PLoS One: Honokiol indukál Calpain glükózfelhasználással szabályozott fehérje-94 hasítása és apoptózis humán gyomorkarcinóma sejtek és csökkenti a tumor növekedés

absztrakt katalógusa

Háttér katalógusa

Honokiol, kis molekulatömegű természetes termék, kimutatták, hogy rendelkeznek erős daganatellenes és antiangiogén tulajdonságokat. A molekuláris mechanizmusok és képes az anti-gyomorrák továbbra is ismeretlenek. Kimutatták, hogy az anti-apoptotikus funkciója a glükóz-szabályozott fehérjék (GRP) azt jósolja, hogy azok indukciója a neoplasztikus sejtek vezethet a rák progressziójának és gyógyszer-rezisztencia. Megvizsgáltuk a hatását honokiol szabályozására vonatkozó GRP és az apoptózis humán gyomorrák sejtek és a tumor növekedését. Katalógusa

Módszertan és legfontosabb eredmények katalógusa

A kezelés különböző humán gyomorrák sejtek honokiol vezetett indukciója GRP94 hasítás, de nem befolyásolja GRP78. Elhallgattatása GRP94 kis interferáló RNS (siRNS) miatt apoptózist. Kezelése sejtek honokiol vagy kemoterápiás szerrel etopozid fokozott a növekedés az apoptózis és GRP94 lebomlás. A kalpain aktivitás és kalpain-II (m-kalpain) fehérje (de nem kalpain-I (μ-calpain)) szint is lehetne növelni honokiol. Honokiol-indukált GRP94 down-regulációja és apoptózist gyomorrák sejtek visszafordítható siRNS célzási kalpain-II és kalpain inhibitorok. Továbbá, az eredmények a immunfluoreszcens festéssel és immunprecipitációt kiderült, egy specifikus kölcsönhatás a GRP94 a kalpain-II sejtekben következő honokiol kezelést. Mi következő megfigyelhető, hogy a tumor GRP94 túlzott kifejeződése és a tumor növekedését a BALB /c csupasz egerek, amelyeket beoltottunk a humán gyomor rákos sejtek MKN45 vannak jelentősen csökkent honokiol kezelést.

Következtetések és jelentőség

Ezek az eredmények az első bizonyíték arra, hogy honokiol indukálta calpain-II-közvetített GRP94 hasítás okoz humán gyomorrák sejt apoptózist. Azt is javasoljuk, hogy honokiol lehet egy lehetséges terápiás szer javítja a klinikai kimenetelét gyomorrák. Katalógusa

Citation: Sheu ML, Liu SH, Lan KH (2007) Honokiol indukál Calpain glükózfelhasználással szabályozott fehérje-94 hasítása és apoptózis humán gyomorkarcinóma sejteket, csökkenteni a tumor növekedését. PLoS ONE 2 (10): e1096. doi: 10,1371 /journal.pone.0001096 katalógusa

Akadémiai Kiadó: Hany El-Shemy Kairói Egyetem, Egyiptom katalógusa

Beérkezett: június 26, 2007; Elfogadva: október 10, 2007; Megjelent: október 31, 2007 katalógusa

Copyright: © 2007 Sheu et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka támogatott kutatási támogatást Nemzeti Tudományos Tanács Tajvan (NSC95-2320-B040-005). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák a második leggyakoribb daganatos halálok a világon. [1] Közel kétharmada az esetek fordulnak elő a fejlődő országokban, és 42% -ban egyedül Kínában [1], [2]. A molekuláris célpontok és mechanizmusa rossz prognózis még nem teljesen tisztázottak. A kezelés a lokálisan előrehaladott gyomorrák továbbra is komoly kihívást jelent. Jelentős előrelépések ellenére a kezelés, a klinikai kimenetelt gyomorrákos betegek továbbra is gyenge. Eltekintve a műtét, a szerepe az adjuváns kezelés nem bizonyított [2], [3]. Így annak szükségességét, hogy a potenciális új terápiás és kemopreventív ágensekkel nyilvánvaló.

