibliothèque L-NNK et H-XXS, respectivement. N représente A, C, G ou T; M représente C ou A; et S représente G ou plusieurs positions de bases C numérotées indiquent les nucleotides mélangés à la main composées de 70% d'une base et 10% de chacun des trois autres bases: 70% de base de fréquence est G, A, T et C pendant 1, 2, 3 et 4, respectivement. Pour la bibliothèque H 2AA, un mélange équimolaire des oligonucléotides mutagènes en avant suivantes ont été utilisées: 5'-GTCTACTATTGTGCTAGANNKNNKGGTGGGACCGCCTCCTTCGAC-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACNNKNNKGGGACCGCCTCCTTCGACTAC-3', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGNNKNNKACCGCCTCCTTCGACTACTGG-3 ', 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTNNKNNKGCCTCCTTCGACTACTGGGGC-3' , 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGNNKNNKTCCTTCGACTACTGGGGCCAG-3 'et 5'-GTCTACTATTGTGCTAGACACCTGGGTGGGACCNNKNNKTTCGACTAC TGGGGCCAGGG-3'. K représente G ou T. Après deux tours de l'extension de chevauchement PCR, ADN de la banque Fab avec une CDR randomisée a été coupé avec Sfil, ligaturées dans le vecteur phagemide Sfil digéré pComb3X et électroporation dans E
. coli
souche ER2537 (New England Biolabs, Beverly, MA, USA).

liants haute affinité ont été sélectionnées en utilisant soluble biotinylé protéine HER2-ECD. liants perles ont été pré-appauvries par incubation de la banque de phages d'anticorps avec 100 ul de Dynabeads M-280 Streptavidin pré-bloqué (Invitrogen) pendant 1 heure avec une rotation lente à température ambiante. protéine biotinylée HER2-ECD (100 nm- 12:01) a été ajouté à la bibliothèque d'anticorps pré-appauvrie et incubée pendant 1 heure avec rotation à température ambiante. Ensuite, 50 ul de billes magnétiques de streptavidine bloquées ont été ajoutés et mis en incubation sur rotateur pendant 15 minutes. Billes ont été lavées 10 fois avec 1 ml de Tris-solution saline tamponnée au Tween 20 (TBST) et deux fois avec 1 ml de PBS. Les phages liés ont été élues par incubation des perles avec 1 ml de triéthylamine 100 mM pendant 8 minutes, puis neutralisé avec 0,5 mL de Tris 1 M, pH 7,4.

ELISA activité de liaison essai

Des anticorps ont été ajoutés à Costar plaques à 96 puits dans la région de la moitié (Corning Corning, NY, USA produit n ° 3690) enduites avec 1 ug /ml de l'antigène. Après incubation à température ambiante pendant 1 heure, les plaques ont été lavées trois fois avec TBST et incubées avec le lapin peroxydase anticorps-raifort anti-humaine (HRP) (Pierce, Rockford, IL, USA) pour les anticorps IgG et rat anti-HA-HRP (Clone F10, Roche Life science, Bâle, Suisse) pour les anticorps Fab, respectivement. Les plaques ont été lavées trois fois, tétraméthylbenzidine (TMB) de la peroxydase (SurModics, Eden Prairie, MN, USA) a été ajouté et les réactions ont été stoppée en ajoutant 1 N d'acide sulfurique (Duksan, Ansan, Corée). L'absorbance à 450 nm a été mesurée en utilisant un instrument Victor X3 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

Surface résonance plasmonique analyse

Pour k
_{off analyse des protéines Fab, HER2-ECD-His protéine est immobilisée sur la surface d'une puce de capteur CM5 (GE Healthcare) en utilisant le procédé de couplage d'aminé à 2000 unités de réponse (RU) environ. protéines Fab purifiées ont été injectés à 2 pg concentration /ml et un taux de 50 ul /minute. Pour k
off analyse des anticorps IgG de chèvre anti-IgG humaine (γ) (Invitrogen, Cat. No. H10500) a été immobilisé sur la puce de capteur CM5 par couplage amine, et des anticorps ont été capturés au 1 pg /ml pendant 4 minutes et stabilisé pendant 5 minutes à un débit de 50 ul /minute. HER2-ECD-His a été injecté à une concentration de 160 nM. Pour les mesures d'affinité, les anticorps ont été capturés à environ 50 RU de chèvre anti-IgG humaine (γ) immobilisé sur une puce CM5. HER2-ECD-His protéine a été injectée à des concentrations allant de 0 à 640 nm. Sensorgrammes ont été obtenus à chaque concentration et évaluées en utilisant le logiciel BIAevaluation. Pour épitope binning, sous forme d'IgG de hz1E11 a été immobilisé sur CM5 puce de capteur surfaces séparées à environ 1000 unités d'intervention. HER2-ECD-His (320 nM) et des anticorps (1 pg /ml) ont été ajoutés successivement pendant 4 minutes et stabilisé pendant 5 minutes à un débit de 50 ul /minute.}

