PLoS One: Galectin-3 Megkönnyíti sejtmotilitással gyomorrákban által Up szabályozó proteáz-aktivált receptor-1 (PAR-1) és a Mátrix metalloproteináz-1 (MMP-1)

absztrakt katalógusa

Háttér

Galectin-3 ismert, hogy szabályozza a rák metasztázis. Azonban a mechanizmus még nem határozták meg. Keresztül a DNS microarray tanulmányok után galektin-3-hangtompító, kimutattuk, hogy itt galektin-3 játszik kulcsfontosságú szerepet up-szabályozó kifejezések proteáz-aktivált receptor-1 (PAR-1) és mátrix metalloproteináz-1 (MMP-1) PAR-1, növelve ezáltal a gyomorrák metasztázist.

módszertan /fő eredményei

Megvizsgáltuk az expressziós szintek galektin-3, a PAR-1 és MMP-1 gyomorrák beteg szövetek és szintén hatásait hangtompító ezen fehérjék specifikus siRNS és a túl-expresszáló őket specifikus Lenti vírus-konstrukciókat. Azt is alkalmazhatók zebradánió embriók modell elemzésére in vivo katalógusa gyomorrák sejtek invázióját. Ezek a vizsgálatok kimutatták, hogy: a) a galektin-3 hangtompító csökkenti a kifejezés a PAR-1. b) galektin-3 túlzott expresszió növeli a sejtek migrációs és behatolás, és ez a növekedés visszafordítható a PAR-1 hangtompító, jelezve, hogy galektin-3 növeli a sejtek migrációs és behatolás keresztül PAR-1 up-szabályozás. c) Galektin-3 közvetlenül kölcsönhatásba az AP-1 transzkripciós faktor, és ez a komplex kötődik PAR-1 promoter és hajtások PAR-1 transzkripciós. d) galektin-3 is felerősíti foszfo-paxillin, egy PAR-1 downstream célpontja, növelve az MMP-1-expressziót. MMP-1 hangtompító blokkok foszfonotiolátok paxillin erősítés és sejtek invázióját okozta galectin-3 túlzott kifejeződése. e) a hangtompító sem galektin-3, PAR-1 vagy MMP-1 szignifikánsan csökkentette a sejtek migrációját a hajók zebradánió embrió modellben. f) A galektin-3, a PAR-1 és MMP-1 erősen expresszálódik és co-lokalizálódik rosszindulatú szövetek gyomor rákos betegeknél.

Következtetések /Jelentősége

Galectin-3 játszik a kulcs szerepe aktiváló sejtfelszíni receptor termelés révén proteáz és növeli a gyomorrák áttét. Galectin-3 potenciálisan módon hasznos farmakológiai célpontot megelőzésére gyomorrák metasztázist.

bevezető hivatkozás: Kim S-J, Shin J-Y, Lee K-D, Bae Y-K, Choi I-J, Park SH, et al. (2011) Galectin-3 Megkönnyíti sejtmozgás gyomorkarcinóma up-Szabályozó proteáz aktivált receptor-1 (PAR-1) és mátrix metalloproteináz-1 (MMP-1). PLoS ONE 6 (9): e25103. doi: 10,1371 /journal.pone.0025103 katalógusa

Szerkesztő: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique fonctionnelle de Lyon, Franciaország katalógusa

Beérkezett: 2011. május 18., Elfogadva: augusztus 23, 2011; Megjelent: szeptember 22, 2011 katalógusa

Copyright: © 2011 Kim et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a tanulmány támogatott National Cancer Center (NCC) a Koreai Köztársaság támogatás (NCC-0910150 és az NCC-0810060), Innovative Research Institute sejtterápia, Koreai Köztársaság (A062260) és ez a kutatás által támogatott Basic442 Science Research Program révén nemzeti Kutatási Alapítvány (NRF) finanszírozza az Oktatási Minisztérium, Tudományos és Technológiai (1031790-1), a Koreai Köztársaságban. A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a rák, hogy elterjedt (áttétet) a saját eredeti helyén egy másik területe a szervezet, az úgynevezett áttétes rák. áttétes daganatok rossz prognózist és a magas halálozási arány [1]. A teljes megértése a biológiai mechanizmus (ok), amelyek a metasztázis és racionális megközelítések megelőzésére illetve áttétek vezethet gyakorlati megközelítések javítása túlélési aránya szenvedő betegek metasztatikus rák. Korábbi vizsgálatokban azt találtuk, hogy galektin-3 növeli a gyomor rákos sejtek mozgékonyságát up-szabályozó fascin-1, egy aktin-kötegelésére citoszkeletális fehérje [2]. Galectin-3 egy 31 kDa-os szénhidrát-felismerés fehérje, részt vesz a tumorigenezis, a rákos sejtek növekedését és a metasztázist [3], [4], [5] és annak magas expressziós számos humán rákos úgy találtuk, hogy korrelálnak a rossz prognózisával áttétes rák. katalógusa