Honokiol, egy aktív komponenst izoláljuk és tisztítjuk a Magnólia officinalis katalógusa, kimutatták, hogy rendelkeznek az anti-oxidációs [4], szemben a lipidperoxidáció [5] és gyulladásgátló in vitro
és a in vivo
[6], [7]. Honokiol is kimutatták, hogy egy szisztémásán elérhető, és nem-toxikus inhibitora, az angiogenezis [8]. A legutóbbi vizsgálatok szerint a honokiol indukálja a kaszpáz-függő apoptózis krónikus limfocitás leukémia sejtek, és legyőzi a hagyományos gyógyszer-rezisztencia a humán myeloma multiplex indukciós kaszpáz-függő és -független apoptózist [9], [10]. Bár a teljes értékelését a lehetséges klinikai vegyületek még nem lehetséges, a farmakokinetikáját honokiol alaposan vizsgálták, felfedve, hogy honokiol elérhető a klinikai rákterápia. Több természetes tartalmazó termékek a különböző terápiás vegyületek hasznos, mert megakadályozza a rosszindulatú daganatok kialakulásának továbbra is felfedezték; Azonban nagyon keveset tudunk az ezek alapjául szolgáló hatásmechanizmusuk vagy azok molekuláris cél.

Glükóz-szabályozott fehérje (GRP) 94 egy leggyakoribb glikoprotein endoplazmás retikulum (ER), és csak azonosítható gerinces. Over-expresszió antiszensz és ribozim megközelítések szövetekben kultúra rendszerek közvetlenül bizonyították, hogy GRP78 és GRP94 lehetett szemben védik a sejteket halál [11] - [13]. A védelmi funkció a GRP is megfigyelhető sugárzásállósági méhnyakrák [14]. Az anti-apoptotikus funkciója a GRP is jósolja, hogy azok indukciója a neoplasztikus sejtek vezethet a rák progressziójának és gyógyszer-rezisztencia [15] - [18]. Kóros állapotok, például a tumornövekedés és a malignitás már javasolták, hogy korrelálnak a citoprotektív protein GRP94 túlzott expressziója [19]. Az áttétes rosszindulatú modellben jelentős hatásossága a GRP94-alapú gén /immunterápia stratégia volt látható, amikor a kombinált sugárterápiával [20]. Az ER közvetlen szerepe aktiválásában részhalmaza kaszpáz aktiváció során az apoptózis során bekövetkező ER stressz [21]. Másrészt, kalpain egy család Ca ^{2 + -függő intracelluláris cisztein proteázok. Mindenütt expresszálódik kalpain-I (μ-calpain) és kalpain-II (m-kalpain) proteázok érintettek apoptosis kialakulását. Egy nemrégiben készült tanulmány kimutatta, hogy mindenütt jelen kalpain elősegítik a kaszpáz-12 és JNK aktiváció során az ER stressz-indukálta apoptózis [22]. Azt is jelezte, hogy a GRP94 Ca 2 + -kötő és az anti-apoptotikus tulajdonságokkal proteolitikus cél kalpain során etopozid-indukált apoptózis [23]. Ezenkívül több kísérleti modellekben az apoptózis, azt már kimutatták, hogy az amino-terminális kalpain inhibitor egység calpastatin hasítható kaszpázok, ami arra utal, a hasítás elengedhetetlen a szabályozás kalpain aktivitás alatt sejthalál [24] - [28] . Kaszpáz-7, amely toborzott a ER stressz által károsított sejtek, hasonlóképpen cleave és aktiválja a kaszpáz-12 [29] - [31]. A hatások a honokiol a GRP kapcsolatos jelző- és apoptózis továbbra is ismeretlen. A jelen tanulmányban feltárt molekuláris mechanizmusok honokiol humán gyomorrák sejt apoptózis és a tumor növekedését in vitro katalógusa és in vivo katalógusa. Váratlanul azt találtuk, hogy GRP94 részt külön proteolitikus hasítás által kalpain során honokiol-indukált apoptózis. Ezek a megfigyelések adhatnak bizonyítja, hogy honokiol egy lehetséges terápiás szer javítja a klinikai kimenetelét gyomorrák. Katalógusa}