La viabilité des cellules test

les cellules ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits (Corning) dans le FBS à 10% contenant du milieu et pré-cultivées pendant 24 heures. Les cellules ont été traitées avec des anticorps aux concentrations indiquées et la culture pendant 4 jours. Réactif WST-1 (Dogen EZ-Cytox; Daeil service Lab, Séoul, Corée) a été utilisé pour mesurer la viabilité cellulaire. La viabilité cellulaire relative a été calculée en divisant l'absorbance de chaque puits par l'absorbance moyenne des puits PBS-traités dans chaque plaque.

xénogreffe étude

souris femme nue athymique (Daehan Biolink, Chungbuk, Corée ) ont été injectés par voie sous cutanée dans la zone de flanc gauche avec 5 x 10 ^{6 des cellules NCI-N87 dans Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Les tumeurs ont été laissées se développer jusqu'à environ 200 mm 3 dans la taille et la souris ont ensuite été répartis au hasard en groupes. Les animaux ont reçu une administration intraperitoneale d'anticorps aux doses indiquées deux fois par semaine. Les volumes des tumeurs ont été calculés en utilisant la formule (L × W × W) /2, où L représente le plus grand diamètre de la tumeur et W représente le plus petit diamètre de la tumeur. Deux voies ANOVA à mesures répétées suivies de post-test de Bonferroni a été réalisée pour l'analyse statistique des études animales growth.All tumorales ont été menées en conformité avec les lignes directrices du "Guide pour les soins et l'utilisation des animaux» du NIH et un protocole approuvé reçu par Comité Institution soin et l'utilisation des animaux de l'entreprise.}

Humanisation de

Résultats de la 1E11 menée par greffage de CDR à des gènes de la lignée germinale humaines

pour développer l'anticorps humanisé, VH et VL séquences du murin 1E11 ont été comparés avec la lignée germinale humaine et V J gènes en utilisant des répertoires IMGT /V-QUEST outils d'analyse [24]. Pour la chaîne lourde, IGHV3-48 * 03 et IGHJ4 * 01 présentaient la plus forte homologie avec les 1E11 homologues, partageant 85% et 87% d'identité, respectivement. Pour la chaîne légère, humaines IGKV1-39 * 01 et IGKJ1 * 01 gènes affichent une identité de 80% et 81%, respectivement. Ces gènes humains ont été sélectionnés en tant que séquences acceptrices pour le greffage des CDR murines. Entre la zone Vernier, qui se compose de résidus dans la région de charpente qui sont impliquées dans la présentation des structures de CDR en soutenant les boucles CDR [18, 25], un seul résidu en position 49 _{H de chaîne lourde différente entre murins et des séquences humaines. Par conséquent, 1E11 humanisé, hz1E11, n'a qu'un seul résidu de souris dans les régions de charpente (figure 1).}

Activité de liaison de la région extracellulaire à hz1E11 (DPE) de HER2 était équivalente à celle de ch1E11 (figure 2A), et l'affinité de trastuzumab, ch1E11 et hz1E11 était de 3 nM, 23 nM et 23 nM, respectivement. Nous avons également confirmé que hz1E11 lié à sous-domaine IV comme le ch1E11 parental. Trastuzumab se lie également à la sous-domaine IV [26]. Les in vitro
activités anti-prolifératives de hz1E11 en monothérapie et en association avec le trastuzumab étaient également équivalentes à celles des ch1E11 (Fig 2C). Dans l'étude précédente [22], il a été rapporté que ch1E11 avait vivo
activité antitumorale in comparable à celle de trastuzumab en monothérapie, et la combinaison de ch1E11 et trastuzumab a donné lieu à l'indice de régression de la tumeur (TGI) de 95,1%. De même, hz1E11 en tant qu'agent unique avait même in vivo
activité antitumorale à trastuzumab (S1 Fig) et la combinaison de hz1E11 avec le trastuzumab a également montré une activité anti-tumorale dose-dépendante dans le modèle NCI-N87 xénogreffe de souris ( La figure 2D). traitement de combinaison d'anticorps à 1 mg /kg chacun des hz1E11 et trastuzumab a donné lieu à une activité anti-tumorale similaire avec le trastuzumab seul traitement à 10 mg /kg, et à 2,5 mg /kg combinaison et au-dessus de la tumeur établie stabilisée ou a commencé à régresser (Non statistiquement différence significative [ P
< 0,05] a été observée chez 2,5, 5 et 10 mg /kg combinaisons). Ces résultats montrent que hz1E11 a l'affinité et l'activité biologique équivalente à ch1E11, et que hz1E11 améliore l'activité anti-tumorale de trastuzumab lorsqu'il est utilisé en combinaison.