szerepének tisztázása galektin-3 rákos áttétek, mi letaglózott expressziója gyomorrákban sejtekben a siRNS és megvizsgálta az eredményt génexpresszió DNS microarray analízis [6]. Közül a korábbi eredményeket, azt találtuk, jelentős szintjének csökkentését proteáz-aktivált receptor-1 (PAR-1), tagja a család transzmembrán G-protein-kapcsolt receptorok, [7] és annak aktivátor, mátrix metalloproteáz-1 ( MMP-1) (ábra S1). Széthasított PAR-1 Auto-foszforilált és transzdukált extracelluláris jel (ek) a különböző utak, és kritikus szerepet játszik a tumor metasztázis [7], [8], [9]. Túlzott expressziója a PAR-1 számoltak be számos rákos megbetegedések, beleértve a melanomák, a mell és a gyomor rák. MMP-1 is fel-szabályozott sokféle előrehaladott rákok, és szignifikáns negatív korrelációt figyeltek meg között annak expresszióját és a betegek túlélését [10], [11], [12], [13]. Szintén számos tanulmány úgy találta, hogy az MMP-1 döntő szerepet játszik az áttétek emlőrák [14], a máj és vastagbélrák [15], és a gyomor rák [16], [17], többek között. Úgy tűnik, hogy ha egyszer szekretált MMP-1 elősegíti a ráksejtek invázióját keresztül lebomlását extracelluláris mátrixok és /vagy nyálkahártya alatti réteg nyirokerek [10], [14]. Számos tanulmány igazolta, hogy gátolja a MMP-k gátlásához vezet a sejtek invázióját [18], [19]. Katalógusa

hese felismerés vezetett bennünket, hogy feltételezzük, hogy a galektin-3, PAR-1 és MMP-1 lehet vonni fokozza a migrációs és behatolás a gyomorrák. A teszt ezt a hipotézist, elvégzett vizsgálatok a szerepük a gyomor rákos sejteket. Mindkét in vitro katalógusa és in vivo vizsgálatok katalógusa szoktuk zebradánió embriók modell meghatározására hatásukat a migrációval és invázió a rákos sejteket élő organellumokkal. Azt is megállapítottuk, az expressziós szintek galektin-3, a PAR-1 és MMP-1 malignus szöveteket a gyomor rákos betegek klinikai korrelációkat ezen proteinek emberi mintákban.

Eredmények

hangtompító galektin -3 vagy PAR-1 csökkenti a migrációs és behatolás humán gyomorrák sejtek

az expressziós szintjei galektin-3 és a PAR-1 magas volt a legtöbb gyomor rákos sejtvonalak. Mi elhallgattatta Galektin-3 és PAR-1 MKN-28 sejtek alkalmazásával a megfelelő siRNS. Kezelés galektin-3 siRNS csökkent expressziója szintje egyaránt galektin-3 és a PAR-1, míg a PAR-1 siRNS kezelés csökkentette csak PAR-1 expresszióját, míg nem volt különbség megfigyelhető galektin-3 (1a ábra). Transzfekciója SNU-638 sejtek, amelyek eredetileg nem mutatnak expressziós galektin-3, azzal galektin-3-kódoló plazmid eredményezett megnövekedett expressziója mindkét PAR-1 és galektin-3 (1b ábra). Hangtompító vagy galektin-3 vagy PAR-1 csökkentette a teljes számban vándorolnak ( p katalógusa < 0,001) (1C), és sejtek megtámadása ( p katalógusa < 0,001) (1D), csaknem a felére. Ezek az adatok azt mutatták, hogy galektin-3 fokozott PAR-1 expressziója és mindkét galektin-3 és a PAR-1 modulált gyomorrák sejt migrációt és inváziót.

Galectin-3 fokozza gyomorrák sejt migráció /invázió növelésével PAR-1 kifejezés

Megvizsgáltuk a kapcsolatát galektin-3-indukált növekedését a sejt migrációs és behatolás egyfelől és PAR-1-expressziót a másik kezét. Mi fertőzött SNU638 sejteket egy lentivírus, amely tartalmazza a galektin-3 expressziós kazettát, és megvizsgálták a megnyilvánulásai galektin-3 és a PAR-1, és a mért sejtek migrációját. Azt találtuk, hogy a túlzott expressziója galektin-3 kísérte fokozott PAR-1 mRNS és fehérje kifejezések (2A ábra), valamint a sejtmigrációt ( p
< 0,001) (2b ábra) és a sejtek invázióját ( p katalógusa < 0,001) tevékenység (2C ábra). Ezeket a növekedéseket csökkentette a PAR-1 hangtompító. Ezek az eredmények azt sugallták, hogy a galektin-3 elősegítette a migrációs és behatolás a gyomorrák-sejtek révén up-regulációját PAR-1.