Eredmények katalógusa

kinetikája GRP94 proteolitikus hasítás az emberi gyomor rákos sejtvonalak kezelt honokiol katalógusa

elsőként hatását vizsgáltuk honokiol a megnyilvánulásai GRP94 és GRP78 különböző humán gyomorrák sejtvonalakon. Honokiol jelentősen csökkenti a szintjét GRP94 dózis- és időfüggő módon, de GRP78 szinteket nem befolyásolta (ábra. 1 és 2). Kinetikája honokiol indukált GRP94 hasítás különböző humán gyomorrák sejteket ábrán látható. 2. MKN45 vagy SCM-1-sejteket jobban ellenáll a honokiol által indukált válaszok, mint AGS vagy N87-sejtek; szintek GRP94 csökkent a körülbelül 50% kétszer annyi időt. A szinteket a GRP78 fehérjék változatlan marad mind a négy gyomor rákos sejtvonalak. Sőt, vannak kis GRP94 proteinkifejeződésekben normál egér gyomor hámszövetből és humán endothel sejteken képest gyomorrák sejtek (ábra. 1C). Katalógusa

Honokiol indukál GRP94 hasítás összefüggő apoptotikus válasz katalógusa

ábrán látható. 3, honokiol növelte a poli (ADP-ribóz) polimeráz (PARP) hasítását, és a DNS-károsodás által indukálható gén CHOP /GADD153 (egy fehérje már azonosították, hogy közvetítsen az ER stressz által kiváltott apoptózis) szintje MKN45 sejtek dózis- és időfüggő módon. Honokiol 20 és 40 M is kiváltotta a kifejezéseket a hasított kaszpáz-12 és kaszpáz-7 (p20), amely a nagysága növekedés arányos volt az időzítés (ábra. 3B). Ezen kívül, hogy megértsék, hogy GRP94 hasítás részt vett a humán gyomorrák sejtek apoptózisát, az apoptózis detektáltunk GRP94-siRNS-transzfektált sejtekben. Csendesítése GRP94 siRNS által indukált apoptózisának (ábra. 4A) és a csökkent GRP94 fehérje expresszióját (ábra. 4b-a). Azt is összehasonlította a honokiol az apoptózis és GRP94 lebomlás humán gyomorrák sejtek kemoterápiás szerrel etopozid. Az eredmények azt mutatták, hogy a kezelés a sejtek honokiol vagy etopozid fokozott a növekedés az apoptózis (ábra. 4A) és GRP94 lebomlás (ábra. 4B-B). Amikor a sejteket egyidejűleg kezeltük 40 M az etopozid és a 20 M honokiol, egy nagyobb növekedést GRP94 lebomlás, mint ők mutatták (ábra. 4B-B); Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a kombinálása honokiol más daganatellenes szerek lehetnek potenciális terápiás stratégiát. katalógusa

Calpain szükséges honokiol közvetített apoptózis katalógusa

A következőkben határozza meg, hogy a tevékenység kalpain (kalcium -függő tiol-proteázok) lenne által indukált honokiol négy gyomor rákos sejtvonalak. Ábrán látható. 5A, honokiol 20 M fokozott kalpain aktivitás idő-függő módon, amely növekedni kezdett, 15 perc, és elérte a 60 perc, majd esett le, hogy egy alacsonyabb szintű, 4 órán át. A sejteket maradt tapadó alatt az idő folyamán, és nincs veszteség az életképesség (az adatokat nem mutatjuk be). Ábrán. 5B, az eredmények azt mutatták, hogy a növekedés a kalpain aktivitás válaszul honokiol (20 és 40 M) 60 percig, négy gyomor rákos sejtvonalak. Továbbá, kalpain inhibitorok, N-acetil-leu-leu-norleucinal (ALLN), N-acetil-leu-leu-methioninal (ALLM), és a Z-Leu-Leu-CHO, hatékonyan gátolta a növekedést kalpain aktivitás által indukált honokiol az N87 és az SCM-1 sejtek (ábra. 5C). katalógusa

tovább vizsgálni, hogy a csökkent calpain aktivitás veszélyeztetheti a képességét honokiol a apoptózis indukció. Ábrán látható. 6A, honokiol (40 m) indukált sejt apoptózis SCM-1 sejtek, amelyek visszafordítható kalpain inhibitorok (ALLN vagy ALLM). Sőt, honokiol fokozott kalpain-II fehérje, de nem kalpain-I fehérje kifejezések SCM-1 sejtekben (ábra. 7a). Egy siRNS megközelítés knockdown kalpain-II aktivitás vezetett, hogy jelentős csökkentést honokiol (20 M) indukált apoptózis humán gyomorrák sejtek 4 óra elteltével a kezelés (ábra. 6b). SiRNS-calpain-én nem befolyásolja honokiol apoptózist (6B.). Katalógusa

lokalizációja és kölcsönhatása kalpain-II és GRP94 következő honokiol kezelés katalógusa