balayage Alanine du CDR-H3 et CDR-L3

pour déterminer les résidus critiques pour l'interaction antigène-anticorps, une mutagenèse par balayage d'alanine a été effectuée dans les régions CDR3 des chaînes lourdes et légères (CDR-H3 et CDR-L3). Les effets des mutations ont été évaluées par l'analyse de l'activité de liaison des protéines Fab purifiés par ELISA indirecte. Dans CDR-H3, substitution alanine en position Gly98 _{H abolit la liaison du Fab à HER2, et mutants HA G97 HA et T99 a montré une activité réduite de liaison (figure 3A). Dans le CDR-L3, les substitutions d'alanine ont des effets beaucoup plus faibles (figure 3B). Le k
off valeurs des mutants de balayage alanine ont été analysées en utilisant SPR contre immbolized protéine HER2-ECD. Nous avons confirmé que le G98A mutant de chaîne lourde complètement perdu des activités de liaison, et le voisin T99 HA et G97 mutants HA a abouti à 32 fois et 17 fois plus élevé k
off valeurs respectivement (figure 3C). Ces résultats indiquent que la chaîne lourde Gly98 H est une fonction critique et ses résidus adjacents sont également fonctionnellement importants pour l'interaction antigène-anticorps.}

Affinity maturation des hz1E11

La maturation d'affinité de hz1E11 a été menée par la construction de la chaîne lourde ou légère CDR3 variante bibliothèques, suivie par la sélection des banques d'anticorps de phages d'équilibre. Pour la chaîne légère, les résidus de glutamine au niveau des positions 89 _{L et 90 L ne sont pas diversifiés parce glutamine se trouve couramment à ces positions de neuf séquences d'acides aminés-longCDR-L3 à 59% et 73% des fréquences, respectivement [ ,,,0],27]. Positions 91 L-94 L ont été randomisés en utilisant un codon NNK dégénérée (L-NNK). Pour la chaîne lourde, les positions 95 H -100a H ont été randomisés en utilisant un codon XXS (H-XXS), conçu de telle sorte que les première et deuxième positions nucléotidiques de la diversification des codons de la base de type sauvage produit avec 70 % de chance, chacun des trois autres bases est produit à 10% de la fréquence, et la troisième lettre des codons ont été synthétisés en utilisant un mélange équimolaire de G et C (figure 4A). liants à affinité élevée ont été choisis parmi stringence élevée ou de faible stringence panning (tableau 1).}

Par rapport à la faible stringence panning de la bibliothèque de L-NNK dans lequel 100% des deuxième, troisième, et les clones de sortie de quatrième ronde dépistées étaient ELISA positifs, pour la haute stringence panoramique la sortie de quatrième ronde donné aucun liant à tous, et seulement un tiers des clones de sortie du troisième cycle étaient ELISA positif (tableau 1). Les clones sélectionnés à partir de la bibliothèque CDR-L3 inclus de nombreuses séquences qui avaient tous les quatre positions CDR-L3 randomisées mutés, contrairement aux bibliothèques CDR-H3 à partir de laquelle la plupart des clones sélectionnés a conservé la séquence de type sauvage dans des positions 97 _{H -100 H (voir ci-dessous). stratégies de panoramique différentes ont donné des motifs différents d'enrichissement de séquence. Par exemple, la chaîne légère variante clone 1A12 (Q 89LQNAYAPWT 97L) a été isolé à partir de la haute stringence panoramique mais pas de la faible stringence panoramique, et la lourde variante de chaîne clone 1B12 (N 95HYGGTASFDY 102H) a également été sélectionné seulement de la haute rigueur panoramique. Fait intéressant, 59% des anticorps uniques dans 4 ^{ème sortie avec une faible stringence panoramique de la bibliothèque de L-NNK avait une alanine à la position 92 L, en ligne avec l'analyse de balayage d'alanine (figure 4B).}}