Galectin-3 elősegíti PAR-1 transzkripciós kölcsönhatás révén az AP-1 komplex

ezután megpróbáltuk kideríteni, hogyan galectin-3 szabályozza PAR-1 expressziója. Mert azt jelentették, hogy az AP-1 transzkripciós aktivitását szabályozza galectin-3 [20], mi összpontosít a szerepe ennek a transzkripciós faktor ebben a tekintetben (2D ábra). Végeztünk immunprecipitációs tanulmányok és megállapítottuk, hogy galektin-3 közvetlenül kölcsönhatásba mindkét Fra-1 és a c-Jun, a AP-1 komplex, és hogy ez a kölcsönhatás társult up-regulációját az AP-1 transzkripciós aktivitását (ábra 2E). Ezután megvizsgáltuk a DNS-kötő aktivitást az AP-1 és anélkül galektin-3 Chip vizsgálatok (ábra 2F). Azt találtuk, hogy az AP-1 komplex kötődik az promotere PAR-1 jelenlétében galektin-3, de nem annak távollétében. Azt is értékelték a transzkripciós aktivitás az AP-1 által luciferáz assay transzfekció után egy riporter plazmidot tartalmazó AP-1-kötő szekvencia előtt egy luciferáz-vezetési minimális promoter LacZ vagy galektin-3 túlzott mértékben expresszáló SNU-638 sejteket ( p katalógusa < 0,001) (ábra 2G). A transzkripciós aktivitás az AP-1 szignifikánsan növelte a galektin-3 túlzott mértékben expresszáló sejtek, de nem a LacZ túlexpresszáló sejtekben. Ezek az eredmények azt sugallták, hogy a galektin-3 megkönnyítette a kötődését a PAR-1 promoter kölcsönhatásban AP-1 komplex, ezáltal növelve a PAR-1 expressziót transzkripciós szabályozás.

Galectin-3 növeli az MMP-1 és aktiválását a PAR-1 jelátviteli

MMP-1 leírták, hogy szabályozzák a PAR-1 aktiválás révén hasításával PAR-1 kikötve sejten belüli jelzéseket, és befolyásolják a sejtek invázióját [21]. Ábrán bemutatott S1, azt mutatta, hogy galektin-3 szabályozott MMP-1-expressziót. Ezért megerősítették az összefüggések a galektin-3, MMP-1 és PAR-1. Elemeztük a mRNS expressziós szinteket az MMP-9, ami egy downstream célpontja a PAR-1, [8] után hangtompító galektin-3, MMP-1 és a PAR-1 egyedileg (3A ábra). Míg a galektin-3 silencing csökkentett expresszióját mindhárom molekulák (MMP-1, a PAR-1 és MMP-9), az MMP-1 hangtompító csökkentett csak az MMP-9-expresszió és nem a galektin-3 vagy PAR-1. Érdekes, hogy a PAR-1 hangtompító ugyanazokat a hatásokat, mint az MMP-1 hangtompító. Azt is kimutatták a foszforilációja citoszkeleton fehérje paxillin (pY181) fémjelzi PAR-1 aktiváció [22], [23]. Miután hangtompító galektin-3, MMP-1 és a PAR-1 egyénileg, a phosphorylaion a paxillin csökkent, ami arra utalt, galektin-3 is szabályozza a PAR-1 aktivitását. Azt is ellenőriztük a csökkentés az MMP-9-aktivitás után hangtompító galektin-3, MMP-1 és a PAR-1 egyedileg (3A ábra).

Galectin-3 túlzott mértékben expresszáló SNU638 sejtek mutattak fokozott expressziós szintje az MMP -1 és PAR-1 fehérje, valamint azok mRNS-ek, továbbá a foszforilezett paxillin (pY181). Ezekben a sejtekben az MMP-1 hangtompító csökkentette a foszforilációja paxillin megváltoztatása nélkül a kifejezés a galektin-3 vagy PAR-1 (3B ábra). Sőt, az MMP-1 hangtompító csökkentett sejtek invázióját, amely által kiváltott galektin-3 túlzott expressziója ( p
< 0,001) (3C, ábra), amely azt jelenti, hogy galektin-3 fokozott MMP-1-expresszió vezető aktiválása PAR-1 jelátvitel.