A következő lépés az volt, hogy feltárja a szerepe kalpain-II honokiol indukálta GRP94 lebomlását. Lézer konfokális mikroszkópos vizsgálat, a lokalizáció calpain-II fehérje határoztuk meg a zöld fluoreszcens, míg a lokalizáció GRP94 határoztuk meg vörös fluoreszcencia. Ábrán látható. 7B, mind calpain-II és GRP94 mutattunk citoplazmában a kolokalizációs humán gyomorrák sejtek. A fluoreszcencia kalpain-II-t fokozatosan nőtt, de fluoreszcenciáját GRP94 fokozatosan csökkent humán gyomorrák sejtek alatt honokiol kezelést. Annak további igazolására, az eredmények a immuncitokémiai festési hogy kalpain-II kölcsönhatásba lép GRP94, a vizsgálatokat a CO-immunprecipitáció és Western-blot a gyomor rákos sejtekben végeztünk. Ábrán látható. 7C, kalpain-II-t specifikusan asszociált GRP94 különböző gyomor rákos sejtek jelenlétében honokiol (20 és 40 M), mint az IgG kontroll. Sőt, azt vizsgáltuk, hogy a proteolitikus aktivitása kaszpáz, proteaszóma vagy katepszin részt vettek a hasítása GRP94. Eredményeink azt mutatták, hogy a kezelés a sejtek kaszpáz inhibitorok (Ac-DEVD-CHO, Z-VAD-FMK és Z-DEVD-fmk-, 50 m), magas dózisú részlegesen blokkolt hasítása GRP94 alatt honokiol-indukálta apoptózis (8A. ) összehasonlítva kalpain inhibitor ALLM 25 m, ami lehet teljesen blokkolja GRP94 hasítás. Előkezeléshez a sejteket a katepszin B gátló CA-074-Me 25 és 50 M és katepszin L inhibitor katepszin L Inhibitor II, 25 és 50, M és proteoszóma inhibitor MG132 0,1-10 M volt képes blokkolni GRP94 hasítás (8B. És 8C) . Továbbá a specifikus hasítása GRP94 által kalpain lehetett megfigyelni alkalmazásával sejtlizátumokat készítünk humán gyomorrák sejtekben (adatokat nem köziünk).

következő vizsgáltuk, hogy a kalpain aktiválás szükséges honokiol-indukált sejtek apoptózisát. Ábrán. 9, a növekedésével kalpain-II fehérje expresszióját és GRP94 degradáció és kaszpáz-7 és a kaszpáz-12 aktiváció által kiváltott honokiol (40 m) megakadályozta farmakológiai kalpain inhibitorok és tranziens transzfekciója siRNS-calpain-II SCM-1 sejtekben.

Honokiol csillapítja tumor GRP94 túlzott expresszió és a tumornövekedést csupasz egerekben

csupasz egereket beoltunk 4 × 10 ^{6 differenciálatlan adenokarcinóma sejtek MKN45 és kezeltük honokiol 0,5 és 1,5 mg /kg vagy a jármű, ha a tumor vált. Immunhisztológiai és Western-blot analízis azt mutatta, hogy GRP94 túlzott expresszió és a felhalmozott tumor régióban, de nem normál gyomor szövetben (ábrák. 10A-A és a 10A-B). Honokiol jelentősen csökkent a felhalmozódása a GRP94 tumorokban összehasonlítva járműirányító (ábrák. 10A-A és a 10A-B). A kifejezés a GRP78 nem befolyásolta (az adatokat nem mutatjuk be). Annak meghatározására, hogy honokiol lehetett elnyomni a tumornövekedést in vivo katalógusa, szilárd tumorokat létre egerekben és az anti-tumor hatását többször injektált honokiol vizsgáltuk. Ábrán látható. 10B, az adminisztráció honokiol 0,5 és 1,5 mg /kg volt jelentős tumorellenes aktivitást. Katalógusa}

Vita katalógusa

itt közölt először, hogy kalpain egy nonlysosomal Ca ^{2 + -aktivált cisztein proteáz, különösen a kalpain-II, kulcsszerepet játszik a hasítása GRP94, de GRP78 nem befolyásolja, és a rendeletben által indukált apoptózis honokiol humán gyomorrák sejtek. Különösen azt feltéve funkcionális bizonyíték, hogy a hasítási a GRP94 upon honokiol kezelés működik, mint egy terápiás előny, tumornövekedés gátlására egér modellje az emberi gyomor karcinóma. Tudomásunk szerint ez az első jelentés azt mutatja, hogy honokiol lehet manipulálni calpain indukálható gardedám fehérje GRP94 lebomlás célpontját apoptózis során. Katalógusa}