Presque tous les clones qui ont été isolés à partir de la bibliothèque H-XXS avaient la même séquence à 97 _{H -100 H comme le clone parental, et a montré une enrichissement claire de la séquence Asn-Tyr à 95-96. Pour mieux évaluer la contribution des résidus CDR-H3 à l'antigène-anticorps de liaison, une bibliothèque CDR-H3 supplémentaire a été construit avec NNK double codon aléatoire balayage du CDR-H3 (H-2AA, figure 4A). En basse stringence panoramique, mutants au niveau des positions 95 H, 96 H, 99 H, 100 H, et 100a H ont été sélectionnés dans le panoramique de première ronde, seulement, mais mutants aux positions 95 H et 96 H ont été enrichies dans la sortie de quatrième ronde (tableau 1). Nous ne pouvions pas détecter les mutants à des positions Gly97 H et Gly98 H dans toutes les stratégies et les sorties panoramiques.}

Affinity et l'activité de liaison des clones sélectionnés

Pour évaluer l'effet de la combinaison des variantes de chaîne lourde et légère affinité mûri, les anticorps IgG avec des combinaisons de chaînes lourdes et légères affinité mûri ont été produits et leur k
_{off valeurs étaient de déterminer en utilisant l'analyse SPR (tableau 2). Parmi deux variantes de chaînes légères et de deux variantes de chaîne lourde, 1A12 dérivé de L-NNK a montré la plus grande amélioration (16 fois). La combinaison de la chaîne de 1A12 avec la chaîne lourde optimisée du clone 1B12 de la lumière a entraîné une amélioration de 24 fois dans k
off sur hz1E11 parental, tandis que pour les autres combinaisons k
off valeurs étaient similaires ou supérieure à celle de 1A12. Étant donné que le 1,5 fois une amélioration supplémentaire de la combinaison de L-1A12 + H-1B12 n'a pas été significativement grande, les clones 1A12 et 1F11 (variants de la chaîne légère) ont été choisis pour une caractérisation plus poussée pour minimiser la différence de séquence des anticorps à affinité mature de l'organisme parental cloner. Les constantes de dissociation pour la maturation d'affinité des clones, également déterminée par l'analyse SPR ont plus de 10 fois inférieure à celle du hz1E11 clone parental et comparable à celle du trastuzumab (tableau 3).}

Afin de déterminer si affinité les clones de hz1E11 -matured se lient au même epitope que l'hz1E11 parentale, la liaison de 1A12 et 1F11 au sein HER2-ECD qui a été pré-lié hz1E11 a été analysé par SPR. Les deux clones ont été incapables de se lier au monomère HER2-ECD-His protéine capturée par 1E11 immobilisée alors que le trastuzumab pourrait (figure 4C). En outre, il a été confirmé que l'épitope 1A12 ne chevauche pas celui du trastuzumab (figure 4D). Clones 1A12 et 1F11 lient également au sous-domaine IV comme leur clone parental hz1E11 (Fig 4E). Ces données indiquent que des épitopes de 1A12 et 1F11 ont pas été modifiées par le processus de maturation d'affinité.

Efficacité de maturation d'affinité clones hz1E11

Les deux 1A12 et 1F11 anticorps a montré une légère augmentation des activités anti-prolifératives comme monothérapie par rapport à hz1E11 sur des lignées cellulaires de cancer gastrique qui surexpriment HER2 (figure 5A et 5B) NCI-N87 et OE-19, alors qu'en association avec le trastuzumab, leurs activités anti-prolifératives était supérieure à celle du trastuzumab seul et équivalent à hz1E11 trastuzumab . L'activité anti-proliférative de 1A12 et 1F11 a été confirmée in vivo
dans le modèle de xénogreffe NCI-N87. une activité antitumorale supérieure était évidente en association avec le trastuzumab à celle de chaque agent seul dans les deux modèles de xénogreffes (figure 5C).

Discussion

En dépit des résultats encourageants cliniques obtenus avec l'anticorps ciblant HER2 dans le trastuzumab traitement du cancer gastrique, il y a encore des besoins de HER2 thérapies ciblées plus puissants [6]. Combinaison d'anticorps non concurrents ciblant des récepteurs, tels que HER2, EGFR, et VEGFR3, peut augmenter l'activité anti-tumorale dans des modèles pré-cliniques [11-13, 28]. Pertuzumab, un autre anticorps HER2-ciblage, est approuvé pour une utilisation en association avec le trastuzumab dans le traitement du cancer du sein métastatique [29]. Dans une étude précédente, nous avons développé un nouveau HER2 ciblant anticorps, 1E11, qui a été démontré que l'activité anti-tumorale significative en tant qu'agent unique et l'effet synergique en association avec le trastuzumab in vitro
et in vivo
[22]. L'activité anti-tumorale de la 1E11 et combinaison de trastuzumab est supérieur non seulement pour le trastuzumab seul traitement, mais aussi à la combinaison de pertuzumab et le trastuzumab. Dans ce rapport, l'humanisation et l'affinité ultérieure maturation de l'anticorps monoclonal de souris hybridome dérivé 1E11 est décrit.