túlzott expressziója MMP-1 a rákos sejtekben növeli a sejtek invázióját aktiválásán keresztül PAR-1 jelátviteli

megerősítette, hogy up-regulációját MMP-1 által galektin-3 fontos a aktiválását PAR-1 jelátvitel és a megnövekedett gyomor rákos sejtek invázióját. A lentivírus (pLECE3 Vector) tartalmazó MMP-1 expressziós kazetta által szabályozott CMV promoter készítettünk, és fertőződött AGS gyomorrák sejtek (ábra a 4A-B). Amint az várható volt, az MMP-1 túlzott expresszió fokozott invazivitású gyomorrák-sejtek, és a PAR-1 hangtompító szignifikánsan fordított ez az emelkedés ( p
< 0,001) (4b ábra). Ezt megerősítette az a tény, hogy a túlzott expressziója MMP-1 növelte a foszforiláció paxillin, és hogy további csendesítése PAR-1 blokkolt ilyen foszforiláció (4a ábra). Az MMP-1-t overexpresszáló sejtekben, galektin-3 silencing csökkentett expresszióját PAR-1, de nem az MMP-1, valamint a foszforiláció paxillin és a sejt invazív potenciál (ábra a 4A-B). Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a túlzott expressziója MMP-1 fokozott ráksejt invazivitás aktiválása által a PAR-1 jelátvitel. Megtett minden együtt, ezek az eredmények arra utaltak, hogy a galektin-3 fokozott expresszióját mind a PAR-1 és az MMP-1, és hogy a fokozott MMP-1 expresszió aktivált PAR-1 jelátvitel, ami viszont, megkönnyítette a ráksejtek terjedését. Ezek az események vázlatosan ábrázolt 4C. Katalógusa

elhallgattatása galecin-3, PAR-1 vagy MMP-1 blokk gyomorrák sejtek migrációját in vivo katalógusa a zebradánió modell katalógusa

transzgenikus zebradánió, Tg (kdrl: EGFP) ^{s843 katalógusa [24], expressz EGFP kifejezetten a saját érrendszerben. A megfelelő zebrahal embriók átlátszóak, zöld fluoreszcens hajó. Mi alkalmazott ezek a halak, hogy végezzen in vivo vizsgálatok katalógusa humán gyomorrák sejtek migrációját (5A ábra). Amikor a piros fluoreszkáló AGS sejteket fecskendeznek a szikzacskója a zebradánió embriók 48 HPF (órával a megtermékenyítés), a legtöbb transzplantált AGS sejteket központjában található a szikzacskója embriók 4 órával a transzplantációt ( HPT). Miután 26 HPT, mind az általános és scRNA transzfektált sejtek bevándoroltak törzsön régióban, és tartózkodott a hajó törzse és /vagy farok az embriók 50 Hpt. Azonban, a szám a migrált AGS sejtek, amelyben minden egyes galektin-3, a PAR-1 vagy MMP-1 vannak némítva, jelentősen csökkent (5B, ábra). Mi is megszámoltuk a zebrahal embriók, amelyek megjelenítik vándorló sejtek és az eredményeket mutatjuk be (ábra S2). Nyolcvan 4-93 százaléka zebradánió embriók ültettük kontroll sejtek vagy scRNA kezelt sejtek jelennek meg a sejtek vándorlását a törzs és a farok hajók 50 Hpt. Azonban csak 7-11% embriónak transzplantáltunk sejtek, amelyekben galektin-3, a PAR-1 vagy MMP-1 elnémultak, megjelenített vándorló sejtek. Ezek az eredmények azt javasolta, hogy az első, a zebrahal embrió modellben lehet használni, hogy figyelemmel kíséri a migrációs gyomorrák-sejtek, mint egy élő állat, és a második, hogy hangtompító mindegyikének galektin-3, a PAR-1 és MMP-1-okozta jelentős csökkenését gyomorrák sejtek migrációját in vivo katalógusa.}

kifejezések galektin-3, PAR-1 és MMP-1 emelkedett, ezzel párhuzamosan, a rosszindulatú szöveteiben gyomorrákos betegek katalógusa

Meghatároztuk a mRNS és fehérje expressziós szintjeit galektin-3, a PAR-1 és MMP-1 normál és malignus szövetekben 20 gyomorrákos betegek, majd alkalmazott RT-PCR-rel egy kép J oldalon. Ábrán látható az 5C ábra és S3, 73,7% a rákos betegek azt mutatta, magasabb expressziós szinteket galektin-3 és 70% -uk azt mutatták, magasabb PAR-1 és MMP-1 szintje a rosszindulatú szövetekben, mint a normális társaik. Ráadásul között galectin-3 pozitív betegek 71,4% -a is PAR-1 pozitív, míg 64,3% -a is az MMP-1-pozitív (5D ábra). Ezek az adatok azt mutatták, hogy létezik egy párhuzamos növekedése expressziójának galektin-3, valamint a PAR-1 és az MMP-1, a malignus gyomor szövetekben. Azt is tapasztaltuk, hogy ezek a fehérjék együtt lokalizálódik a rosszindulatú területeken a szövetek, és nem a nem-malignus területeken (5C). Galectin-3 jelen volt mind a citoszolban és a sejtmagban, míg a PAR-1 és az MMP-1 volt látható általában a citoszolban és a membrán az ugyanazon a területen (5C). Ezek az eredmények azt javasolta, hogy mindkét PAR-1 és MMP-1 kifejezést szignifikánsan korrelált galctin-3 expresszióját gyomorrákos betegek. Katalógusa