Tanulmányok Számos laboratórium mutatott az ER, mint a cél rekesz terápiás szerek összefüggésbe az apoptózis végrehajtás. Citoszol Ca ^{2+ szerepet játszik, mint egy második hírvivő a proapoptosis egyaránt érintett kiváltó apoptózis és szabályozására kaszpázok vagy kalpain [32] - [34]. Egy nemrégiben készült tanulmány kimutatta, hogy kalpain egy fontos közvetítő resveratrol (a természetes növényi polifenol) által kiváltott apoptózis emlőrák [35]. Azt találták, hogy a resveratrol is növeli az intracelluláris Ca 2+, valamint aktiválja a kalpain-közvetített apoptózisra, ami a bomlás a plazmamembrán Ca 2 + -ATPáz izoforma 1 és fodrin a kaszpáz-3 deficiens MCF- 7 sejtekben. Honokiol is beszámoltak indukál Ca 2+ mobilizációt patkány kortikális neuronok és humán neuroblasztóma SH-SY5Y sejtek, feltehetően át a foszfolipáz C aktiválását, és az IP- _{3 receptorok [36]. A jelen vizsgálatban azt találtuk, hogy honokiol képes növelni kalpain aktivitás és kalpain-II fehérje expresszióját, de nem kalpain-I alatt honokiol indukált gyomor rákos sejt apoptózist. Sőt, kalpain inhibitorok és elhallgattatása kalpain-II siRNS jelentősen megfordította a honokiol apoptózist. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a Ca 2 + -triggered kalpain-II aktiválás játszhat potenciális szerepet honokiol-indukált apoptózis.}}

GRP94 /gp96 az ER rezidens HSP90 család. GRP94 fontos szerepet játszik fenntartásában celluláris homeosztázis. Ez a hagyományos koncepció a GRP94 mint fehérje feltekeredés chaperon frissíti a felfedezések GRP elősegítik a tumor proliferációját, metasztázis, a gyógyszer-rezisztencia és immunterápia, melyek jelentős klinikai következményei a prognózis és a kezelés a rák [3]. GRP94 kimutatták, hogy részt tumorképző a rákos sejtvonalak, rágcsáló tumor modellek és humán rákos biopsziák [37] - [39]. Ez összhangban van azzal a megállapítást, hogy a indukciója GRP okoz védő funkciója, mint a túlélés válaszok tápanyag éhezés, acidózis, és hypoxia feltételek, amelyek gyakoriak a gyengén erezett szilárd tumor [11], [40]. Azt is megjelent, hogy a legtöbb GRP tumorsejtekben foglalkozik több chaperon komplexek, míg ez nem a normális sejtekben [41]. Védőoltás egerek tumor eredetű stressz fehérjék GRP94 képes kiváltani tumorellenes immunválaszt, és így jelentős elnyomása tumor növekedését és a metasztázist. A tevékenység a Hsp90-inhibitorok már validált preklinikai emlőrák modellek, mind a single-szer tanulmányok és kombinált hagyományos kemoterápiával [41]. Sőt, azt javasolták, hogy a GRP94 egy fiziológiás szubsztrátja kalpain [23]. Calpain kimutatták, hogy aktiválja az ER membrán, ahol interakcióba lép GRP94, ami annak specifikus proteolitikus hasítással, mint a sejtek mennek által kiváltott apoptózis etopozid [23]. A jelenlegi vizsgálatban azt találtuk, hogy honokiol indukálta GRP94 hasítás és az apoptózis humán gyomorrák sejtek teljesen visszafordítható kalpain inhibitorok és csendesítése kalpain-II által siRNS. Kaszpázinhibitorokkal nagy dózisban részben megfordult a honokiol indukált GRP94 hasítás. Előkezeléshez a sejteket a katepszin B és L-inhibitorok és proteaszóma-inhibitor nem volt képes blokkolni honokiol indukálta GRP94 hasítás. Azt is kimutatták, hogy a hangtompító a GRP94 siRNS indukálhat gyomorrák sejtek apoptózisát. Továbbá, az eredmények a immuncitokémiai festés és immunprecipitációt kiderült, egy specifikus kölcsönhatás a GRP94 a kalpain-II gyomor rákos sejtekben következő honokiol kezelést. A specifikus hasítását GRP94 által kalpain is megfigyelhető alkalmazásával sejtlizátumokat készítünk humán gyomor rákos sejteket. Ezek az eredmények tehát azt sugallják, hogy kalpain-II-közvetített GRP94 hasítás játszik fontos szerepet honokiol-kiváltott gyomor rákos sejtek apoptózisát.