approches initiales pour réduire l'immunogénicité potentielle des régions variables non humains par greffage de CDR dans un cadre humain diminuer de façon significative l'immunogénicité d'anticorps thérapeutiques [15, 17]. Superhumanization utilisant des cadres germinales humains comme modèle a été proposé comme une méthode d'humanisation supérieure pour éviter effectrices putative épitopes de lymphocytes T dérivés par hypermuations somatiques du cadre humain [30-32]. Il a été suggéré que les anticorps codés par les segments de gène de lignée germinale ont une structure souple et capable d'accueillir la liaison à de nombreux antigènes différents [33-35]. Les CDR de souris 1E11 de l'anticorps ainsi qu'un résidu de la zone Vernier V _{H (Ala49 H) ont été greffées sur la variable de lignée germinale humaine et les gènes de jonction ayant la plus forte homologie avec l'anticorps parental (figure 1). L'anticorps humanisé résultant, hz1E11, a montré une affinité presque identique et l'activité biologique de l'anticorps parental (figure 2).}

Sélection de résidus pour la randomisation est une étape critique dans l'approche de randomisation ciblée de la maturation d'affinité en raison des limitations pratiques la taille de la bibliothèque d'anticorps, et des technologies de sélection. le balayage d'alanine et in silico
analyse de la séquence d'anticorps, en particulier dans les CDR, sont utiles pour la sélection des résidus cibles de randomisation et de faciliter le processus de maturation d'affinité. Dans l'analyse de balayage d'alanine de la CDR-H3 de hz1E11, le mutant G98A complètement perdu l'activité de liaison et du mutant G97A montré une activité réduite de liaison (figure 3A). modification directe d'un résidu paratope essentiel se traduit généralement par la perte totale de la capacité de l'anticorps [26, 33, 36] liaison. Par conséquent, une approche plus conservatrice au CDR-H3 randomisation a été employé, en utilisant soit un oligonucléotide mélangé à la main qui est sollicité vers la séquence parentale, ou le jumeau NNS balayage codon aléatoire de CDR-H3. Comme on s'y attendait à partir de l'analyse de balayage de l'alanine, la quasi-totalité des clones qui ont été isolés à partir des banques de CDR-H3 ont la séquence 97 _{H-100A H même que celui du clone parental (G 97HGTAS 100ah) .}

l'alanine résultats de l'analyse indiquent que tous les résidus CDR-L3 sont dispensable, bien que certaines des mutations semble réduire l'affinité (figure 3B). Par conséquent, quatre positions de CDR-L3 (91 _{L-94 L) ont été entièrement randomisés en utilisant le codon NNK dégénérée. L'analyse des séquences des clones sélectionnés a confirmé l'analyse de balayage d'alanine; la majorité des clones sélectionnés à partir de la bibliothèque CDR-L3 avait quatre positions CDR-L3 randomisées changé à partir du résidu parental, contrairement aux résultats d'optimisation CDR-H3 dans lequel la plupart des clones sélectionnés dans les bibliothèques avaient la même séquence que la hz1E11 parentale dans la partie médiane de la CDR (tableau 1). Les clones avec plus d'amélioration d'affinité sont venus de la bibliothèque CDR-L3. Il est probable que le CDR-H3 de hz1E11 est déjà proche de l'optimum et la plupart des mutations, en particulier dans la région 97 H-100 H, sont nuisibles pour l'affinité de liaison, tandis que la séquence CDR-L3 est pas comme optimal et la mutation dans cette région, peut entraîner une amélioration significative de l'affinité. La bibliothèque sorties de panning L-NNK ont été enrichis avec des clones avec un acide aminé hydrophobe à la position 91 L, un petit acide aminé à 92 L, et d'un acide aminé aromatique 93 L. Ce modèle est un peu différente de la séquence CDR-L3 parentale de Q 89LQLYSTPWT 97L et encore suggère que la séquence CDR-L3 de l'anticorps parental 1E11 était sous-optimale et avait donc place à l'amélioration d'affinité.}