Vita katalógusa

A vizsgálat azt igazolta, hogy a galektin-3 fokozott gyomorrák sejtek migrációját és inváziót. Mechanikusan, ez kapcsolódik galektin-3 up-regulációját PAR-1 sejtfelületi receptorhoz, és az aktivitást az MMP-1-proteáz. Ez összhangban van azzal JELENTÉSEKBŐL korrelációt expressziója PAR-1 és a tumor invázió és metasztázis a gyomor és számos egyéb rákok [25], [26], [27]. Ez a tanulmány az első, hogy igazolják a közvetlen kölcsönhatása galektin-3 és az AP-1 komplex alkatrészek, a c-Jun és Fra-1, és szabályozása a PAR-1 expressziót az AP-1 transzkripciós faktor. Mivel azt már kimutatták, mások által, hogy a túlzott expressziója a Fra-1 elősegíti a ráksejtek terjedését és áttétét [28], up-regulációját PAR-1, C-Jun és a Fra-1 úgy tűnt, hogy egy lehetséges mechanizmus magyarázza a kapcsolat galektin-3 által indukált up-regulációja a PAR-1 sejtfelületi receptorhoz, és az aktivitást az MMP-1-proteáz. Ezt a lehetőséget támasztja alá a megállapítást a párhuzamos és a társ-lokalizált megnyilvánulásai galektin-3 és a PAR-1 malignus szövetekben gyomorrák betegeknél.

Ez egy olyan újszerű megfigyelés, hogy galektin-3 növeli az MMP-1-expresszió . Nyilvánvaló, hogy a túlzott expressziója MMP-1 növelheti gyomor rákos sejtek invázióját aktivitás gátlásával a sejt-sejt és sejt-mátrix kölcsönhatásokat ECM által lebomlását. Ezért, a növekedés a MMP-1-expresszió által támogatott galektin-3 esetleg kettős hatással, nevezetesen, a PAR-1 aktiválás és az ECM lebomlása, és mindkettő kritikus gyomorrák metasztázis. Azonban, hogyan galektin-3 szabályozza az MMP-1-expresszió még mindig nem tisztázott, mert a kifejezés a MMP-1 szabályozza egy sor összetett események, beleértve közötti áthallás számos transzkripciós faktorok, mint például a AP-1, a jel átalakító és aktivátor transzkripció-3, MAP kináz, és hipoxia-indukálható faktor-1 hypoxia [29], [30], [31]. katalógusa

létrehozó zebradánió ( Danio rerio katalógusa) embrió modell tanulmányozza a migrációs és behatolás gyomorrák sejtek egy különleges teljesítmény a jelen tanulmány, mert alkalmas állati modellek nem voltak elérhetők a tanuló emberi gyomorrák áttét mostanáig. A zebrahal modell tanulmányozására genetikailag rákok és /vagy xenograftok, számos előnye van, beleértve a megvalósíthatósági forward és reverz genetikai vizsgálatok, az átláthatóság az embriók [32], és alkalmasságát GFP címkézésére hajók [32], [33], [34]. Ez a tanulmány kimutatta, hogy a RFP jelzett gyomorrák sejtek megtámadta véredények míg galektin-3, MMP-1 vagy a PAR-1 hangtompítós gyomorrák-sejtek nem. Így a zebrahal embrió tűnik ígéretes modell tanulmányozása invázió és metasztázis a rákos sejtek, bár további vizsgálatok egyértelműen szükség van, hogy erősítse meg ezt a megállapítást. Katalógusa

Végeredményben a vizsgálatok kimutatták, hogy galectin-3 gyorsított gyomorrák sejtmozgás up-szabályozó a PAR-1 és az MMP-1. További vizsgálatok egyértelműen megállapításához szükséges szerepét Galektin-3 rákos áttétek és alkalmasságát, mint terápiás célpont a kiválasztott rák. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

A szöveteket katalógusa

párok 2 mm-es méretű biopsziás mintákat vettünk gyomor adenokarcinóma szöveteiben 20 átesett betegek diagnosztikus endoszkópia endoszkópos nyálkahártya alatti boncolás, a National Cancer center Koreában megszerzése után írásos tájékozott beleegyezését adta. A szöveti mintákat folyékony nitrogénben lefagyasztottuk -70 ° C-on után azonnal biopszia a felhasználásig. Néhány a szöveti mintákat paraffindized immunhisztokémiai vizsgálatok, szükség szerint. Ezek a tanulmányok hagyta jóvá az intézményi Review Board of National Cancer Center (# NCCNSH 03-024). Katalógusa