kalpainokat és a kaszpázok két család cisztein proteázok, hogy azok szabályozásában vesz részt kóros sejt halál [22], [31]. E proteázok megosztani több halálos kapcsolatos anyag, például kaszpáz magukat, citoszkeleton fehérjék, Bax, és Bid [42]. Calpain-mediált proteolízissel bevétel, korlátozott mértékben, de nem igényel külön aminosavat, mint hogy a kaszpáz. Bár mind a calpain és a kaszpáz javasoltak már fontos szerepet játszanak szabályozásában kóros sejt halál, a kölcsönhatások két család a proteázok patológiás körülmények között nem világos. A jelen vizsgálatban, akciós és farmakológiai inhibitorok megközelítések jelentősen hozzájárultak tudásunk kalpain biológia, különös tekintettel a sajátos funkciója apoptózis, ami lehetséges, hogy a kaszpáz 7 és 12 lefelé calpain közvetítésében honokiol indukált gyomorrák apoptózist. katalógusa

Természetes termék gyógyszerek már javasolta, hogy játszanak meghatározó szerepet gyógyszerészeti ellátás [43]. Természetes termékek az egyik fontos forrásai a potenciális rák kemoterápiás és kemopreventív szerek [43]. Honokiol már széles körben használják a hagyományos kínai és japán orvoslás több ezer éves, főleg, kezelésére anti-thrombocytic, antibakteriális, gyulladáscsökkentő és anxiolitikus hatásokat. Korábbi beszámolók azt mutatták, hogy honokiol is rendelkező erős anti-neoplasztikus és antiangiogén tulajdonságokat [6], [19], [38]. Azonban a pontos molekuláris mechanizmus a kiállított daganatellenes aktivitás által honokiol nem tisztázott. Így a tanulmány eredményei biztosítják bizonyítéka az anti-tumor aktivitásának honokiol a gyomorrák, és ami még fontosabb, a molekuláris alapját a hatását. Azt találtuk, hogy honokiol indukál aktiválását kalpain, GRP94 hasítás, és az apoptózis humán gyomorrák sejtek. Ezen kívül, a beadás után a honokiol csupasz szép beültetett MKN45 gyomor tumorsejteket mutatott szignifikáns tumor-ellenes aktivitást. Ez preklinikai vizsgálatok is keretként és ígéretes új, célzott megközelítés. Ezen túlmenően, a természetes vegyületek kimutatták, hogy összekapcsolják a hagyományos citotoxikus szerek lehetnek klinikai jótékony rákellenes gyógyszerek. Ez az előny, valamint a feltörekvő bizonyíték a tumorellenes mechanizmusok teszik honokiol folyamatban lévő klinikai alkalmazás, hogy egy hatékony és biztonságos tumorellenes szert. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Cells, tenyésztési körülmények és reagensek

Humán sejtvonalak, beleértve a kaukázusi gyomor rákos sejtvonalak (AGS, egy mérsékelten-rosszul differenciált adenocarcinoma sejtvonal, és N87, jól differenciált karcinóma sejtvonal) és ázsiai gyomor rákos sejtvonalat (MKN45 és SCM-1, a differenciálatlan adenokarcinóma sejtek) nyertünk sejtbank rákos központjában Taipei veteránok General Hospital (Tajvan). Sejteket tartottunk fenn RPMI 1640 közegben, amely 10% hővel inaktivált FCS-t (Life Technologies) és sztreptomicin /penicillinnel (Life Technologies), párásított 5% -os CO _{2 atmoszférában. Honokiol kaptuk a Wako Chemical Company (Japán), és tisztasága meghatároztuk, hogy egy legalább 99% -os HPLC.}