Cell Culture és siRNS transzfekcióját katalógusa

Közepesen differenciált emberi gyomor adenokarcinóma sejtvonalak, AGS, MKN- 28. és SNU-638 kaptuk a Korea sejtvonal Bank és fenntartani a korábban leírtak szerint [35]. siRNS használt transzfekció, mind által biztosított Invitrogen (Carlsbad, CA). A szekvenciák galektin-3 (LGAL3) siRNS; 5'-AUAUGAAGCACUGGUGAGGUCUAUG-3 ', a PAR-1 siRNS; 5'-CCCAUCUGUGUACACCGGAGUGUUU-3 ', és az MMP-1 siRNS; 5'-GGAGAAAUAGUGGCCCAGUGGUUGA-3 '. Transzfekciókat végeztünk Lipofectamine RNAiMAX reagens (Invitrogen), a gyártó utasításai szerint. Indukciója tranziens galektin-3 overexpresszió SNU-638 sejtek alkalmazásával értük el pcDNA3.1 /NT-galektin-3 pcDNA3.1 /NT-GFP-t. A normalizálás kontroll kezelés, a gyomor rákos sejtvonalak kezeltük 1 ug által LTX reagensek (Invitrogen).

RNS izolálás és RT-PCR analízis

Teljes RNS-t izoláltunk humán gyomorrák sejtek és a beteg szövetminták, TRIzol reagens (Invitrogen) a gyártó utasításai szerint. A reverz transzkriptáz PCR-t reverz transzkripciós rendszerrel (Promega Corp. USA), a gyártó utasításai szerint. A primereket használtuk: 5'-ATGGCAGACAATTTTTCGCTCC-3 '(szensz), és 5'-ATGTCACCAGAAATTCCCAGTT-3' (antiszensz) a humán LGAL3 (galektin-3) gén; 5'-CCAAAACTGAGCATAAGTCC-3 '(szensz), és 5'-AGGATGGAGCAAATGTAGTG-3' (antiszensz) a humán F2R (PAR-1) gén; 5'-ACAGCTTCCCAGCGACTCTA-3 '(szensz), és 5'-CAGGGTTTCAGCATCTGGTT-3' (antiszensz) a humán MMP-1 gén; 5'-CTCGAACTTTGACAGCGACA-3 '(szensz), és 5'-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3' (antiszensz) a humán MMP-9-gén; 5'-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3 '(szensz), és 5'-CTGGTGCCTGGGGCG-3' (antiszensz) a humán β-aktin gén; 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 '(szensz), és 5'-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3' (antiszensz) a humán glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz (GAPDH). PCR-t végeztünk egy 20 ul térfogatban hajtjuk Ex Taq (Takara). Az amplifikációs ciklus (denaturáció 95 ° C-on 1 percig, lágyítás 60 ° C-on 1 percig és extenzió 72 ° C-on 2 perc) megismételtük 32-szer, majd végső extenziós 10 percig 72 ° C-on.

építése galektin-3 expresszáló Lenti vírus-vektor és a fertőzés

a teljes hosszúságú humán galektin-3 expresszáló konstrukció pcDNA3.1-NT-GFP-gal3, a pcDNA3.1-NT-GFP vektorba, és a Lenti-virális vektor a túlzott Express LacZ, galektin-3 (1-250) a pLL3.7 a korábban leírt [2]. Humán F2R beklónoztuk pLECE3 a BamH1 és Not1 restrikciós enzim helyek, ami a pLECE3-F2R (PAR-1) konstrukció. A teljes hosszúságú cDNS-ek F2R, MMP-1, és a kontroll mRFP alkalmaztunk a PCR-amplifikáció, valamint a primerek felsorolt ​​adatok S1, és kapott PCR-fragmenseket klónozzuk pLECE3 vektor felhasználásával PAC1 és Hpa1 restrikciós enzim helyek, ami a pLECE3 -MMP-1 konstrukció. Továbbá, a mRFP helyén a pGEM-T-Easy vektorba vittük át a pLL3.7 vektor helyett a GFP régió felhasználásával Age1 és EcoR1 restrikciós enzim helyek, hogy pLL3.7-mRFP. Lenti-virális vektor termelés már korábban leírt [2].

Western-blot-analízis

Cell lizátum extrakciót készült RIPA-pufferben (1% NP-40; 0,1% nátrium-dodecil-szulfát; 0,5 % dezoxikolát; 150 mM NaCl; 50 mM Tris, pH = 7,5) és a proteáz inhibiter koktél. 20 ug teljes fehérje egyes lizátumot megoldani 8-12% SDS-PAGE-gélek és elektro-PVDF membránra, majd blokkoltuk 5% lefölözött tejet és 0,05% Tween-20, 1 × PBS-sel (PBST). Poliklonális primer antitesteket, az anti-Galectin-3, anti-ThrombinR (PAR-1), anti-c-Jun, anti-FRA-1 és anti-β-aktin (Santa Cruz), anti-MMP1 (Calbiochem), anti paxillin és anti-foszfo paxillin (pY181) (Epitomics) inkubáltunk blotok a 1:1000 hígítás minimális térfogatú 5% -os BSA-t (Bovine Serum albumin) PBST pufferben 1 órán szobahőmérsékleten vagy egy éjszakán át 4 ° C hőmérsékleten. Anti-egér vagy anti-nyúl kecske-HRP-konjugált másodlagos antitestekkel (GE Healthcare UK Limited) inkubáltuk, 1:5000 hígítás 5% BSA-t PBST pufferben 1,5 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Proteinek detektáltuk fokozott kemilumineszcencia (ECL) (Amersham Corp., Arlington Heights, IL, USA).