Western blot analízissel és immunprecipitációt

A teljes sejt lizátumokat állítottunk elő a korábban leírtak [44]. Fehérjéket elválasztottuk előregyártott 8-20% SDS-poliakrilamid gél elektroforézis, majd elektroforetikusan átvittük a gélből ra polivinilidén-difluorid membránokra. A blokkolás után a blotokat inkubáltuk, anti-GRP94, anti-GRP78, anti-kaszpáz 12, anti-kaszpáz 7, anti-PARP, anti-GADD153 (Santa Cruz Biotechnology), anti-kalpain-I (μ-calpain), anti-kalpain-II (m-kalpain) (santa Cruz Biotechnology), és anti-β aktin (Sigma) ellenanyagok, PBS-ben belül 0,1% Tween 20, 1 óra hosszat, majd három 10 perc mosással, PBS belül 0,1% Tween 20. A membránokat ezután inkubáltuk tormaperoxidázzal konjugált másodlagos antitestekkel 60 percig. Az immunprecipitáció, proteinek (500 g) inkubáltunk specifikus antitesteket és immobilizáljuk protein A-Sepharose gyöngyökkel. A gyöngyöket alaposan mostuk Bacco azon immunoprecipitative puffer, főtt, és mikrocentrifugáljuk. Bemeneti 10% sejtlizátumot az IP és 50 g fehérjéket analizáltunk Western-blottal. Detektálás végeztük Western-blot-reagenssel ECL (Amersham), és kemilumineszcencia volt téve a Kodak X-omat fóliák.

Calpain aktivitási vizsgálatok

Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC egy kalpain proteáz hordozó. Mennyiségi 7-amino-4-metil-kumarin (AMC) fluoreszcencia megengedi a monitorozása enzim hidrolízis a peptid-AMC konjugátum, és lehet használni mérésére enzim aktivitását. A sejteket készítünk és a kezelt 24 lyukú Corning /Costar lemezeken. Hozzáadása előtt inhibitorok sejteket feltöltjük 40 M Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (Biomol), és kezeltük honokiol a jelzett időzítés 37 ° C hőmérsékleten, párásított, 5% CO _{2 inkubátorban. Proteolízis a fluoreszcens próba követtük fluoreszcens lemez leolvasó rendszer (HTS-7000 Plus Series kiértékeléshez Perkin Elmer) szűrőbeállításoknak 360 ± 20 nm gerjesztési és 460 ± 20 nm-es emisszióval. Katalógusa}

siRNS és transzfekciós vizsgálatokban

az siRNS duplexek specifikus gátlása kalpain-I (μ-calpain) és kalpain-II (m-kalpain) kifejezések humán sejteket nyertünk a Santa Cruz Biotechnology: kalpain-I, katalógusszám . sc-29885, a medence 3 target specifikus 20-25 nt siRNS; calpain-II, katalógusszám. SC-41459, egy cél-specifikus 20-25 nt siRNS. A kontroll siRNS (katalógusszám. Sc-37007) egy nem-célzott 20-25 nt siRNS tervezett negatív kontrollként. Sőt, az siRNS duplexek specifikus gátlása GRP94 expresszió szintetizáljuk kereskedelmileg az MWG Biotech (Németország). A szensz (felső) és antiszensz (alsó) szekvenciáit GRP94 siRNS duplex a következők voltak: 5'-GAAGAAGCAUCUGAUUACCTT-3 '; 3'-TTCUUCUUCGUAGACUAAUGG-5 '. A nem-specifikus kontrollként egy NC-siRNS duplex véletlenszerű szekvenciákkal célja az volt, az alábbiak szerint: 5'-AGUUCAACGAGUAUCAGCATT-3 '; 3'-TTUCAAGUUGCUCAUAGUCGU-5 '. A siRNS-ek használták koncentrációban 100-200 nM tranziens transzfekcióját sejtek Lipofectin (Invitrogen) lyukanként egy 6 mérőhelyes lemez friss tápközeggel. 24 óra elteltével a kezdeti transzfekció és 24-36 óra kezelés, sejteket vagy sejtlizátumokat összegyűjtjük és elemezzük az apoptózis vagy fehérje expressziójával.