Immunprecipitáció

Cell lizátum extraktumokat készítettünk az IP + puffer (20 mM Hepes, 1 % Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA-t, 100 mM NaF, 10 mM nátrium-pirofoszfát, 1 mM nátrium-ortovanadát, 0,2 mM PMSF, 10 ng /ml proteáz inhibitor koktél) jégen 30 perc alatt. Miután törmelék eltávolítása centrifugálással (13200 rpm, 4 ° C-on 20 perc), a felülúszót vetjük alá preclearing lépést protein A /G Agarose gyöngyöket 4 ° C-on 30 percig forgató. A felülúszókat után kapott egy rövid centrifugálással (2000 rpm, 4 ° C-on 4 perc) vetettük alá immunprecipitációnak egy anti-galectin3 és normál egér IgG-t (negatív kontroll). Immunprecipitátumokat kétszer mostuk IP pufferrel (20 mM Hepes, 1% Triton X-100, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA-t, 100 mM NaF, 10 mM nátrium-pirofoszfát). Miután 30 ul 2 × SDS-minta pufferrel túlmenően, majd forrásban lévő 95 ° C-on 5 percig. Miután felülúszókat után kapott egy rövid centrifugálással, a fehérje expressziós szintjeit meghatároztuk keresztül végzett Western-blot.

Immunhisztokémia

galektin-3 és a PAR-1 immunhisztokémiai, paraffint gyomorrákos betegek szöveti metszetek maradt a mikrohullámú 15 percig citrát-pufferben (Vector Laboratories), majd inkubáltuk 3% H _{2 O 2-on 15 percig, hogy blokkolja az endogén peroxidáz, majd inkubáltuk 10% -os normál kecske szérummal (Vector Laboratories) 1 × PBS-ben 10 percig. Elsődleges antitestet használtunk egy anti-galektin-3 (1:200) anti-MMP1 (Epitomics) és anti-PAR-1 (1:200) antitestek (Santa Cruz), és a következő lépésben végeztük utasításai szerint Vectastain®ABC készlet (Vector Laboratories). A termékeket tettük láthatóvá diaminobenzidin (DAB) készletek (Vector Laboratories).}

Zselatin zimográfia

A kondicionált tápközeget nyertünk kultúrák MKN-28 gyomor rákos sejtvonal és bepároljuk Vivaspin 6 (Sartorius ). A koncentrált felülúszók 6 × Foz pufferban szeparáltuk 10% -os SDS-gélen, amely 1 mg /ml zselatin. Mindegyik inkubáljuk 100 ml zimográfia restrikciós puffer és festettük Bio-Safe ™ Coomassie G-250 (Bio-Rad Laboratories). Miután folteltávolító, éles átlátszó sáv jelzi zselatinolitikus aktivitás láthatóvá kék alapon. Katalógusa

Transfilter migrációs és behatolás vizsgálatokban katalógusa

A transfilter migráció és inváziós vizsgálati használtuk MKN-28 és SNU-638 sejtekben. A sejteket transzfektáltuk siRNS 1 napig, izolált és hozzáadjuk felső kamrái pórus lapkák Transwell kollagén típusú L (BD Bioscience) bevont szűrőket migrációs assay, és Matrigel (BD Bioscience) bevonatú szűrők, az inváziós vizsgálati eljárást. RPMI 1640, 10% FBS-t és 1% antibiotikumot (Gibco) adunk hozzá, az alsó kamrába majd inkubáltuk 20 órán át. Átállítása és betörő sejteket mennyiségileg után H &E festés. Mindegyik kísérletet három párhuzamosban hajtjuk végre, és az adatok átlag értékeket.

A kromatin immunprecipitációs vizsgálatok

A kromatin immunprecipitáció (chip) vizsgálatokat végeztünk egy chipet assay kit (Millipore). Mintákat vittük tányérokon után galektin-3 siRNS kezelés és a vizsgálatokat végzünk a gyártó utasításai szerint. Anti-Galectin-3, anti-c-Jun, anti-FRA-1 és a normál egér /nyúl IgG-t használni, hogy immunprecipitál tartalmazó DNS-komplexek. Mielőtt a PCR-primereket állítottuk elő az AP-1 PAR-1 promoter kötőhelyek -666 (5'-CACTGT CGACGTCTCCACAT-3 ') és a PAR-1 promoter helyén -307 (5'-GGGCCTAGAAGTCCAA ATGA-3'). A PCR-t egy ExTaq (Takara). Katalógusa

A luciferáz vizsgálatokat katalógusa

Egy AP-1 luciferáz riporter plazmidot Dr. Sung-Pil Yoon a Nemzeti Rákkutató központ Koreában és tanulmányok hatásainak galektin-3 AP-1 transzkripciós aktivitást lacZ és galectin-3 túlexpresszáló sejteket megfelelően elvégzett korábbi jelentés [2]. 48 óra elteltével a sejteket összegyűjtöttük, és a luciferáz aktivitást mértük Luciferase Assay System (Promega), a gyártó utasításai szerint. Mindegyik kísérletet háromszor végeztünk el, és az adatok átlag értékeket. Katalógusa

Cell migrációs assay segítségével zebrahal modell katalógusa

A transzgenikus zebradánió vonal Tg (kdrl: EGFP) ^{s843 katalógusa [24], amelyben EGFP kifejezetten kifejezve az érrendszerben, tartottuk összhangban elfogadott szabványos működési eljárások [36] által jóváhagyott intézményi Animal Care and Use bizottság National Cancer Center Koreában; engedély száma: NCC 11-116. Kaptunk zebra hal embriói nemzeti rákközpontba zebradánió aqua-szoba. Rák sejt transzplantáció szerint végeztük Nicoli és munkatársai [37], kisebb módosításokkal. Röviden, dechorionated embriókat elaltattuk tricaine (Sigma) és a rákos sejteket injektáltunk (150-200 per embrió) a központok embrionális tojássárgája zsákokkal 48 HPF (órával megtermékenyítés) egy mikromanipulátor (Narishige), és egy pneumatikus Picopump (WPI ) ellátott boroszilikát üvegből tűt. Az embriókat fenn a transzplantáció utáni eljárásokat és vizsgáltuk a vándorló rákos sejtek fluoreszcens mikroszkóp. For Imaging, embriók és lárvák kezeltük N-fenil-karbamid (Sigma) 12 HPF, hogy megakadályozzák pigmentáció és vizsgálták fluoreszcens invertált mikroszkóp (Carl Zeiss) alatt epifluoreszcens optikával. Fluoreszkáló képek fogták CCD kamerával (Carl Zeiss). Stabil fluoreszkáló gyomor sejtvonalak AGS (mRFP) állítottunk elő Lenti-vírus fertőzés pLL3.7-mRFP majd FACS-válogatással. Katalógusa}

A microarray adatok elemzése katalógusa

A microarray végeztük AGS, gyomorrák sejtvonal után hangtompító galektin-3 korábban leírtak [6]. Microarray eredményeket feltölteni GEO (GSE29630). Katalógusa

Statisztikai elemzés katalógusa

Az adatokat átlag ± SD legalább 5-10 származó képek három független kísérlet segítségével mikroszkóp (× 100, × 200), kivéve, ha másként nem jelezzük. A statisztikai analízist egyutas ANOVA teszt Prism szoftverrel. Az adatokat tekintettük szignifikánsnak, ha a p katalógusa < 0,05. Katalógusa

alátámasztó információk
ábra S1.
Silenced Galektin-3 siRNS gyomor rákos sejtek változásokat eredményezett a sejtek mozgékonyságát kapcsolatos génexpressziós. A, közül DNS microarray, úgy döntöttünk, sejtmozgás kapcsolódó gén MMP-1, MMP-3, FSCN1 (fascin-1), F2R (PAR-1), TIMP-2, SERPINE1 (PAI-1), és megmutatta szeres változási arány . B, kimutatása mRNS expressziója az MMP-1, MMP-3, FSCN1 (fascin-1), F2R (PAR-1), TIMP-2, SERPINE1 (PAI-1) segítségével PCR-rel. β-aktin használtunk normalizáció kontroll. katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0025103.s001 katalógusa (TIF) hotelben ábra S2.
száma zebrahal embriók vándorolt ​​sejtek aránya. Kimutatása gyomorrák sejt AGS (RFP) számok után átültetett AGS (RFP) zebradánió halembriókon a kezelés specifikus siRNS (galektin-3, MMP-1 és PAR-1) a negatív kontroll scRNA (5A ábra-B). Megmutatta száma vándorolt ​​sejt per embyos megszámoltuk, és kimutatták, százalékos. Katalógusa doi: 10,1371 /journal.pone.0025103.s002 katalógusa (TIF) hotelben ábra S3.
RT-PCR analízise mRNS szintje a galektin-3, MMP-1 és PAR-1 gyomor rákos betegeknél.

• PLoS One: A tumor-Log Odds pozitív nyirokcsomók-metasztázis stádium rendszerben egy ígéretes új átmeneti rendszer gyomorrák után D2 resectio Kínában
• PLoS One: Honokiol indukál Calpain glükózfelhasználással szabályozott fehérje-94 hasítása és apoptózis humán gyomorkarcinóma sejtek és csökkenti a tumor növekedés