Immunfluoreszcens és Laser Scanning azonos fókusztávolságú mikroszkopikus

A sejteket kétszer mostuk PBS-sel, fix 4% -os paraformaldehiddel 30 percig, majd blokkoljuk 1% szarvasmarha szérum albumin PBS-ben. Primer antitestek jelzett alkalmazták a diákat hígításban 1:500 és inkubáltuk 4 ° C hőmérsékleten egy éjszakán. A mintákat kezeljük FITC-konjugált vagy TRITC-konjugált szekunder antitestekkel (Sigma). A FITC-vel jelölt, vagy TRITC-jelzett sejteket ezután analizáltuk fluoreszcens mikroszkópiával. A lézer Scan mikroszkópia, immunfluoreszcencia-jelölt sejteket analizáltuk egy invertált lézer pásztázó mikroszkóp (Zeiss LSM 410 invertcukrot, Németország), felszerelt mindkét argon-ion (488 nm) és HeNe (543 nm) lézerek. Kolokalizáció két jelölt antigének volt kimutatható, mint egy képet, ha a képeket mindkét csatornán lülrétegeztük. Konfokális képek voltak háttér-levonásra, és egyesült a konfokális Assistant szoftver, és feldolgozása Adobe Photoshop szoftverrel. Katalógusa

annexin-V FITC és PI kettős festés katalógusa

Az annexin V /propidium-jodid (BD Clontech) alkalmaztunk számszerűsíteni számok az apoptotikus sejtek a korábban leírtak szerint [44]. A sejteket kétszer mostuk PBS-sel, és megfestettük annexin V és a PI 20 percig, szobahőmérsékleten. A szint apoptózis mérésével határoztuk meg a sejtek fluoreszcenciáját áramlási citométerben (Becton Dickinson). Az adatgyűjtést és elemzést végeztünk a CellQuest programot (Becton Dickinson). Katalógusa

Állatok katalógusa

Állatkísérletek szerint végeztük az irányelvek által kiadott Bizottsága Állatkísérletek, Nemzeti Chung Hsing Egyetem, Tajcsung, Tajvan. Hím BALB /c csupasz egerekben ( nu /nu
) vásároltunk a NLAC Tajvan, Inc., Taipei, Taiwan. Az egereket tenyésztik és tartják fenn alatt specifikus patogénmentes körülmények között, feltéve, hogy sterilizált táplálékot és vizet ad libitum, és elhelyezve egy barrier helyiségben 12 óra világos /sötét ciklus. Kísérleti eljárások végeztünk 6 hetes egerekben. Az állatokat elaltattuk, amikor megjelentek haldokló.

tumornövekedési vizsgálatban

Cell tumorképző vizsgáltuk 6-hetes hím BALB /c csupasz egerekben. Röviden, 4 × 10 ^{6 sejtek (MKN45) exponenciális növekedési fázisban szuszpendálunk 1 ml táptalajban 10% magzati borjú szérumot. Egy egysejtű szuszpenziót MKN45 szubkután oltunk háti oldalán a egerekben. A tumorokat létre után 14 nappal MKN45 sejtek a beoltás és az ezt követő kezelés jármű, 0,5 és 1,5 mg /kg honokiol minden nap 10 nap (7 egér /csoport). A kötet a beültetett tumor háti oldalán egerek hetente kétszer mérjük tolómérővel, a következő képlet segítségével: V katalógusa = ( LW katalógusa 2) ¸ /6: ahol a V katalógusa kötete (mm 3); L katalógusa, legnagyobb átmérője (mm); W katalógusa, legkisebb átmérő (mm). Katalógusa}

Az immunhisztokémiai katalógusa

A kifejezés a GRP94 egér szilárd tumor vizsgáltuk immunhisztokémiai. Vékony tumor szakaszok (5 um) készítettünk, fix hideg acetonnal, blokkoltuk 3% -os hidrogén-peroxidáz, és megfestettük az elsődleges GRP94 antitesttel.

Statisztikai elemzések

A megadott értékek ebben a vizsgálatban bemutatása átlag ± SEM. Az összes elemzést végeztük varianciaanalízis, majd egy Fisher-féle legkisebb szignifikáns differencia tesztet. P katalógusa értéke kisebb, mint 0,05 volt tekinthető statisztikailag szignifikáns. Katalógusa

• PLoS One: Galectin-3 Megkönnyíti sejtmotilitással gyomorrákban által Up szabályozó proteáz-aktivált receptor-1 (PAR-1) és a Mátrix metalloproteináz-1 (MMP-1)
• PLoS One: Nagy mannóz-Binding vírusellenes lektin PFL Pseudomonas fluorescens Pf0-1 elősegítheti a sejt pusztulását Gyomorrák Cell MKN28 kölcsönhatás révén α2-Integrin